Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2010/2011. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2010/2011 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 4ª AULA PRÁTICA Determinação da concentração plasmática de creatinina (creatininémia) e ureia (urémia). Importância clínica. 1

2 CREATININÉMIA A creatinina é um catabolito do metabolismo muscular da creatina-fosfato. A creatina encontra-se presente no músculo, cérebro e sangue, na forma livre e na forma de fosfocreatina. Pode também ser encontrada na urina em baixa concentração. A creatinina é o anidrido da creatina e é formada, em grande parte, no músculo, a partir da creatina-fosfato, por desidratação e ciclização, numa reacção não enzimática, irreversível. Na síntese da creatinina (Fig.1) intervêm directamente três aminoácidos: glicina, arginina e metionina. A primeira reacção é de transaminação a partir da arginina para a glicina, formando o ácido guanidoacético (glicociamina), processo que ocorre no rim. No fígado é completada a síntese da creatina por metilação do ácido guanidoacético, sendo a metionina o dador de grupos metilo. Síntese (fígado e pâncreas) Glicina Arginina AGAT Ornitina Guanidoacetato (GAA) S-adenosil-metionina GAMT S-adenosil-homocisteína Captação (cérebro, músculo) Excreção Transportador (urina) 1,5% Cr corporal/dia creatina creatina ATP ADP creatina~p CK creatinina Figura 1- Síntese de creatina e creatinina [AGAT: arginina:glicina amidinotransferase; GAMT: guanidinoacetato: metiltransferase; CK: creatina cinase]. 2

3 A creatinina é eliminada preferencialmente por filtração glomerular, sendo apenas uma pequena parte eliminada por secreção tubular. Na prática considera-se que não é reabsorvida nem secretada a nível tubular. Os seus níveis dependem da massa muscular do indivíduo, não sendo, ao contrário da urémia, directamente influenciados pelo teor de proteínas provenientes da dieta. A creatinina é assim um bom parâmetro de avaliação da função glomerular renal, de grande aplicação clínica. A elevação da creatininémia é sinal de insuficiência glomerular renal. A insuficiência renal pode ter 3 grupos de causas: a) pré-renal (ex: choque por hemorragia ou desidratação grave) b) renal (ex: doença parenquimatosa renal, como glomerulonefrite) c) pós-renal (ex: obstrução urinária por cálculos ou tumores). Na ausência de insuficiência glomerular renal não há, habitualmente, elevação anormal da creatinina, mesmo em caso de destruição muscular. O doseamento da creatinina sérica é um teste bioquímico simples para avaliação da taxa de filtração glomerular. Os valores normais de creatinina sérica variam com a idade (são mais baixos na criança) e situam-se no adulto entre 0,6-1,1 mg/ 100 ml. São de um modo geral mais elevados no homem (sexo masculino: 0,6-1,1 mg/ dl; sexo feminino: 0,5-0,9 mg/ dl) e nos indivíduos musculados. Outro parâmetro, menos utilizado porque implica a colheita de urina de 24 h, é o da depuração (clearance) da creatinina. Este valor mede o volume de filtrado glomerular ( urina primitiva ) formado por segundo (o valor normal é de ± 2 ml/s por 1,73 m 2 de superfície corporal, ou de 120 ml/minuto no adulto): Clearance da creatinina (ml/min) = mg creatinina/dl urina x ml urina 24 horas mg creatinina/dl soro x 1440 Sendo a eliminação da creatinina endógena um parâmetro constante, a sua depuração é usada como medida da taxa de filtração glomerular. Existe uma correlação suficientemente válida entre a depuração e a concentração de creatinina no soro, sendo este parâmetro largamente utilizado na clínica para avaliar o grau de insuficiência glomerular. 3

4 Doseamento da creatinina plasmática: Fundamento do método: A creatinina sérica pode dosear-se pelo método colorimétrico de Jaffé, em meio alcalino, após desproteinização plasmática. A creatinina em solução alcalina reage com picrato, formando um complexo corado, detectado por espectrofotometria a 520 nm. A concentração do composto formado é proporcional à concentração da creatinina da amostra. 4

5 URÉMIA De um modo geral, podemos afirmar que os aminoácidos se degradam pela remoção do grupo α-aminado e pela conversão da cadeia carbonada num composto intermediário do metabolismo dos glúcidos e/ou dos lípidos. A amónia que se origina a partir dos grupos amina dos aminoácidos pode: - Ser utilizada na síntese de compostos nitrogenados - Ser transformada em ureia, composto não tóxico, eliminado pelo rim - Ser excretada na urina (cheiro amoniacal), sob a forma de sais de amónia. O principal mecanismo de síntese é através da formação de glutamina, numa reacção catalizada pela glutamina sintetase. A maior parte da amónia não utilizada na síntese da glutamina e do ácido glutâmico é eliminada por via urinária, sob a forma de ureia. A ureia é a carbodiamida: NH 2 -CO-NH 2 (os grupos NH 2 são provenientes da amónia e do aspartato). A ureia é filtrada no glomérulo e reabsorvida no túbulo por transporte passivo, ocorrendo maior reabsorção a taxas de fluxo urinário mais baixo. A principal causa de aumento da urémia é a insuficiência renal (diminuição da excreção). Os níveis de ureia plasmática podem ser usados como índice da função renal, embora a creatinina seja um indicador mais preciso da função renal glomerular (ver adiante). Um regime alimentar rico em proteínas e/ou um aumento do catabolismo das proteínas corporais (febre, infecções, jejum prolongado) pode aumentar os níveis de ureia sanguínea, sem os elevar acima de valores normais, desde que o rim esteja a funcionar normalmente. Pelo contrário, verifica-se diminuição dos níveis de ureia plasmática nos défices do ciclo da ureia (défice de síntese, frequentemente secundários a lesão hepática) ou devido a dieta normocalórica e pobre em proteínas. Na insuficiência renal glomerular, a dieta hipoproteica faz parte das abordagens terapêuticas usuais. Doseamento da ureia no plasma - Urémia Fundamento do método: A urease transforma a ureia em amoníaco e CO 2, segundo a reacção: Urease NH 2 -CO-NH 2 + H 2 O 2 NH 3 + CO 2 (ureia) 2 NH 3 + CO 2 + H 2 O 2 NH CO 3 5

6 Os iões amónio reagem com o salicilato e o hipoclorito em meio alcalino, formando um derivado do tipo indofenol de côr verde, cujo máximo de absorção ocorre a 600 nm, permitindo a sua quantificação por espectrofotometria (MÉTODO DE UREASE- BERTHELOT MODIFICADO). Existe um outro método, que também permite a quantificação da ureia, em que os iões amónio reagem com o α-cetoglutarato para formar glutamato por acção da enzima glutamato desidrogenase, em presença de NADH: Glutamato desidrogenase 2 NH α-cetoglutarato + 2 NADH 2 glutamato + 2 H 2 O + 2 NAD + A diminuição da concentração do NADH devida ao seu consumo na reacção, avaliada pela variação da DO a 340 nm (pico máximo de absorção do NADH), é proporcional à concentração de ureia na amostra. Valores normais: 0,15-0,45 g/l ou 2,5-7,5 mm. Por vezes, na prática clínica, os resultados dos níveis plasmáticos de ureia são fornecidos em termos de azoto ureico (BUN= Blood Ureia Nitrogen). A relação entre a urémia e o azoto ureico é dada pela relação entre os respectivos pesos moleculares. 6

7 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II, Mestrado Integrado em MEDICINA, 2010/2011 PROTOCOLO DE BANCADA - 4ª AULA PRÁTICA Grupos 1 e 2 Determinação da creatininémia: 1. Doseamento, segundo a tabela: Padrão Amostra Água destilada - - CAL (Padrão) 0,1 ml - Amostra - 0,1 ml Solução de trabalho 1,0 ml 1,0 ml D.O. 1 (492 nm) D.O. 2 (492 nm) λ D.O. (D.O. 2 D.O. 1 ) CAL (Padrão) - padrão de creatinina 177 µm ou 2 mg/ dl Reagente R1a - ácido pícrico 35 mm Reagente R1b - NaOH 1,6 M Solução de trabalho - Reagente R1a + Reagente R1b (1:1) Estável só por 3 dias. - Agitar e após 30 segundos registar a D.O. (D.O. 1 ). - Esperar exactamente 2 minutos e fazer nova leitura (D.O. 2 ) A taxa da creatininémia obtém-se dividindo a densidade óptica da amostra pela densidade óptica do tubo padrão, valor este multiplicado pela concentração do padrão. (D.O. 2 D.O. 1 ) amostra (D.O. 2 D.O. 1 ) amostra x 177= [creatinina] ou x 2 = [creatinina] (D.O. 2 D.O. 1 ) padrão (µm) (D.O. 2 D.O. 1 ) padrão (mg/ dl) VALORES NORMAIS: Homens: µm ou 0,6-1,1 mg/dl Mulheres: µm ou 0,5-0,9 mg/dl 1

8 Grupos 3 e 4 Determinação da urémia: MÉTODO DA UREASE - REACÇÃO DE BERTHELOT MODIFICADA CAL ( Padrão) - Padrão de ureia 8,33 mm ou 50 mg/dl Reagente 1a - Urease ( 5000 U/ l) Reagente 1b - tampão fosfato 120 mm, ph 7,0 salicilato de sódio 63,4 mm nitroprussiato de sódio 5,0 mm EDTA 1,5 mm Reagente 2 - Hipoclorito de sódio 18,0 mm Hidróxido de sódio 750 mm Solução de trabalho - Reagente 1a + Reagente 1b (juntar a totalidade dos 2 reagentes) estável durante 1 mês a 2-8 ºC, protegido da luz. 1. Preparar os tubos da amostra, branco e padrão Amostra Branco Padrão CAL (Padrão) µl Amostra - Soro 10 µl - - Solução de trabalho (R1a + R1b) 1 ml 1 ml 1 ml Misturar e incubar protegendo da luz a 37º C durante 3 minutos ou 5 minutos a 20-25ºC Reagente µl 200 µl 200 µl Misturar e incubar protegendo da luz a 37º C durante 5 minutos ou 10 minutos a 20-25ºC D.O. (600 nm) 0 2. Ler a D.O. dos tubos padrão e amostra a λ = 600 nm, depois de calibrar o aparelho com o tubo branco (zero de absorvância). A cor é estável durante 2 horas quando protegido da luz. A taxa da urémia obtém-se dividindo a densidade óptica da amostra pela densidade óptica do tubo padrão, multiplicado pelo valor do padrão. O resultado expressa-se em mg% ou g/ l. Cálculo: DO amostra DO padrão x concentração do padrão de ureia Linearidade: O método é linear até uma concentração de 33,3 mm ou 200 mg/dl. Acima deste valor, as amostras deverão ser diluídas (1:2) com NaCl 0,9%. VALORES NORMAIS (deste método): Plasma: 0,15-0,45 g/l ou 2,5-7,5 mm 2