CONTAGEM DE Lactobacillus rhamnosus GG E DE BACTÉRIAS LÁCTEAS EM AMOSTRAS FECAIS ANTES E APÓS O CONSUMO DE SUCO PROBIÓTICO

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1 CONTAGEM DE Lactobacillus rhamnosus GG E DE BACTÉRIAS LÁCTEAS EM AMOSTRAS FECAIS ANTES E APÓS O CONSUMO DE SUCO PROBIÓTICO J.W. Canuto 1, B.A. Pires 1 ; R.C.A.B. Campos 1 ; D.C. de Oliveira 1 ; E.M.F. Martins 1 ; A.D.O. Martins 1, M.L. Martins 1 1- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais Campus Rio Pomba CEP: Rio Pomba MG Brasil, Telefone: (32) (johnwarnens@gmail.com.br) RESUMO Os probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. A estirpe de Lactobacillus rhamnosus GG tem sido muito estudada nos últimos anos por suas alegações de benefícios à saúde. Outras bases alimentícias, além de derivados lácteos, podem ser utilizadas como carreadores desses microrganismos, como, por exemplo, sucos de frutas. Entretanto, a viabilidade dos probióticos é dependente da matriz alimentar. Assim, este trabalho objetivou avaliar a resistência de L. rhamnosus GG ao trato gastrointestinal de 14 voluntários humanos quando veiculado por suco misto de juçara e abacaxi. Constatou-se que 5,0 log UFC/mL foi a menor contagem de L. rhamnosus GG nas fezes dos voluntários, após 28 dias de consumo do suco probiótico. Além disso, foi verificado um aumento médio da contagem de 1,9 log UFC/mL de bactérias láticas nas fezes. Portanto, a matriz vegetal avaliada foi eficiente como carreadora de L. rhamnosus GG. ABSTRACT Probiotics are live microorganisms which when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host. Lactobacillus rhamnosus GG strain has been studied in recent years for their claims of health benefits. Other food bases, besides dairy products, may be used as carriers of these microorganisms, for example, fruit juices. However, the viability of probiotics is dependent on the food matrix. This work aimed to evaluate the resistance of L. rhamnosus GG to the gastrointestinal tract of 14 human volunteers when juçara and pineapple mixed juice was used as vehicle. The lowest L. rhamnosus GG counts in feces of the volunteers, after 28 days of probiotic juice consumption, was 5.0 log CFU/mL. Furthermore, it was found an average increase of 1.9 log CFU/mL of lactic acid bacteria count in the feces. Therefore, the vegetable matrix evaluated was efficient as carrier of L. rhamnosus GG. PALAVRAS-CHAVE: suco, probiótico; estudo in vivo KEYWORDS: juice; probiotic; in vivo study 1. INTRODUÇÃO Os probióticos são definidos como microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Estes microrganismos são ingredientes alimentares que, quando consumidos, proporcionam equilíbrio da microbiota intestinal do consumidor. A ingestão desses alimentos proporcionam benefícios diversos,

2 principalmente, aqueles relacionados à preservação fisiológica das funções do trato gastrintestinal e do sistema imunológico (Davari et al., 2013; Wang et al., 2013; Cai, 2013; Giri, 2014). No organismo hospedeiro estas bactérias devem manter-se viáveis à passagem pelo trato gastrintestinal, ou seja, devem resistir às elevadas condições ácidas do estômago e à ação das enzimas e sais biliares no intestino delgado. Além disso, devem aderir às células intestinais, fixando-se no organismo, em que serão potencialmente benéficas (Ray e Dasgupta, 2014; Souza et al., 2010). Uma grande variedade de gêneros e espécies de microrganismos é considerada como potenciais probióticos e algumas já são utilizadas comercialmente em alimentos, destacando-se Lactobacillus e Bifidobacterium. A principal razão, além da capacidade de sobrevivência e adesão ao trato gastrintestinal, é que ambos têm uma longa história de uso seguro e são considerados como GRAS (geralmente reconhecido como seguro para consumo). Lactobacillus e Bifidobacterium também são habitantes dominantes no intestino humano, sendo Lactobacillus, no intestino delgado e Bifidobacterium, no intestino grosso (Tripathi e Giri, 2014). A estirpe L. rhamnosus GG vem chamando a atenção de pesquisadores em todo o mundo em função de possuir além das qualidades comuns a todos os probióticos outras características peculiares como a produção de pili e sortase que beneficiam a adesão ao intestino. L. rhamnosus GG (ATCC 53103) é estável à ação do ácido estomacal e da bile, produz ácido lático e tem uma grande avidez por células da mucosa intestinal humana. Desde o isolamento de L. rhamnosus GG, esta bactéria tem sido extensivamente estudada em relação aos benefícios para a saúde, sendo, atualmente, a bactéria probiótica mais estudada, havendo em torno de 800 estudos científicos já conduzidos com a mesma. Sua sequência genômica, também, está totalmente descrita (Silva et al., 1987; Doronet al., 2005) Os alimentos considerados carreadores eficientes de bactérias probióticas para o trato gastrintestinal humano são tradicionalmente os fermentados lácteos (Martins et al., 2015). Entretanto, outras bases alimentícias podem ser utilizadas como carreadores desses microrganismos. Em razão dos benefícios e da sua grande aceitação pelos consumidores, a matriz vegetal tem sido apresentada como uma boa alternativa para a veiculação de probióticos, em função de conter nutrientes como fibras, antioxidantes, açucares, dentre outros. Todavia, há na literatura divergências quanto à eficiência da matriz vegetal em ser carreadora destes microrganismos (Martins et al., 2013; Tirloni et al., 2014) Assim, a elaboração de suco probiótico com os frutos da palmeira juçara (Euterpe edulis Martius) pode ser uma opção para o desenvolvimento de bebida probiótica. Os frutos da juçara apresentam características que conferem a esta matriz grande potencial, como sua boa concentração de polifenois; o apelo que produtos naturais antioxidantes possuem para os consumidores; a ação destes compostos por diminuírem o estresse oxidativo, contribuindo para a preservação das bactérias probióticas; a necessidade de se criar alternativas que permitam a exploração sustentável dos recursos naturais da mata atlântica e, sobretudo, um mercado de alimentos receptivo a novidades com apelo ecológico e natural (Oliveira Junior e Neves; Junqueira, 2010; Lima et al., 2012; Cavalcanti, 2013). Contudo, é de grande relevância os estudos in vivo com a intenção de verificar a capacidade de L. rhamnosus GG resistir a passagem pelo trato gastrointestinal humano quando veiculado por produtos de origem vegetal. Assim, este trabalho objetivou avaliar a resistência gastrointestinal in vivo de L. rhamnosus GG adicionado à suco misto de abacaxi com juçara. 2. MATERIAL E MÉTODOS Para a obtenção do suco misto foram utilizados 50% de polpa de abacaxi e 45% de polpa dos frutos da palmeira juçara, além disso, foram adicionados 4,9% de açúcar, 0,1% de pectina e o ph do produto foi ajustado para 4,50. Após a formulação do suco, o produto foi pasteurizado a 88 C por 2 minutos, sendo utilizada como controle um frasco contendo o suco e termômetro para checagem da temperatura. Posteriormente, o produto foi resfriado a temperatura ambiente e adicionado da cultura probiótica.

3 Uma cápsula contendo células de L. rhamnosus GG liofilizado (Culturelle ) foi adicionada a 200 ml da formulação, sendo esta homogeneizada no suco e o produto incubado por 24 horas a 37 º C, caracterizando a fase de adaptação do microrganismo. Esta formulação foi denominada de pré-inóculo. Após o período de incubação, foram inoculados 10 ml do pré-inóculo em frascos contendo 200 ml de novo suco misto de abacaxi e juçara, os quais foram armazenados a 37 º C ± 0,5 º C por 72 horas. Posteriormente, o produto fermentado foi armazenado a 7 º C ± 0,5 º C por 28 dias, sendo os frascos destinados à realização das próximas etapas do trabalho. O suco misto obtido foi consumido diariamente (100 ml) por 14 indivíduos durante um período de 28 dias. Previamente ao início do consumo do suco (T0), amostras de fezes dos indivíduos voluntários foram coletas, bem como 28 dias após o consumo diário do produto (T28). Para a contagem de L. rhamnosus GG, as amostras foram diluídas em solução salina peptonada (0,85% de NaCl e 0,1% de peptona) e realizado o plaquemaneto em ágar LAMVAV acrescido de fluconazol. O meio LAMVAV modificado foi preparado a partir de três soluções (A, B e C), as quais foram, posteriormente, misturadas para elaboração final do meio. Solução A: ágar MRS (Merck, 68,2 g/l), cisteína-hcl (0,5 g/l) e púrpura de bromocresol (0,04 g/l). Esta solução teve o ph ajustado para 5,0 ± 0,1 utilizando ácido acético glacial P.A. Após o ajuste do ph, a solução foi autoclavada a 121 ºC/15 minutos. Solução B: cloridrato de vancomicina (Fluka Analytical), 1 mg/ml em água. Solução C: fluconazol (farmácia local), 40 mg/ml em água. As soluções B e C foram esterilizadas por filtração em filtro de 0,22 µm. Após a autoclavagem, a solução A foi deixada em banho-maria até a estabilização da temperatura em 50 ºC. O preparo final do meio foi realizado no momento do plaqueamento. O plaqueamento das duas amostras foi realizado utilizando a técnica de profundidade e as placas de Petri foram incubadas em microaerobiose a 37 C por 72 h. Após incubação, a contagem das unidades formadoras de colônia (UFC) foi computada para se determinar a população microbiana de bactérias láticas viáveis e L. rhamnosus GG nas amostras fecais. Para a diferenciação das colônias de L. rhamnosus GG das demais bactérias láticas, de três a cinco colônias foram isoladas e avaliadas quanto à coloração de Gram, morfologia e fermentação dos açúcares lactose, manitol e sacarose. Foram consideradas como colônias de L. rhamnosus GG as Gram-positivas, com morfologia idêntica à cultura pura desta bactéria, que foi usada como controle na coloração e, as que fermentavam apenas sacarose. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) envolvendo seres humanos do Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais sobre número RESULTADOS E DISCUSSÃO Constatou-se aumento médio de 1,89 ciclos logarítmicos na contagem padrão em placas de bactérias lácteas nas fezes dos voluntários após 28 dias de consumo do suco probiótico. Conforme demonstrado na figura 1, a contagem de L. rhamnosus GG nas amostras de fezes previamente ao consumo do suco pelos voluntários (T0) foi < 1,0 x 10 1 UFC/g e após 28 dias (T28) de consumo diário do suco, a menor contagem desta bactéria nas amostras fecais foi 5,0 Log UFC/g (voluntário 12). As contagens de bactérias lácteas iniciais estão relacionadas com a alimentação dos indivíduos e pode ser influenciada pelo consumo de alimentos probióticos. O aumento nas contagens de L. rhamnosus GG nas amostras de fezes após o consumo do suco probiótico demonstrou que esta bactéria foi resistente ao trato gastrointestinal, sendo assim capaz de conferir os benefícios alegados para esta estirpe. Constatou-se ainda que a contagem de L. rhamnosus GG nas amostras fecais variou de 10 5 a 10 9 UFC/g entre os indivíduos conforme mostra a Figura 1, o que pode estar relacionado às condições fisiológicas e aos hábitos de vida de cada um.

4 Figura 1: Contagem padrão em placas de L. rhamnosus GG e de bacterias lácteas nas amostras de fezes antes (T0) e após o consumo (T28) de suco misto probiótico de abacaxi com juçara. Menor contagem de Lactobacillus rhamnosus GG encontrada após 28 dias de consumo do suco probiótico 4. CONCLUSÃO A estirpe L. rhaminosus GG resistiu ao trato gastrointestinal de 14 indivíduos voluntários uma vez que foi constatada contagens acima de 10 5 UFC/g nas fezes dos mesmos após 28 dias de consumo do suco misto de juçara e abacaxi. Assim, a matriz vegetal utilizada como veículo para esta bactéria mostrou-se eficiente para carrear microrganismos probióticos, podendo ser considerada como alternativa à produtos lácteos com a mesma finalidade. 5. AGRADECIMENTOS A equipe agradece à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), ao Grupo PET Ciências Agrárias e ao Campus Rio Pomba do IF Sudeste MG pelo apoio financeiro. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Cavalcanti, R. N. (2013). Extração de antocianinas de resíduo de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) utilizando líquido pressurizado e fluido supercrítico: caracterização química, avaliação econômica e modelagem matemática. 78 f. (Tese de doutorado). Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.

5 Davari, S., Talaei, S. A., Alaei, H. & Salami, M. (2013). Probiotics treatment improves diabetesinduced impairment of synaptic activity and cognitive function: behavioral and electrophysiological proofs for microbiome-gut-brain axis. Neuroscience, 240, Doron, S., Snydman, D. R. & Gorbach, S. L. (2005). Lactobacillus GG: bacteriology and clinical applications. Gastroenterology Clinics of North America, 34(3), ,(ix), FAO. Food and Agricultive Organization of United Nations (FAO)/World Health Organization (WHO). (2001/2002). Evaluation of Health and Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation, Córdoba, Argentina. Martins, E. M. F., Ramos, A. M., Martins, M. L. & Rodrigues, M. Z. (2015). Research and Development of Probiotic Products from Vegetable Bases: A New Alternative for Consuming Functional Food. In: RAI, V. R.; BAI, J. A. Beneficial Microbes in Fermented and Functional Foods. Boca Raton, London: CRC Press. 1, Martins, E. M. F., Ramos, A. M., Vanzela, E. S. L., Stringheta, P. C., Pinto, C. L. O. & Martins, J. M. (2013). Products of vegetable origin: A new alternative for the consumption of probiotic bacteria. Food Research International, 51 ( 2), Silva, M., Jacobus, N., V, Deneke, C. & Gorbachl, S. L. (1987). Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, (8), , Oliveira Junior, C. J. F. De., Neves, Y. T. R. das & Junqueira, P. S. (2010). População caiçara, Mata Atlântica e situação atual do palmito-juçara (Euterpe edulis Martius) na região do Rio Una da Aldeia (Iguape-SP), entorno da Estação Ecológica Jureia-Itatins. Revista Árvore, 34 (6), Souza, F. S., Cocco, R. R., Sarni, R. O. S., Mallozi, M. C. & Solé, D. (2010) Prebióticos, probióticos e simbióticos na prevenção e tratamento das doenças alérgicas. Revista Paulista de Pediatria, 28(1), Ray, S. & Dasgupta, A. K. (2014).Probiotics as cheater cells: Parameter space clustering for individualized prescription. Journal of theoretical biology, 361C, Tirloni, E., Cattaneo, P.; Ripamonti, B., Agazzi, A., Bersani, C. & Stella, S. (2014). In vitro evaluation of Lactobacillus animalis SB310, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SB137 and their mixtures as potential bioprotective agents for raw meat. Food Control, 41, Tripathi, M. K. & Giri, S. K. (2014).Probiotic functional foods: Survival of probiotics during processing and storage. Journal of Functional Foods, v. 9, p Wang, X., Wang, S. & Cai, Z. (2013) The latest developments and applications of mass spectrometry in food-safety and quality analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 52, Wang, Y., Liu, Y.; Kirpich, I., Ma, Z., Wang, C., Zhang, M. & Feng, W. (2013).Lactobacillus rhamnosus GG reduces hepatic TNFα production and inflammation in chronic alcohol-induced liver injury. The Journal of nutritional biochemistry, 24 (9),