SOBREVIVÊNCIA DE Lactobacillus rhamnosus GG EM BEBIDA DE FRUTAS TROPICAIS APÓS SIMULAÇÃO IN VITRO DAS CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS

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1 SOBREVIVÊNCIA DE Lactobacillus rhamnosus GG EM BEBIDA DE FRUTAS TROPICAIS APÓS SIMULAÇÃO IN VITRO DAS CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS R.C.A.B. Campos 1, N.A. Costa 2, G.S. Oliveira 2, E.M.F. Martins 2, M.L. Martins 2, A.N.R. Campos 2 1- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais CEP: Rio Pomba MG Brasil, Telefone: (32) Fax: (32) (renata.campos@ifsudestemg.edu.br) 2- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais CEP: Rio Pomba MG Brasil, Telefone: (32) (natalyalmeida20@gmail.com) RESUMO Microrganismos probióticos são normalmente veiculados nos produtos lácteos, dificultando o consumo dos mesmos por indivíduos que não utilizam leite e derivados na alimentação. A introdução de probióticos em produtos não lácteos é uma alternativa para este público e a manutenção da sobrevivência destes em matriz vegetal é um desafio e exige testes de viabilidade. A taxa de sobrevivência de Lactobacillus rhamnosus GG veiculado em bebida mista de abacaxi e juçara após simulação das condições gastrointestinais foi alvo deste estudo. Após a elaboração da bebida, foram realizadas análises físico-químicas, assim como simulação in vitro das condições gastrointestinais durante os tempos 0h, 3 dias e a cada 7 dias durante 28 dias de vida útil do produto. Os resultados obtidos foram satisfatórios, pois esta taxa manteve-se acima de 70% ao longo do tempo de armazenamento da bebida, demonstrando que o comportamento dos microrganismos probióticos é dependente da estirpe e matriz carreadora. ABSTRACT Probiotic microorganisms are usually carried by dairy products, hindering their consumption by individuals who do not consume dairy products. The introduction of probiotics in non dairy products is an alternative to this public and maintenance its survival in the vegetable matrix is challenging and requires viability tests. The survival rate of Lactobacillus rhamnosus GG carried in mixed beverage of pineapple and juçara after simulated gastrointestinal conditions was the subject of this study. After preparation of the beverage, physicochemical analyzes were performed, as well as in vitro simulation of gastrointestinal conditions during the times 0h, 3 days and every 7 days for 28 days of the product's shelf life. The results were satisfactory, as this rate remained above 70% throughout the beverage storage time, demonstrating that the behavior of probiotic microorganisms is dependent on the strain and carrier matrix. PALAVRAS-CHAVE: frutas tropicais; probiótico; trato gastrointestinal; taxa de sobrevivência. KEYWORDS: tropical fruits; probiotic; gastrointestinal tract; survival rate. 1. INTRODUÇÃO Os microrganismos probióticos são disponibilizados em alimentos naturalmente fermentados como queijos, leites fermentados, iogurtes, manteiga; alimentos não fermentados

2 como sucos, biscoitos, barras de cereais, leite de soja, chocolate, entre outros; além de suplementos alimentares disponibilizados em tabletes, cápsulas e pílulas (Foligné et al., 2013). No entanto, os produtos lácteos fermentados ainda representam a maior parte dos produtos (Martins, 2013). Com o entendimento dos consumidores dos benefícios à saúde propiciados pelos alimentos funcionais que carreiam microrganismos probióticos (Gawkowski e Chikindas, 2013), além do crescente número de indivíduos intolerantes à lactose, dislipidêmicos, adeptos ao vegetarianismo e os que não ingerem produtos lácteos por questões de hábito, ganha notoriedade os produtos probióticos não lácteos (Vasudha e Mishra, 2013; Martins et al., 2015). A elaboração de novos produtos deve levar em consideração a viabilidade do microrganismo, sua funcionalidade durante o período de estocagem, além dos fatores intrínsecos e extrínsecos do próprio alimento (Guergoletto et al., 2010; Ranadheera; Baines; Adams, 2010; Mozzetti et al., 2013). A adição de culturas probióticas em base não láctea representa um desafio tecnológico, sobretudo com relação à sobrevivência destes microrganismos (Gawkowski e Chikindas, 2013). Para que o probiótico seja capaz de exercer efeitos benéficos à saúde, é necessário que a estirpe resista à passagem pelo trato gastrointestinal e atinja o intestino em números significativos. Os vegetais são fontes de vitamina C e vitaminas do complexo B, pró-vitamina A, fitosteróis, fibras, minerais e fitoquímicos necessários à dieta humana e também ao metabolismo microbiano (Gebbers, 2007). Dessa forma, apesar dos desafios tecnológicos, diversos estudos têm sido conduzidos com probióticos em matriz vegetal e as pesquisas buscam formas de proteção aos microrganismos, formas de apresentação do produto, estirpes adaptáveis, além de comprovação da viabilidade da cultura probiótica (Martins et al., 2015). A composição química das frutas, detentoras de elevadas concentrações de compostos bioativos benéficos à saúde, está sendo amplamente explorada. Dentre os componentes biologicamente ativos, os antioxidantes naturais são de grande interesse devido ao potencial terapêutico (Rufino et al., 2011). Os frutos da palmeira juçara (Euterpes edulis Mart.), planta nativa da Mata Atlântica, possuem elevado teor de compostos fenólicos, o que lhes confere considerável potencial antioxidante (Borges et al., 2013; Moreira, 2015). Associado aos benefícios da base vegetal, a veiculação da estirpe probiótica Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103; LGG) foi alvo deste estudo. Tal estirpe, isolada a partir do sistema digestivo humano por Barry R. Goldin e Sherwood L. Gorbach em 1983 tem despertado grande interesse da comunidade científica nas últimas décadas devido ao seu grande potencial probiótico e robustez tecnológica, além de maior resistência ao suco gástrico artificial e propriedades de adesão (Lee e Salminem, 2009; Reunanen et al., 2012). Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a taxa de sobrevivência de L. rhamnosus GG em bebida mista fermentada de abacaxi com juçara após simulação das condições do trato gastrointestinal. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Elaboração da bebida mista de abacaxi com juçara A bebida mista contendo 50% de polpa de abacaxi, 45% de polpa da juçara e 5% de açúcar foi elaborada a partir das polpas congeladas das frutas. Após a formulação da bebida, o produto foi pasteurizado a 88 C por 2 minutos e resfriado a 37 C, procedendo-se a adição da cultura probiótica liofilizada de L. rhamnosus GG (Culturelle ). Inicialmente, em 200 ml da formulação da bebida mista, foi adicionada uma cápsula contendo células de L. rhamnosus GG liofilizado. Esta formulação foi denominada pré-inóculo e foi incubada por 24 horas a 37 ºC, caracterizando a fase de adaptação do microrganismo. Após o período de incubação, foram inoculados 10 ml do pré-inóculo em frascos contendo 200 ml da bebida mista de abacaxi com juçara, os quais foram incubados a 36 ºC por 72 horas para

3 fermentação do produto. Após a fermentação, os frascos foram armazenados a 8 ºC por até 28 dias. Uma bebida controle, sem adição do probiótico foi formulada para análise comparativa Avaliação de ph e acidez total titulável As avaliações de ph e acidez total titulável foram realizadas segundo Zenebon e Pascuet (2008) com diluição de 1:10 da bebida mista em água destilada. O ph foi determinado por leitura direta do produto em phmetro digital. Para determinar a acidez por volumetria potenciométrica foi utilizada solução padrão de hidróxido de sódio 0,1 mol.l -1 até que o valor de ph atingisse 8,2-8,4 equivalente ao ponto de viragem do indicador fenolftaleína, finalizando a titulação. Em seguida, foi calculada a acidez em % de ácido cítrico Taxa de sobrevivência de L. rhamnosus GG sob simulação das condições gastrointestinais A simulação das condições gastrointestinais seguiu adaptação do modelo proposto por Bedani et al. (2013). Inicialmente, a bebida mista foi diluída em solução salina peptonada 0,1% em proporção de 1:10 e uma alíquota de 10 ml foi adicionada a nove frascos de reação. Para simulação da fase gástrica o ph foi ajustado em 2,0 2,5 com HCl 1 mol.l -1 e, posteriormente, foi adicionado a cada frasco 3,0 g.l -1 de pepsina e 0,9 mg.l -1 de lipase, respectivamente, procedendo a um período de incubação de 2 horas a 37 ºC sob agitação de 150 RPM em shaker. Passado o período de incubação, teve início a simulação do intestino delgado, onde o ph foi ajustado para 4,5 5,5, utilizando solução de fosfato de sódio ph 12 (150 ml de NaOH 1 mol.l -1 ; 14 g de NaH 2PO 4.2H 2O por litro de água destilada) contendo bile e pancreatina, na proporção de 10,0 g.l -1 e 1,0 g.l -1, respectivamente. Iniciou-se um novo período de incubação, nas mesmas condições citadas anteriormente. Após 4 horas do início do teste in vitro, foi simulado o intestino grosso, onde o ph foi ajustado para 6,5 7,5 com solução de fosfato de sódio ph 12 contendo bile (10,0 g.l -1 ) e pancreatina (1,0 g.l -1 ). Um terceiro período de incubação nas mesmas condições foi realizado, totalizando 6 horas de ensaio. Ao final de cada ciclo de incubação (2, 4 e 6 horas), os quais correspondem às simulações das fases gástrica e entéricas I e II, foi realizada cultura da amostra por plaqueamento em profundidade em Ágar MRS para verificar a viabilidade do probiótico após simulação das fases. As placas de petri foram incubadas a 37 ºC por 72 horas em jarras de anaerobiose. O teste foi realizado nos tempos 0, 3 e 28 dias contemplando o tempo de estocagem do produto em suas diferentes etapas (não fermentado e fermentado). Concomitante à simulação da sobrevivência ao trato gastrointestinal, a viabilidade do probiótico no produto elaborado foi determinada pela contagem em placas por diluição decimal e plaqueamento em Ágar MRS, com incubação a 37 ºC por 72 horas. A influência do tempo de estocagem na viabilidade do probiótico sob simulação das condições gastrointestinais foi calculada com base na taxa de sobrevivência segundo equação (E1) proposta por Guo et al. (2009). E1 Onde, N1 reporta a contagem padrão de bactérias viáveis da estirpe probiótica após exposição às condições gastrointestinais simuladas in vitro (6 h) e N0, a contagem padrão de bactérias viáveis da bebida no tempo zero (0 h).

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A adição do probiótico à bebida afetou, significativamente, os valores de ph e acidez titulável conforme mostra a Tabela 1. Ghosh et al. (2015) obtiveram resultados semelhantes ao produzir bebida fermentada de arroz, comportamento descrito pelos autores como favorável à adaptação de Lactobacillus fermentum KKL1 ao veículo utilizado. Tabela 1 Valores ph e acidez titulável das bebidas elaboradas ph Acidez titulável em ácido cítrico Bebida controle 4,1a 0,32a Bebida probiótica 3,4b 0,80b Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A bebida mista de abacaxi com juçara foi considerada uma excelente matriz carreadora da cultura probiótica L. rhamnosus GG, uma vez que a taxa de sobrevivência do microrganismo após a simulação das condições gastrointestinais ao longo do tempo de estocagem foi superior a 70% conforme mostra a Figura 1. Figura 1 - Taxa de sobrevivência de L. rhamnosus GG sob simulação das condições gastrointestinais. Resultado contrário foi obtido por Bedani et al. (2014), ao produzirem iogurte de okara saborizado com frutas tropicais como manga e goiaba. Ao final do tempo de estocagem, os autores obtiveram taxas de sobrevivência do probiótico L. acidophilus La-5 de 32,8% e 35,3%, respectivamente. Estes resultados foram inferiores a taxa de sobrevivência obtida para o iogurte de okara controle, que foi de 52,5%. Tal comportamento foi explicado por algum tipo de interferência negativa das polpas de frutas tropicais em relação à resistência do probiótico frente às condições gastrointestinais. A diferença do presente estudo para o de Bedani et al. (2014) pode estar nos valores de ph. A incorporação de estirpes probióticas em matrizes com baixo valor de ph, como as bebidas de frutas, pode afetar positivamente a resistência de tais microrganismos a situações de estresse ácido e, consequentemente, aumentar a taxa de sobrevivência frente ao estresse gastrointestinal (Elizaquível et al., 2011).

5 4. CONCLUSÕES A bebida mista de abacaxi com juçara é uma boa matriz carreadora de L. rhamnosus GG, uma vez que as taxas de sobrevivência ao longo de sua vida de prateleira foram elevadas na simulação das condições do trato gastrointestinal. O presente trabalho vem confirmar que o comportamento dos microrganismos probióticos são dependentes da estirpe e da matriz carreadora utilizada. 5. AGRADECIMENTOS À Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ao grupo PET Ciências Agrárias e ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, Campus Rio Pomba-MG pelo apoio financeiro. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bedani, R., Rossi, E. A. & Saad, S. M. I. (2013). Impact of inulin and okara on Lactobacillus acidophilus La-5 and Bifidobacterium animalis Bb-12 viability in a fermented soy product and probiotic survival under in vitro simulated gastrointestinal conditions. Food Microbiology, 34, Bedani, R., Vieira, A. D. S., Rossi, E. A. & Saad, S. M. I. (2014). Tropical fruit pulps decreased probiotic survival to in vitro gastrointestinal stress in symbiotic soy yoghurt with okara during storage. Food Science and Technology, 55, Borges, G. S. C., Gonzaga, L. V., Jardini, F. A., Filho, J. M., Heller, M., Micke, G., Costa, A. C. O. & Fett, R. (2013). Protective effect of Euterpe edulis M. on Vero cell culture and antioxidante evaluation based on phenolic using HPLC ESI-MS/MS. Food Research International, 51, Elizaquível, P., Sánchez, G., Salvador, A., Fiszman, S., Dueñas, M. T., López, P., Palencia, P. F. & Aznar, R. (2011). Evaluation of yogurt and various beverages as carriers of lactic acid bacteria producing 2-branched (1,3)-β-d-glucan. Journal of Dairy Science, doi: /jds, Foligné, B., Daniel, C. & Pot, B. (2013). Probiotics from research to market: the possibilities, risks and challenges. SciVerse Science Direct, 16, Gawkowski, D. & Chikindas, M. L. (2013). Non-dairy probiotic beverages: the next step into human health. Benefiacial Microbes, 4(2), Gebbers, J. O. (2007). Atherosclerosis, cholesterol, nutrition, and statins a critical review. German Medical Science, 5, Ghosh, K., Ray, M., Adak, A., Halder, S. K., Das, A., Jana, A., Parua (Mondal), S., Vágvölgyi, C., Das Mohapatra, P. K., Pati, B. R. & Mondal, K. C. (2015). Role of probiotic Lactobacillus fermentum KKL1 in the preparation of a rice based fermente beverage. Bioresource Techonology, 188, Guergoletto, K. B., Magnani, M., Martin, J. S., Andrade, C. G. T. J. & Garcia, S. (2010). Survival of Lactobacillus casei (LC-1) adhered to prebiotic vegetal fibers. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 11, Guo, A., Wang, J., Yan, L., Chen, W., Liu, X., & Zhang, H. (2009). In vitro comparison of probiotic properties of Lactobacillus casei Zhang, a potential new probiotic, with selected probiotic strains. Food Science and Technology, 42(10), Lee, Y. K. & Salminem, S. (2009). Handbook of probiotics and prebiotics. (2. ed.) Estados Unidos da América: Wiley. Martins, E. M. F., Ramos, A. M., Martins, M. L. & Rodrigues, M. Z. (2015). Research and development of probiotic products from vegetable bases: A New Alternative for Consuming

6 Functional Food. In: RAI, V. R.; BAI, J. A. (Eds.). Beneficial Microbes in Fermented and Functional Foods. Boca Raton, London: CRC Press. 1. ed., Martins, E. M. F., Ramos, A. M., Vanzela, E. S. L., Stringheta, P. C., Pinto, C. L. de O. & Martins, J. M. (2013). Products of vegetable origin: A new alternative for the consumption of probiotic bacteria. Food Research International, (51), Moreira, R. M. (2015). Desenvolvimento de suco misto probiótico a partir dos frutos da palmeira juçara e manga Ubá utilizando pasteurização e alta pressão isostática (Dissertação de mestrado). Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, Rio Pomba. Mozzetti, V., Grattepanche, F., Berger, B., Rezzonico, E., Arigoni, F. & Lacroix, C. (2013). Fast screening of Bifidobacterium longum sublethal stress conditions in a novel two-stage continuous culture strategy. Beneficial Microbes, 4, Ranadheera, R. D. C. S., Baines, S. K. & ADAMS, M. C. (2010). Importance of food in probiotic efficacy. Food Research International, 43, 1-7. Reunanen, J., Ossowski, I. von, Hendrickx, A. P. A., Palva, A. & Vos, W. M. (2012). Characterization of the SpaCBA pilus fibers in the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. Applied and Environmental Microbiology, Rufino, M. S. M., Alves, R. E., Fernandes, F. A. N. & Brito, E. S. (2011). Free radical scavenging behavior of tem exotic tropical fruits extracts. Food Research International, 44, Vasudha, S. & Mishra, H. N. (2013). Non dairy probiotic beverages. International Food Research Journal, 20(1), Zenebon, O. & Pascuet, N. S. (2008). Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos. (4. ed.) São Paulo: Instituto Adolfo Lutz.