Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2009/2010. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2009/2010 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 6ª AULA PRÁTICA 1. Determinação da concentração plasmática de glucose (glicémia) 2. Pesquisa de glucose na urina (glicosúria)

2 GLUCOSE - GLICÉMIA E GLICOSÚRIA A glucose é o principal açúcar existente no sangue, que serve como "fonte de energia" aos tecidos. É um monossacárido (não pode ser hidrolizado em moléculas mais simples), mais precisamente do tipo aldo-hexose (C 6 H 12 O 6 ). A glicémia é a taxa de glucose existente no sangue. A glicosúria refere-se à presença de glucose na urina e é sempre anormal. A regulação da glicémia encontra-se descrita na Figura 1. A determinação da glicémia e glicosúria podem ser determinadas por métodos colorimétricos (ou de redução) ou por métodos enzimáticos. Figura 1- regulação da glicémia 1

3 A) Métodos colorimétricos ou de redução: Baseiam-se nas propriedades redutoras da glucose, medindo simultaneamente outras substâncias redutoras do sangue. Os métodos de redução não são específicos, podendo apresentar falsos positivos após a administração de substâncias redutoras como os salicilatos e o ácido ascórbico. - Método de Hagedorn e Jensen e Método de Creselius: a "redução residual" pode aumentar originar falsos aumentos na glicémia na ordem de 15 a 30 mg%. - Método de Somogy e Nelson: difere do anterior, já que uma parte da "redução residual" é removida por desproteinização, tornando assim possível uma determinação mais aproximada do valor real da glicémia. - Métodos de Redução para pesquisa e doseamento da glicosúria: prova de Fehling. Através da sua função pseudo-aldeídica, a glucose actua sobre uma solução alcalina de óxido cúprico, CuO (presente num complexo de tartarato hidrossolúvel) e origina, após o aquecimento, um precipitado de óxido cuproso, Cu 2 O, de cor vermelho-acastanhado. B) Métodos enzimáticos (usados actualmente): Determinam a concentração real da glucose, uma vez que usam enzimas específicas, habitualmente a glucose oxidase. Esta enzima cataliza a oxidação da glucose em ácido glucónico, com formação de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ). Este reage com fenol e 4- aminofenazona, na presença da peroxidase, com formação de um composto vermelhovioleta, a quinoneimina, tal como se demonstra nas reacções seguintes, detectável por espectrofotometria do visível. Glucose Oxidase D-Glucose + O 2 + H 2 O D-Gluconato (ácido glucónico) + H 2 O 2 H 2 O Aminofenazona + Fenol Peroxidase Quinoneimina + 4H 2 O A intensidade da coloração é proporcional à quantidade de glucose contida na solução. É um método sensível e específico para o doseamento da glucose. 2

4 - Métodos enzimáticos semi-quantitativos (métodos de comparação) Trata-se do teste enzimático rápido sob a forma de fitas contendo a glucose-oxidase e peroxidase. É usado tanto para o sangue (ex: Glucostix, BMtest ), como para a urina (ex: Combur, Ketodiastix ). Nestes métodos basta uma gota de sangue/urina para estimar a concentração da glucose, por comparação com uma escala de cores. No caso do sangue, há actualmente disponível no mercado uma grande variedade de dispositivos que fazem a leitura da glicémia automaticamente. A urina é habitualmente avaliada por comparação de cores a olho nú, embora também já existam aparelhos de leitura automática. GLICÉMIA Os valores normais da glicémia variam com as refeições, o stress e o local de colheita: O valor normal em jejum de 8 h é de 0,5 a 1,1 g/l ou mg% (mg/100 ml) ou ainda 2,8 6,1 mmol/l (mm). Em situações de stress (ex: traumatismos graves) pode ocorrer hiperglicémia, devido à libertação e acção de adrenalina e cortisol. A glicémia capilar é mg/100 ml superior à glicémia venosa. NOTA: o PM da glucose é 180 g/mol, pelo que 100 mg/100 ml = 5,5 mmol/l Na prática clínica, a determinação da glicémia faz-se com o objectivo de esclarecer dois grupos de circunstâncias: 1- Hiperglicémia Esta surge genericamente por: a) Défice de acção da insulina diabetes mellitus b) Exagero de acção de uma ou mais hormonas da contra-regulação (ex: síndrome de Cushing cortisol, hipertiroidismo tiroxina). A diabetes mellitus é uma doença crónica provocada por alterações no metabolismo dos hidratos de carbono, gorduras e proteínas secundárias ao défice de insulina. Em geral, manifesta-se clinicamente por: polifagia (aumento ingestão alimentos), polidipsia (aumento da sede), poliúria (aumento do volume urinário) e perda de peso. Define-se pela existência de glicémia em jejum 126mg/dl ou 200mg/dl em determinação ocasional ou 2 h após o teste de tolerância à glucose oral (i.e., a ingestão de 75 g de glucose em 200 ml de água, no adulto). 3

5 Na diabetes mellitus, a hiperglicémia deve-se à diminuição da captação de glucose pelas células dos tecidos periféricos, particularmente do tecido muscular e do tecido adiposo, por défice na acção da insulina. Distinguem-se dois tipos de Diabetes: - Diabetes Tipo 1 por défice da produção de insulina- mais frequente no jovem e insulinodependente. - Diabetes do Tipo 2 por resistência à acção da insulina - mais frequente no adulto e habitualmente controlável com antidiabéticos orais, necessitando de insulina ocasionalmente ou mais tardiamente na sua evolução. 2- Hipoglicémia Num indivíduo normal, os mecanismos de regulação da glicémia são muito eficazes, de modo que, mesmo num jejum prolongado ou em situação de greve de fome, não se verifica hipoglicéma imediatamente. A hipoglicémia é sempre uma situação anormal, cuja causa deve ser investigada, sobretudo se recorrente. Clinicamente manifesta-se por dois grupos de sinais/sintomas: glicopénicos, por falta de glucose cerebral (prostração, tremores, convulsões, coma) e adrenérgicos, por estimulação da libertação de adrenalina (palidez, hipersudorese, taquicardia). A alteração dos mecanismos produtores de glucose sanguínea (glicogenólise, neoglicogénese) ou do fornecimento de energia alternativa, nomeadamente no jejum (oxidação dos ácidos gordos, cetogénese) pode conduzir a hipoglicémia. Essa alteração pode dever-se a défice das reservas de glicogéneo (ex: recém-nascidos prematuros) e/ou imaturidade dos sistemas enzimáticos, défice enzimático hereditário ou adquirido (ex: secundário a uma doença hepática grave) ou a alteração hormonal (excesso de secreção de insulina hiperinsulinismo - ou diminuição das hormonas da contra-regulação, como o cortisol ou a hormona do crescimento). O consumo de álcool pode causar hipoglicémia devido ao efeito inibitório dos produtos de metabolização do etanol sobre o ciclo de Krebs, a neoglicogénese e a oxidação dos ácidos gordos, particularmente nas crianças (por > NADH/NAD + ). 4

6 GLICOSÚRIA Normalmente, não se verifica a presença de glucose na urina. A glucose tem dimensões pequenas e é hidrossolúvel, pelo que a sua concentração no filtrado glomerular é igual à do plasma. Para concentrações até mg/dl (limiar renal para a glucose), toda a glucose filtrada é reabsorvida no túbulo contornado proximal. Para concentrações superiores, que ultrapassem a capacidade de reabsorção tubular, surge glicosúria por hiperglicémia. Em caso de lesão tubular renal proximal pode verificar-se glicosúria, mesmo com valores de glicémia normais, por incapacidade de reabsorção da glucose filtrada no glomérulo: glicosúria de causa renal. Em qualquer circunstância, a glucose, pelo seu efeito osmótico, arrasta grandes volumes de água, aumentando assim o débito urinário -poliúria- com risco de desidratação. Na prática clínica, a determinação da glicosúria faz-se em dois tipos de circunstâncias: Suspeita de glicosúria secundária à hiperglicémia - Diabetes mellitus: à hiperglicémia associa-se glicosúria e cetonúria. A análise da urina é frequentemente o primeiro teste a apontar o diagnóstico. A glicosúria não é actualmente usada no controlo do doente diabético, uma vez que só surge quando é ultrapassado o limiar renal para a glucose (o objectivo do controlo é a manutenção da glicémia em valores próximos do normal) e, por outro lado, porque aquele limiar apresenta grande variação individual. Para esse efeito, usa-se a determinação da glicémia capilar ao longo do dia. - Hiperglicémia de outras causas: nomeadamente durante a administração de soros intravenosos com concentração elevada de glucose. Suspeita de lesão tubular renal proximal: - À glicosúria associa-se o aumento da excreção urinária de outras substâncias normalmente reabsorvidas no túbulo renal, como aminoácidos, bicarbonato, fósforo e ácido úrico. 5

7 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II, Mestrado Integrado em MEDICINA, 2009/2010 PROTOCOLO DE BANCADA - 6ª AULA PRÁTICA A. GLICÉMIA - Determinação da concentração plasmática da glucose I-Método enzimático de determinação em plasma ou soro sanguíneo Grupos 1 a 4 Amostra: Soro ou plasma isolado de sangue colhido em heparina ou EDTA. A glucose é estável durante 24 horas a 2-8 ºC desde que o soro ou plasma sejam preparados até 30 minutos após a colheita de sangue. Padrão: Glucose 5,55 mm (100 mg/dl) (2-8 ºC) Reagente: Tampão fosfato (50 mm, ph 7,0), tampão MOPS (50 mm, ph7,0), Fenol (11 mm), 4-Aminofenazona (0,77 mm), Glucose oxidase (> 1,5 ku/l), e peroxidase (> 1,5 ku/l) (2-8 ºC). Preparação dos tubos branco, padrão e amostra: Branco Padrão Amostra Padrão µl Amostra µl Reagente 2 ml 2 ml 2 ml DO (λ = 500 nm) Misturar e incubar durante 10 minutos a 37ºC ou 25 minutos à temperatura ambiente. Ler a absorvância da amostra e do padrão, contra o branco (zero), a 500 nm. A intensidade de côr é estável durante 60 minutos. Linearidade: O método é linear até um concentração de glucose 22,2 mm (400 mg%). Acima desta concentração, as amostras deverão ser diluídas 1:2 com água destilada. Especificidade: Este método não é influenciado pelo ácido úrico, ácido ascórbico, glutationa, anticoagulantes, bilirrubina e creatinina quando presentes em concentrações diluídas. Cálculos: [Glucose] = DO (amostra) DO (padrão) X Concentração do Padrão Valores referência: 4,2 6,4 mm ou mg/dl. 6

8 ATENÇÃO: O Reagente contém o composto tóxico azida de sódio. NOTAS IMPORTANTES SOBRE O COMPOSTO AZIDA DE SÓDIO: - Evite ingerir ou o contacto com a pele ou mucosas. - No caso de contacto com a pele, lave imediatamente com bastante água. - No caso de contacto com os olhos e se ingerido, dirija-se ao Centro de Saúde ou Hospital mais próximo. - A azida de sódio reage facilmente com o chumbo ou cobre dos lavatórios/superfície de metal e forma compostos de azida altamente explosivos. - Os tubos contendo azida de sódio devem ser colocados em contentor próprio para resíduos perigosos. - Em caso de derrame, as superfícies de metal deverão ser lavadas com uma solução de 10% de hidróxido de sódio (NaOH) para descontaminação. II- Método enzimático de determinação da glicémia capilar Grupos 1 a 4 Colocar uma gota de sangue na fita e colocar no dispositivo de leitura. Registar os valores. B. GLICOSÚRIA Pesquisa de glucose na urina por método enzimático semi-quantitativo Grupos 1 a 4 Retire uma fita de pesquisa de glicosúria, mergulhe-a na amostra de urina, retirando-a logo de seguida. Aguardar alguns minutos e fazer a leitura por comparação com a escala de cores da embalagem. 7