Métodos de Detecção de Mutações dos genes B-RAF e C-KIT em Melanomas

Transcrição

1 Métodos de Detecção de Mutações dos genes B-RAF e C-KIT em Melanomas Dra Isabela Werneck da Cunha, MD phd Divisão de Patologia Molecular Departamento de Anatomia Patológica iwcunha@hcancer.org.br

2 DNA RNA Proteínas Funções celulares

3 Detecção das mutações Detecção de proteínas alteradas, supressas ou superexpressas Imunoistoquímica Aumento ou diminuição do mrna RT-PCR Análise do DNA PCR Real time PCR Sequenciamentos Hibridização in situ (se alterações no numero de cópias ou translocações de genes inteiros)

4 O DNA principais características Dupla-Fita Anti-Paralelas Complementares A T C G

5 aminoácidos Códon Códon Códon Códon Códon

6 4 nucleotídeos= 64 combinações diferentes de 3 em 3 (Temos 20 aminoácidos) Redundância: Vários códons codificam o mesmo aminoácido

7 Mutações em Melanoma BRAF NRAS KIT Vias similares Mutualmente exclusivas Diferentes tipos de Melanoma Lazar AJ & Murphy GF, Robbins and Cotran s Pathologic Basis of Disease

8 Diferentes vias moleculares Diferentes tratamentos Melanoma

9 Subtipos de Melanoma CSD, Chronic sun-damaged Mike Davies, MDACC

10 GENE BRAF Gene da família das Kinases da via MAP kinase/erks Participa dos processos de divisão celular e diferenciação. A mutação leve a produção de uma proteína com atividade 10x maior que a selvagem, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.

11 GENE BRAF Mutação do BRAF vista em 66% dos melanomas (Davies et al.2002) 97% das mutações envolvem o codon 600 (GTG>GAG) (Valina>Ac.Glutâmico) (V600E) (JaKob J et al, Cancer 2012) Associação com resposta (78%) a tratamento de melanoma metastático com inibidores de BRAF (vemurafenib) (Eggermount et al 2011).

12 Targeted therapy for metastatic melanoma Growth factors RAS-GTP Oncogenic BRAF signaling Zelboraf mode of action BRAF BRAF V600E BRAF V600E x Zelboraf P MEK P MEK MEK P ERK P ERK ERK Normal cell proliferation and survival Excessive cell proliferation and survival Arrested cell proliferation and survival Garnett MJ et al. Cancer Cell 2004;6: ; Wan PT et al. Cell 2004;116: MAPK, Mitogen-activated protein kinase

13 GENE KIT Gene da família das Proteínas Tirosino-Kinases Participa dos processos de divisão celular e diferenciação. A mutação leve a produção de uma proteína constantemente ativa, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase. Cytogenetic Location: 4q11-q12 Molecular Location on chromosome 4: base pairs 55,524,094 to 55,606,880

14 GENE KIT

15 GENE KIT

16 Pesquisa de Mutações Seleção dos casos Extração do DNA PCR de amplificação dos genes envolvidos Real Time, sequenciamento, pirosequenciamento, análise de fragmentos, next sequencing generation, etc... Análise dos dados

17 A grande maioria dos melanomas para testes moleculares estão emblocados em parafina % tumoral % cópias mutantes % DNA amplificado Tipo de fixação Mistura de células tumorais e estromais: Necessidade de microdissecção. Heterogeneidade intratumoral. DNA mutado misturado com DNA selvagem: Desafio para detectar baixas taxas de mutação. Fixação tecidual pode levar a dano do DNA. Tecido necrótico pode não ter DNA amplificado. Tipo de fixação e outras impurezas como melanina podem interferir na amplificação do DNA Adaptado

18 Fixação do Material (formol tamponado a 10%) Formol tamponado 10% FORMOL TAMPONADO A 10% PARA 1 litro 100 ML DE FORMALDEIDO A 37% 4,0 H20 gramas de Fosfato de Sódio Monobásico NA H2 P04 12,26 gramas de Fosfato de Sódio Bibasico Na2H PO4.7 H ml de Água destilada Acertar o PH = 7.2 a 7.4 com Hidróxido de Sódio NaOH=5 normal

19 Confirmação Diagnóstica (checagem do material enviado)

20 Seleção da amostra Microdissecção manual /scrape Microdissecção a laser

21 Tumor content study Correct detection of V600E mutations in specimens with at least 15% tumor content and/or mutation level >5% Specimen Tumor content* % mutation Test result 1 5%/5% 3% Mutation not detected 4 10%/10% 4% Mutation not detected 5 10%/10% 14% Mutation not detected 8 15%/15% 3% Mutation detected 12 20%/20% 28% Mutation detected 14 20%/20% 2% Mutation detected 17 30%/25% 20% Mutation detected 22 35%/35% 7% Mutation detected 26 40%/35% 7% Mutation detected 31 40%/45% 36% Mutation detected *Tumor content for first and last of 12 adjacent 5µm sections from each specimen cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA

22 Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene KRAS (Macedo MP 2012) Lâminas histológicas submetidos a análise de imagens para estimar a proporção de tumor em relação ao estroma

23 48% de células neoplásicas

24 Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene KRAS

25 Extração do DNA Inúmeros métodos Inúmeros kits Espectofotômetro Mede quantidade e qualidade do DNA obtido Usar o DNA para realizar a PCR.

26 PCR Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase) Amplificação do DNA (criação de múltiplas cópias) Consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. Pode ser usada para amplificar todo o gene ou somente parte de um gene Área de interesse

27 PCR DNA Codon 600

28 Sequenciamento Gênico Determinar a ordem das bases nitrogenadas A G C T da molécula de DNA Métodos: Sanger conceito de sequenciamento por ``Chain termination Pirosequenciamento: sequenciamento por síntese Next sequencing generation Análise de fragmentos, etc RT-PCR

29 Um Pouco de História... Frederick Sanger Walter Gilbert "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Nobel Prize in Chemistry

30 c.1780 G>A, pd594n

31 Pirossequenciamento Se baseia no conceito de liberação de pirofosfato após incorporação de cada nucleotídeo- conceito do sequenciamento por síntese Mais sensível que Sanger Quantitativo Emissão de luz PPi ATP Tempo

32 cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test Based on TaqMan PCR Probe and primer binding Polymerization Fluorescence Forward PCR primer TaqMan probe Fluoroph ore Quench er Amplifica tion Cleavage products cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA

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35 Competitive landscape cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test comparison to other methods Feature % tumor required DNA input required cobas BRAF test 1 therascreen BRAF RGQ 2 kit Direct sequencing Next generation sequencing PCR-based LDT 50% Undefined Undefined Undefined Undefined 125 ng/25 μl requires PCR titration Undefined Undefined Undefined Sensitivity 5% FFPET 1 5% in cell line ~20% ~1% 5% Undefined Storage conditions Control/result interpretation 2 to 8 C -18 C to -25 C Variable Variable Variable Automated Manual Manual Manual Manual Workflow <8 hours ~16 hours ~3 days ~5 days ~16 hours IVD platform CE-IVD, FDA approved RUO RUO RUO RUO 1 cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011; 2 therascreen BRAF RGQ PCR Kit CE-IVD Handbook, Qiagen Manchester Ltd, UK, LDT=Laboratory-developed test

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37 Imuno-histoquímica VE1 Anticorpo monoclonal anti-braf V600E Representa a sequência de aa da mutação V600E aa : GLATEKSRWSG Negativo em: Gene tipo-selvagem Outras mutações do BRAF

38 Assessment of BRAF V600E mutation status by immunohistochemistry with a mutation-specific monoclonal antibody David Capper Matthias Preusser Antje Habel Felix Sahm Ulrike Ackermann Genevieve Schindler Stefan Pusch Gunhild Mechtersheimer Hanswalter Zentgraf Andreas von Deimling Acta Neuropathology (2011) 122:11 19 Immunohistochemical testing of BRAF V600E status in 1,120 tumor tissue samples of patients with brain metastases David Capper Anna Sophie Berghoff Manuel Magerle Aysegu l Ilhan Adelheid Wo hrer Monika Hackl Josef Pichler Stefan Pusch Jochen Meyer Antje Habel Peter Petzelbauer Peter Birner Andreas von Deimling Matthias Preusser Acta Neuropathology (2012) 123:

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40 Em resumo Condições pré analíticas Tamanho/Tipo da amostra DNA degradado (descalcificação) Fixação inadequada Métodos (sensibilidade X especificidade) Taxa de resultados inconclusivos: 2 a 3 % (dados americanos)