KRAS Mutation Detection: A New Look at an Old Gene Detecção da Mutação do KRAS: Uma Nova Olhada em um Velho Gene

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1 KRAS Mutation Detection: A New Look at an Old Gene Detecção da Mutação do KRAS: Uma Nova Olhada em um Velho Gene A introdução de drogas de moléculas pequenas e de anticorpos monoclonais humanos como novas terapias que tem como alvo receptores específicos e proteínas em vias específicas de transdução de sinal renovaram o interesse nos genes que tinham sido anteriormente identificados como estando envolvidos no processo tumorigênico. O primeiro desses genes foi o ERBB23 [v-erb-b2 homólogo do oncogene viral da leucemia eritroblástica 2, homólogo (aviário) do oncogene derivado do neuro/glioblastoma ] oncogene (também conhecido como HER2), um membro da família do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que está ampliado no câncer de seio humano. Interesses diagnósticos nesse gene nunca foram grandes até que esse receptor se tornasse o alvo da Herceptin, a primeira terapia de anticorpo monoclonal contra um receptor celular. Similarmente, EGFR se tornou o alvo tanto das terapias de anticorpos monoclonais que têm como alvo o domínio de ligação e as drogas de moléculas pequenas que inibem sua atividade da tirosina quinase. KRAS (homólogo do oncogene viral do sarcoma de rato v-ki-ras2 Kirsten ) é um conhecido oncogene que tipicamente funciona na via EGFR. Embora as mutações nesse oncogene sejam conhecidas por estar associadas com vários tipos de câncer humano, apenas recentemente ele se tornou um biomarcador atraente para o laboratório clínico e o provedor de tratamento de saúde como um mecanismo para determinar opções terapêuticas. Detecção da mutação do KRAS se tornou parte da investigação padrão de pacientes com câncer colorretal, e aqueles tumores que abrigam uma mutação do KRAS têm mostrado não ser sensíveis a terapias anti-egfr. A implementação do teste da mutação do KRAS num ambiente do laboratório clínico é examinado abaixo por 4 patologistas e um oncologista médico de 4 instituições médicas líderes nos Estados Unidos. É o teste da mutação do KRAS realizado rotineiramente em sua instituição? Se é, para quais indicações clínicas? Se não, quais são as barreiras que estão afetando sua implementação? Arief A. Suriawinata4 : O teste do KRAS para câncer colorretal é rotineiramente realizado em pacientes que estão sendo considerados para terapia anti- EGFR incluindo cetuximab e panitumumab em nossa instituição. Oncologistas são responsáveis por pedir a análise da mutação do KRAS quando eles estão considerando a terapia anti-egfr como um tratamento de segunda linha em pacientes com câncer colorretal avançado. O patologista então identificará o apropriado bloco do tecido e o enviará para o Laboratório de Patologia Molecular para testes. Além disso, teste do KRAS é realizado em todos os casos de adenocarcinoma pulmonar. William K. Funkhouser5: Nós realizamos teste da mutação do KRAS em um subgrupo de casos com câncer colorretal e câncer pulmonar de células não pequenas, geralmente de pacientes que estão sendo considerados para terapia com anticorpos anti-egfr (colorretal) ou inibidores da tirosina quinase anti-egfr (pulmonar).

2 Marc Ladanyi6 : Sim, nós realizamos teste da mutação do KRAS rotineiramente em 2 cenários clínicos: adenocarcinoma pulmonar e carcinoma colorretal metastático. No primeiro, todos os casos são testados para mutações do EGFR primeiro e, se negativos, vão para o teste do KRAS. Mutações do EGFR e do KRAS são mutuamente exclusivas no adenocarcinoma pulmonar. Nós testamos todos os adenocarcinomas pulmonares ressecados já que uma grande proporção reincidirá. Nós testamos apenas carcinoma colorretal metastático já que, no total, a maioria dos carcinomas colorretais são cirurgicamente curáveis. Jan A. Nowak7: Atualmente, amostras estão sendo enviadas para um laboratório de referência para teste do KRAS. Pedidos para teste do KRAS vêm de oncologistas que estão determinando opções de tratamento para pacientes com carcinoma colorretal. Nosso laboratório está em processo de validar um exame para teste do KRAS para implementação em breve. J. Marc Pipas8 :Em nossa instituição, o Grupo de Oncologia do GI está regularmente realizando teste de mutação do KRAS em todos os pacientes com câncer colorretal metastático nos quais a terapia anti-egfr está sendo considerada. Isso está em conformidade com a Sociedade Americana de Parecer Clínico Provisório de Oncologia Clínica publicado em Devido à falta de resposta aos inibidores EGFR em pacientes com mutações dos genes do KRAS, terapia anti-egfr não é apropriada nesse grupo. Que tipos de decisões de tratamento são baseadas no status do KRAS, e as análises retrospectivas dos tumores dos pacientes são garantidas? Arief A. Suriawinata: A decisão de tratar pacientes com terapia anti-egfr depende altamente da condição da mutação dos genes do KRAS; isto é, terapia anti-egfr é administrada apenas em pacientes com KRAS do tipo selvagem. Estudos retrospectivos sobre características do tumor podem ser úteis em prever a condição da mutação do KRAS e entender as características histológicas específicas associadas com a mutação do KRAS; por exemplo, nosso recente estudo do câncer colorretal mostrou que a maioria dos cânceres colorretais com persistente adenoma viloso preexistente eram mutação positiva do KRAS. William K. Funkhouser: Dados dos testes mostraram que nenhum paciente com carcinoma colorretal com uma mutação de ativação do KRAS respondeu ao tratamento com anticorpos anti-egfr. Carcinomas de pacientes não sensíveis à terapia de primeira linha podem ser examinados retrospectivamente para a presença das mutações pontuais de ativação do KRAS nos códons 12, 13, e 61 pelo uso do modelo de DNA extraído dos blocos de parafina. Marc Ladanyi: Mutações do KRAS são um preditor negativo muito forte de resposta às terapias direcionadas ao EGFR tanto no adenocarcinoma pulmonar quanto no carcinoma colorretal. Se nenhuma amostra atual estiver disponível para teste, análise retrospectiva de uma amostra cirúrgica inicial de um paciente é útil, visto que as mutações do KRAS estão tipicamente presentes no diagnóstico e são mantidas durante todo o curso da doença. É claro, a possibilidade de um segundo câncer ou de câncer primário múltiplo deve ser mantida em mente. Jan A. Nowak: Múltiplos estudos mostraram que pacientes com tumores colorretais metastáticos que abrigam as mutações nos códons 12 e 13 do KRAS não se beneficiam do tratamento com cetuximab ou panitumumab. Pacientes cujos tumores possuem sequências do tipo selvagem nos códons 12 e 13 mostram uma resposta parcial àqueles agentes. Para pacientes que começaram com tal terapia, teste do KRAS

3 seria útil em determinar o potencial do uso continuado daqueles agentes. J. Marc Pipas: KRAS do tipo selgavem é necessário e não suficiente para resposta aos inibidores do EGFR em pacientes com câncer colorretal metastático. Além disso, foi mostrado que KRAS mutado [e BRAF (homólogo do oncogene viral do sarcoma murina B1 v-raf )] está associado com uma pior sobrevivência geral. Visto que aproximadamente 40% das amostras dos tumores em pacientes com câncer colorretal exibe mutações do KRAS, análise da mutação do KRAS é crítica quando consideramos a terapia anti- EGFR. Pacientes com tumores que exibem mutações do KRAS devem ser considerados para outros tratamentos. Infelizmente, isso limita as opções terapêuticas, contudo testes clínicos estão agora abertos que especificamente abordam pacientes com tumores mutados pelo KRAS. Detecção das mutações somáticas em tumores potencialmente heterogêneos pode ser problemática. Como isso afeta sua interpretação desses resultados dos testes? Arief A. Suriawinata: Enquanto nós fazemos o melhor para selecionar uma seção que seja a mais representativa do tumor para teste do KRAS, nós percebemos que, embora raro, a heterogeneidade do tumor pode ser um problema em cânceres colorretais grandes com poucas linhas diferentes de diferenciação. Alternativamente, teste do KRAS pode ser realizado numa metástase que supostamente representa o clone mais agressivo se a heterogeneidade do tumor for suspeitada. Nosso laboratório usa controles de 5% para cada uma das 7 mutações que consistem de oligonucleotídeos sintéticos mutantes e do tipo selvagem misturados em uma proporção de 95:5, respectivamente. Minha preocupação com o relato dos laboratórios sobre a detecção de múltiplas mutações do KRAS no mesmo tumor é que isso possa refletir alguns desafios técnicos no desempenho do teste devido à proximidade das bases que estão tipicamente mutadas (códons 12 e 13) contra verdadeira heterogeneidade do tumor. William K. Funkhouser: Mistura rotineira do DNA do KRAS mutante e do tipo selvagem implica numa necessidade de uma alta sensibilidade para detecção das mutações pontuais nos códons 12, 13, e 61. Nós usamos controles positivos incrementados de 5% e usamos piro sequenciamento para detecção das mutações pontuais. Sequenciamento de Sanger seria menos sensível, e análise da curva de fusão necessitaria de sequenciamento confirmatório. Marc Ladanyi: Em nossa experiência, principais alterações genéticas iniciais do condutor tais como mutações do KRAS (ou mutações do EGFR) raramente, se alguma vez, mostram heterogeneidade intratumoral genuína. É provável que a maioria das situações com aparente heterogeneidade intratumoral para mutações do KRAS de fato representem o teste de áreas de conteúdo tumoral diferente, algumas das quais podem estar abaixo do nível de sensibilidade do método do teste (tipicamente sequenciamento de Sanger). Outros exemplos de heterogeneidade para as mutações do KRAS podem representar cores primárias separadas. Nós temos visto vários pacientes com múltiplos adenocarcinomas pulmonares primários, cada um contendo uma diferente mutação (EGFR ou KRAS). Jan A. Nowak: Eu não estou ciente de que alguém tenha sistematicamente abordado a questão da potencial heterogeneidade tumoral com relação à mutação do KRAS nos tumores colorretais. Até que existam bons dados, isso permanecerá um problema hipotético. Nós sabemos, entretanto, cerca de 30% 40% dos tumores de cólon terão mutações do KRAS e que esses tumores provavelmente não responderão aos agentes anti-egfr observados acima. Testes que são semelhantes no design e metodologia devem ser tão preditivos quanto aqueles usados para estabelecer a observação KRAS EGFR. Esses são os testes que os laboratórios

4 estão atualmente realizando. Se a microheterogeneidade tumoral mostrar ser um fator, então a interpretação dos resultados dos testes do KRAS terão que levar isso em conta. Se os tumores que mostram significativa heterogeneidade do KRAS responderão diferentemente às terapias anti-egfr também é desconhecido. J. Marc Pipas: Em nossa instituição, nós temos experiência com teste in-house para mutações somáticas do KRAS através do uso de PCR de tempo real e de químicas da sonda TaqMan. Nós temos mostrado que esse é um método robusto, fácil de usar, e confiável que pode ser usado para testes de baixo volume usando amostras de tecido misturadas com parafina assim como material de amostras de aspiração com agulha fina preservado em fixadores à base de álcool. Nós acreditamos que essa abordagem seja razoável para teste clínico generalizado. Você acha que o teste da mutação do KRAS será estendido para outros tipos de tumores? Arief A. Suriawinata: Teste de outros tipos de tumores somente ocorreria se a terapêutica puder atingir essa via de transdução de sinal nesses outros tipos de tumores. Visto que EGFR também desempenha um papel significativo em outros tumores, esse cenário é altamente provável. William K. Funkhouser: Teste de mutação do KRAS deveria ser considerado para qualquer malignidade na qual o tratamento de quinases upstream com anticorpos ou inibidores da tirosina quinase está sendo considerado. Teste da mutação do BRAF também deveria ser considerado, já que ativar as mutações do BRAF também poderia impedir resposta à terapia anti- EGFR. Marc Ladanyi: Atualmente, mutações do KRAS são usadas como preditores negativos de resposta às terapias direcionadas ao EGFR, portanto os tipos de tumores testados são aqueles onde as terapias direcionadas ao EGFR já estão em uso generalizado, isto é, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma colorretal. Entretanto, abordagens direcionadas aos próprios cânceres mutantes do KRAS estão em vários estágios do desenvolvimento clínico e provavelmente guiarão a expansão do teste do KRAS através de uma gama maior de histologias dos tumores. Jan A. Nowak: É provável. Mutações do KRAS são ativadores downstream da via de sinal do EGFR, supostamente o mecanismo pelo qual aquelas mutações contornam a eficácia dos antagonistas do EGFR. No câncer pulmonar das células não pequenas, as mutações do KRAS e as mutações do EGFR são declaradamente mutuamente exclusivas. É provável que o teste da mutação do KRAS seja parte do algoritmo para avaliação da via do EGFR no câncer pulmonar das células não pequenas. J. Marc Pipas:Teste do KRAS, assim como teste de outros componentes da via de transdução de sinal do EGFR MAPK (tais como BRAF), continuarão a ser avaliados em outros tipos de tumores e cenários clínicos. Além disso, à medida que outros componentes das vias metabólicas dos tumores forem descobertos, esses certamente serão perseguidos como possíveis fatores prognósticos e preditivos numa variedade de outros cânceres. Agradecimentos Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Nenhum autor declarou qualquer potencial conflito de interesse. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Notas de Rodapé 1 Joel A. Lefferts, Pós-doutorado, Patologia Molecular e Programa de Pesquisa Translacio-

5 nal, Departamento de Patologia, Dartmouth Medical School, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH. 2 Gregory J. Tsongalis, Diretor de Patologia Molecular e do Programa de Pesquisa Translacional, Departamento de Patologia, Dartmouth Medical School, Dartmouth-Hitchcock Medical Center and Norris Cotton Cancer Center, Lebanon, NH. 3 Genes humanos: ERBB2, v-erb-b2 homólogo do oncogene viral da leucemia eritroblástica 2, homólogo (aviário) do oncogene derivado do neuro/glioblastoma; KRAS, homólogo do oncogene viral do sarcoma de rato v-ki-ras2 Kirsten ; BRAF, homólogo do oncogene viral do sarcoma murina B1 v-raf. 4 Arief Suriawinata, Chefe da Seção de Patologia Anatômica, Professor Adjunto de Patologia, Departamento de Patoligia, Dartmouth- Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH. 5 William K. Funkhouser, Professor, Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial, Diretor de Patologia Anatômica e Cirúrgica, UNC Hospitals, University of North Carolina, Chapel Hill, NC. 6 Marc Ladanyi, Patologista Assistente e Chefe do Serviço de Diagnóstico Molecular, Departamento de Patologia, Membro, Programa de Patogênese e Oncologia Humana, Memorial Sloan- Kettering Cancer Center, New York, NY. 7 Jan A. Nowak, Diretor do Laboratório de Diagnóstico Molecular, Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial, Evanston Hospital NorthShore University HealthSystem, Evanston, IL. 8 J. Marc Pipas, Professor Adjunto, Departamento de Medicina, Diretor do Programa de Oncologia do GI, Dartmouth Medical School and Norris Cotton Cancer Center, Lebanon, NH. This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2010; 56 no , by permission of AACC. Original copyright 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry. Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2010; 56 no , por permissão da AACC. Cópia original 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,clinical Chemistry.