Clonagem, expressão e mutagênese sítio-dirigida da troponina C* do músculo esquelético de frango

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1 Clonagem, expressão e mutagênese sítio-dirigida da troponina C* do músculo esquelético de frango Fernando C. Reinach e Roger Karlsson Bruna Telles Lucas Travessa Thaisa Diniz Disciplina: Engenharia de proteínas Docente: Prof. Dr. Jesus Aparecido Ferro

2 INTRODUÇÃO

3 Músculo Liso Estriado Esquelético Cardíaco

4 Músculo esquelético

5 Contração muscular Extremidade N terminal domínio globular (ATP) Extremidade C terminal alfa hélices estendidas Ligação do Ca 2+ Duas cadeias alfa hélice enroladas

6 REGULAÇÃO Sistema de regulação uma molécula de troponina com três subunidades (TNC, TNI, TNT), uma tropomiosina e sete monômeros de actina Ligação de Ca 2+ alterações conformacionais

7

8 Troponina - Alta quantidade de alfa-hélices; - 2 domínios N-terminal C-terminal conectados por nove longas alfa-hélices com 11 resíduos de aminoácidos centrais - Interação entre os domínios Rota de transferência de informação Com a determinação da estrutura cristalográfica do TNC, dados bioquímicos e estruturais estão disponíveis para projetos de mutantes sítio-dirigidos.

9 Glicina É um aminoácido apolar e hidrofóbico; Apresenta estrutura mais simples pequena cadeia não chega a contribuir de forma significativa para as interações hidrofóbicas.

10 Presença de glicina (Gly-92) no centro da alfa-hélice + Ausência de contato direto entre os domínios Sugestão: dobramento ao redor da Gly-92 originaria uma interação direta entre os domínios

11 Para testar o papel da glicina ao longo da alfa hélice e uma possível função para este resíduo na transferência de informação entre os resíduos Mutação da glicina em uma ALANINA e uma PROLINA

12 Alanina - Faz parte do mesmo grupo da Glicina; - Suas cadeias laterais tendem a se aglomerar entre si nas proteínas, estabilizando a estrutura protéica por meio de interações hidrofóbicas; - Foi selecionada pois diminui a flexibilidade da hélice com a introdução de uma pequena cadeia lateral, a qual não deve interferir com a troponina.

13 Prolina - Faz parte do grupo da Glicina e Alanina; - Apresenta uma cadeia alifática com uma estrutura cíclica; - O grupo amino secundário reduz a flexibilidade estrutural de regiões contendo prolina; - Restringir uma maior extensão da posição de rotação.

14 SITUAÇÃO 1 SITUAÇÃO 2 Glicina é essencial para funcionamento da TNC Glicina não é essencial para o funcionamento da TNC APÓS A MUTAÇÃO APÓS A MUTAÇÃO Insuficiência na regulação da contração muscular Eficiência na regulação da contração muscular

15 OBJETIVO O objetivo desse trabalho foi verificar se a glicina tem participação na transmissão das informações entre os domínios N e C-terminal informações entre os domínios N e C-terminal da troponina durante a contração muscular.

16 MATERIAL E MÉTODOS

17 Isolamento da fita inteira de cdna - O RNAm foi extraído do músculo peitoral do frango, duas semans após a eclosão do ovo; clones foram feitos em fago λ de gt10; - Estes cdnas foram testados com uma sonda de fita simples de coelho ( 94 pb e codifica os aminoácidos da troponina C;

18 Sonda: dctp, dgtp, dttp, [32P] datp

19 - Os produtos da reação foram digeridos com EcoRI, e a fita marcada contendo o inserto foi purificada em um gel de poliacrilamida em condições desnaturantes. Fonte: Lodish, H., et. al Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 376.

20 Fonte: Lodish, H., et. al Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. Página 367.

21 - A hibridização foi realizada em 5x SSC (20 x SSC é 3M de NaC1, 0,3 M de citrato de sódio, ph 7,0), 0,1% de dodecil sulfato de sódio, 0,1% de Ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 1 mm EDTA a 67 o C; - Um total de 150 sinais positivos foram isolados; - Dez clones que deram sinais mais fortes tinham inserções de 500 pb; - Quatro clones com inserções maiores que 850 pb foram sequenciados; - Três destes continha a sequência de codificação completa de TNC e porções variáveis de 5 - região não traduzida.

22 Sequenciamento de DNA e proteínas Todas as sequências de DNA foram determinadas utilizando o método de terminação da cadeia didesoxi. O cdna foi sequenciado em ambas as cadeias utilizando uma série de deleções progressivas.

23 Construção do plasmídeo que expressa troponina C - A fita total de cdna foi clonada no sítio EcoRI do M13 derivado de M13K11RX, e um clone com a extremidade 5 'do RNAm de frente para o primer universal foi selecionado; - Um oligonucleótido que codifica a sequência de reconhecimento do factor Xa e os três primeiros aminoácidos da TNC (ATCGAGGGTAGGATGGCGTCAATG) foram usados para eliminar a extremidade 5 'do cdna, e justapor o último códon do fator Xa da sequência de reconhecimento (Arg) para o primeiro códon detnc (Met); - Foi realizada a hibridação;

24 - A cadeia dupla produzida foi transfectada para (JM101) para selecionar os quatro sítios de EcoK e a região 5 'não traduzida do TNC presente no loop de fita simples. Um clone com a supressão correta foi isolado e resequenciado;

25 Mutagênese sítio dirigida - Para evitar manipulações dentro da região codificadora da proteína de fusão, a região de codificação CIIFXTNC foi excisada com EcoRI e clonados em M13mp18; - Dois oligonucleotídeos (ACGCCAAGCCCAAGTCTGA; ACGCCAAGGCCAAGTCTG) foram usados para mutar Gli-92 em Pro e Ala, respectivamente; - A discriminação entre os genes mutantes e TNC do tipo selvagem foi possível com os oligonucleótidos marcados a 62 o C e lavados em 6x SSC. Os mutantes foram purificados em placa, confirmada por sequenciação, e a sequência completa da região codificadora foi determinada;

26 - A Gli-92- Pro e a Gli-92- Ala (F895) construídas foram excisadas do M13mp18 com EcoRI e clonadas em plmplo (19). Após a selecção de clones com a orientação adequada, eles foram testados quanto à expressão. Fonte:

27 Purificação da TNC recombinante e os dois mutantes produzidos em E. coli - Em overnigth uma cultura de QY13 contendo o plasmídeo foi cultivada a 30 o C em 2 x TY (16 g / litro de triptona, 10 g / litro de extrato de levedura, 5 g / litro de NaCl, ph 7,4) com 25 ug / ml de ampicilina; - Três litros do mesmo meio distribuído em frascos foram inoculados com 5 ml da cultura durante a noite e cultivadas a 30 o C até a OD = 0,6. Indução foi realizada por imersão dos frascos em banho de 85 o C, durante o monitoramento da temperatura do meio. À medida que a temperatura atingiu 42 o C (30-45 segundos), os frascos foram transferidos para um banho a 42 o C durante 15 min.

28 - As culturas foram cultivadas durante mais 4 h a 37 o C; - As células foram recolhidas a 6,000 x g durante 10 min e mantidas congeladas; - As células foram ressuspensas em 15 ml de 50 mm Tris-Cl, ph 8,0, 25% de sacarose, 1 mm EDTA, 2 mg / ml de lisozima. Após 15 min, em gelo, MgCl 2, MnCl 2, e DNAase I foram adicionados a uma concentração final de 10 mm, 1 mm e 1 ug / ml; - Quando a viscosidade foi reduzida, 30 ml de 200 mm de NaCl, 1% de ácido desoxicólico, 1,6% de Nonidet P-40, 20 mm Tris- C1, ph 8,0, 2 mm de EDTA foram adicionados. ;

29 - O extrato resultante foi clarificado durante 15 minutos a 10,000 x g e o ácido tricloroacético (100 % w / v de estoque ) foram adicionados, sob agitação contínua a uma concentração final de 5%. O precipitado foi coletado (3000 x g, 10 min) e ressuspenso em 25 mm Tris-Cl, ph 8,0, MgCl 2, 1 mm, 1 mm e dialisado contra o mesmo tampão; Membrana de celofane solvente solução a ser dialisada

30 - Depois de remover o material não ressuspenso o sobrenadante foi feito em 6 M de ureia e carregado a um DEAE-celulose (Whatman DE52) 2 x 15 cm de coluna equilibrada com 50 mm Tris-Cl, ph 8,0, 6 M de ureia, 1 mm de MgCl 2, 1 mm de 2 βmercaptaetanol à temperatura ambiente; - A proteína foi eluída com um gradiente de 100 ml X 100 de 0-0,6 M de NaCl no mesmo tampão;

31 DEAE - celulose A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 1) adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; 2) eluição das proteínas adsorvidas Adsorção Eluição Na + Cl

32 - A proteína foi dialisada extensivamente em 50 mm Tris-Cl, ph 8,0, 1 mm de MgCl 2 para remover os vestígios de detergentes e manter congelada; - As proteínas de fusão foram digeridas com o factor Xa em 50 mm Tris-Cl, ph 8,0, 100 mm de NaCl, 1 mm de MgCl 2, 0,1 mm CaCl 2 com um substrato enzimático de 30:1 w / w; - Após a digestão a proteína foi purificada na mesma coluna DE52 para remover o peptídeo N-terminal.

33 Ligação de cálcio - Ligação de cálcio para TNC isolada foi medida utilizando um ensaio de filtração. As medições foram feitas nas concentrações de Ca 2+ livre variando de 10-5 a 10-8 M em 50 mm de tampão de imidazol-hcl, ph 7,0, com ou sem 1 mm de MgCl 2. Uma aparente constante de ligação de Ca / EGTA a 25 o C, ph 7,0, de 3 x 10-6 m I foi utilizado para calcular as concentrações de cálcio livres. A concentração final de 45 Ca/EGTA estava na faixa de 5-20 um (atividade específica foi de cpm / pmol).

34 Reconstituição do complexo Troponina - Os complexos de troponina foram remontados com quatro espécies diferentes de TNC com TNI e TNT purificadas a partir do músculo esquelético; - As três subunidades foram misturadas em uma concentração final de 22 pmol/ul de cada componente em 600 ul de 5 mm de imidazol- HCl, ph 7.0, 5 mm de CaCl 2, 500 mm de KCl, 2 mm de sódio ázido, 0,5 mm de DTT; - Decorridas 12 horas de diálise, o tampão tinha a concentração de CaCl 2 reduzida para 2 mm e a concentração de KCl para 250 mm. Depois de mais 12 h o imidazol foi reduzido para 2 mm, CaCl 2 para 20 um, e KCl para 100 mm. - Depois de mais 12 h, as amostras foram centrifugadas numa centrífuga Eppendorf ( x g, 5 min) e um pequeno precipitado (menos de 1% da proteína total) foi observado em todas as quatro amostras;

35 Regulação de cálcio da actina ativada da ATPase miosina - O complexo de troponina (80 ul) foi pré-misturado com a tropomiosina (28 ul de 5,7 mg / ml solução em 20 mm Tris-C1, ph 7,5, 0,1 mm de DTT). A foi então misturada com o complexo troponina-tropomiosina. Depois de 5 min incubada no gelo, a miosina foi adicionada. Depois de se misturar 1,73 ml de 40 mm de KCl, 5 mm MgCl, 0,1 mm de EGTA, 0,25 mm de DTT foram adicionados à mistura; - Cálcio (10 ul de 100 mm de CaCl 2 ) foi adicionado no final do experimento para determinar a regulação adequada do filamento. Para medir mais a taxa de cálcio, o cálcio foi adicionado antes da ATP, e o mesmo procedimento foi seguido. Uma maior consistência a partir de um experimento para outro pode ser obtido através da medição da taxa de positivo e negativo em experiências separadas;

36 RESULTADOS

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42 DISCUSSÃO

43 cdna codificando para a troponina C do músculo esquelético de frango foi clonado e expresso em E. coli; Após purificação desta proteína observou-se que ela liga-se ao cálcio com as mesmas propriedades que a proteína purificada do músculo; A produção da TNC funcional a partir de um cdna clonado permite investigar detalhes da estrutura e função desta molécula.

44 Produção de TNC na E. coli A sequência desconhecida de 4 resíduos da porção N- terminal foi determinada a partir da sequência do cdna; Encontrou-se duas substituições de aminoácidos: asparagina por ácido aspártico na posição 100 possivelmente deve-se à desaminação da proteína durante o sequenciamento; A mudança de isoleucina por treonina na posição 130 pode ser devido à variações alélicas.

45 A principal diferença na estrutura primária da proteína recombinante e a purificada do músculo do frango reside no fato de que a proteína da frango possui um resíduo N- terminal bloqueado e perde a metionina inicial; No sistema de expressão, pela clivagem da proteína fundida com o Fxa, o resíduo N terminal permanece desbloqueado e a metionina permanece; Estrutura cristalina: resíduos da porção N terminal ficam mal resolvidos e parecem não se conectar ao restante da molécula

46 Mutantes de Gly-92 Evidências de mudanças conformacionais no domínio C- terminal induzidas por çigação do cálcio na porção N- terminal : mudanças na intensidade de fluorescência em sonda ligada ao Cys-98 ( porção C-terminal da alfa-hélice); Gly-92 no centro da hélice: rotação traria os domínios a uma configuração mais próxima; Flexibilidade na hélice; Substituição por outros resíduos sem alterar função da TNC : papel essencial de Gly-92 rejeitada.

47 Os dois mutantes foram utilizados para restringir a flexibilidade da hélice; Estrutura com prolina na posição 92: normalmente ocasionam quebra da estrutura, porém, têm-se encontrado prolinas em alfa- hélices; Modelo da hélice utilizado para analisar como acomodar prolina nesta posição.

48 Os mutantes apresentaram propriedades normais na ligação do cálcio e na regulação da ATPase da miosina; Os resultados demonstram que a glicina-92 não é essencial no correta função do filamento fino; Os mutantes Pro e Ala provavelmente aumentaram a rigidez da hélice central: grandes rotações nesta parte da molécula não devem estar envolvidas na função da TNC.

49 É possível que a estabilidade promovida pelos mutantes é pequena em comparação com a energia envolvida na mudança conformacional; A expressão de troponina C funcional em E. coli e a análise de mutantes sítio- dirigidos possibilitam analisar mecanismos moleculares da regulação da atividade muscular e interações entre estrutura e função na TNC.

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