DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE CONTAGEM DIFERENCIADA POR PLAQUEAMENTO PARA LINHAGENS PROBIÓTICAS PURAS E EM MISTURA

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1 DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE CONTAGEM DIFERENCIADA POR PLAQUEAMENTO PARA LINHAGENS PROBIÓTICAS PURAS E EM MISTURA L. R. CARMO, M. A. TEIXEIRA, J. G. L. F. ALVES e O. L. MONDRAGÓN-BERNAL Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciência dos Alimentos para contato: mariaandradeteixeira@posgrad.ufla.br, jlembi@dca.ufla.br RESUMO Alimentos funcionais podem conter diversos tipos de microrganismos probióticos na sua composição,porém de acordo com a legislação vigente eles devem estar em números elevados (>9 log UFC/mL de produto) ou atingir o intestino com no mínimo 7 log UFC de microrganismos vivos.para verificar essas quantidades de probióticos é necessário ter métodos fáceis e confiáveis de contagem individual ou diferenciada. O objetivo deste estudo foi aprimorar uma metodologia para quantificação diferenciada de probióticos quando cultivados em mistura.foram testados 5 corantesem solução aquosa 1% m/v (azul de anilina, safranina, murexedrina, vermelho de bromacresol e cristal violeta), adicionados em quantidade de 0,3 ml; 0,6 ml e 1 mlpor cada 100 ml de meio padrão MRS para contagem de Lactobacillus paracasei sp (LBC), Lactobacillus rhamnosussp (LR) e Bifidobacterium longum sp (BL). Não houve variação na identificação e quantificação das colônias em relação à quantidade dos corantes, sendo, portanto, selecionada a menor concentração.o crescimento de LR foi inibido em meio contendosafranina. Conclui-se que o método para contagem diferenciada de Lactobacillus em mistura poderá ser feito por plaqueamento simultâneo em MRS com azul de anilina e com safranina em condições aeróbias e anaeróbias. A contagem final de LR será a diferença entre a contagem em total em aerobiose de Lactobacillus em azul de anilina e a contagem em aerobiose de LBC em safranina. A contagem de BL será por diferença entre as contagens em MRS com azul de anilina em anaerobiose e em aerobiose. 1. INTRODUÇÃO Um alimento pode ser considerado funcional se for demonstrado que o mesmo pode afetar beneficamente uma ou mais funções alvo no corpo, além de possuir os adequados efeitos nutricionais, de maneira que seja tanto relevante para o bem-estar e a saúde quanto para a redução do risco de uma doença (ROBERFROID, 2002). Um alimento funcional podem conter diversos probióticos e as bactérias lácticas (BAL), especialmente lactobacilos e bifidobactérias. são os microrganismos probióticos mais comumente utilizados (MONDRAGÓN-BERNAL et al., 2012). As espécies Lactobacillus casei, Lactobacillusparacasei, e Lactobacillusrhamnosus, que compõem o grupo taxonômico Lactobacillus casei, apresentam comportamento fisiológico e

2 necessidades nutricionais muito similares, multiplicando-se em condições ambientais bastante semelhantes. Historicamente, a diferenciação entre cada uma das espécies pertencentes a esse grupo e a sua sistemática tem apresentado problemas e ajustes têm sido introduzidos baseados em novos métodos taxonômicos que foram se tornando disponíveis gradualmente (BUTIRI, 2005). O papel da alimentação nutricionalmente equilibrada na manutenção da saúde e prevenção de doenças tem despertado interesse pela comunidade científica que produz estudos com o intuito de comprovar a atuação de certos alimentos na prevenção de doenças. De acordo com a Resolução n l8 de 30/04/99, da Secretaria de Vigilância Sanitáriado Ministério da Saúde no Brasil, a definição legal de alimento funcional é: todo aquele alimento ou ingrediente que, além das funções nutricionais básicas, quando consumido como parte da dieta usual, produz efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica. Entre esses alimentos funcionais estão os probióticos (SANTOS, 2006). O termo probiótico é de origem grega e significa para a vida. Atualmente, de acordo com Legislação Brasileira, probiótico é definido como um suplemento alimentar microbiano vivo que afeta de maneira benéfica o organismo pela melhora no seu balançomicrobiano(anvisa, 2003). Os diferentes probióticos são estudados e comercializados na forma de preparações contendo um único ou uma combinação de micro-organismos. O probiótico deve se apresentar viável na preparação e manter essa viabilidade no ecossistema digestivo, condição indispensável para a sua atuação. Coloração diferencial é um termo geral que pode se referir a um número variado de processos específicos. Geralmente, é usado para descrever processos de coloração os quais usam mais que um corante. Usando-se múltiplos corantes pode-se diferenciar entre diferentes microrganismos ou estruturas e componentes celulares de um mesmo organismo ou de suas diferentes células (PELCZAR JR, 1996). Mondragón-Bernal (2004) desenvolveu uma técnica para contagem diferenciada para três linhagens probióticas em mistura, utilizando Agar MRS acrescido de azul de anilina 0,1% em condições de aerobiose e anaerobiose. Porém, quando L. rhamnosus foi adicionado à mistura não foi possível a diferenciação das linhagens de lactobacilos pela sua semelhança morfológica. O objetivo deste estudo foi aprimorar uma metodologia para quantificação diferenciada de probióticos quando cultivados em mistura por meio da adição ao Agar MRS de pigmentos diferentes a azul de anilina em diferentes concentrações. 2. MATERIAL E MÉTODOS Foram estudadas três linhagens de bactérias probióticas: Lactobacillusparacasei LBC-81, Lactobacillus rhamnosus LR-32 e Bifidobacterium longum BL-04, culturas liofilizadas e fornecidas pela Danisco Dupont. Para a técnica de diferenciação, foram testados 5 corantes em solução aquosa 1% m/v: azul de anilina, safranina, murexedrina, vermelho de bromacresol e cristal violeta. Para cada corante, foram testadas 3 concentrações em meio Agar MRS: 0,3 ml; 0,6 ml e 1 ml para cada 100 mlde meio.

3 Pesou-se diretamente os micro-organismos liofilizados e foram feitas as diluições em água peptonada(1%m/v), de acordo com a viabilidade de cada probiótico liofilizado. Após as diluições, volumes de 1mL de cada microrganismo foram plaqueados com o meio Agar MRS já adicionado de corantes, em triplicata e as placas foram incubadas a 37 C por 60 horas.as placas para contagem de bifidobactérias foram incubadas em jarras de anaerobiose, enquanto que as demais em incubadora BOD. As contagens foram feitas com auxílio de contador de colônias (Edulab, BRASIL). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O crescimento típico (placa padrão segundo Mondragón-Bernal, 2009) de colônias de L. rhamnosus em meio MRS acrescido de azul de anilina 0,1% pode ser observado na Figura 1. Figura 1. Lactobacillus rhamnosus placa padrão em meio Agar MRS acrescido do corante azul de anilina 0,01% (MONDRAGÓN-BERNAL, 2009) O teste da aplicação de diferentes concentrações de corantes como substitutos do azul de anilina nas placas para contagem padrão, mostrou que não houve nenhuma variação nas contagens nem na morfologia das colônias estudas, sendo, portanto escolhida a menor concentração analisada de 0,3 ml de corante para cada 100 ml de meio MRS. A presença do corante Cristal Violeta no meio de plaqueamento resultou na inibição do crescimento de todos os microrganismos testados, sendo ineficiente para o estudo, como pode ser observado na Figura 2, onde as placas não apresentam crescimento das colônias em mesma diluição utilizada para contagem padrão.

4 Figura 2. Da esquerda para direita: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei e Bifidobacterium longum em meio Agar MRS com corante cristal violeta. A aplicação do corante murexedrina, não mostrou nenhuma diferenciação das colônias nem das contagens, não sendo um método eficiente para os propósitos desse estudo, conforme pode ser observado na Figura 3. Figura 3. Da esquerda para a direita Bifidobacterium longum, Lactobacillus paracasei e Lactobacillusrhamnosusplaqueados com meio Agar MRS acrescido do corante muxedrina. A adição de vermelho de bromacresol diferenciou as colônias de Lactobacillus totais e Bifidobacterium, as primeiras ficam de cor verde e diâmetro 1mm e as bifidobactérias de cor branca, redondas e diâmetro inferior a 1mm, como observado na Figura 4.

5 Figura 4. Da direita para a esquerda Lactobacillusrhamnosus, Lactobacillusparacasei e Bifidobacterium longumplaqueados em meio Agar MRS acrescido do corante vermelho de bromacresol. O corante safranina adicionado ao meio MRS, inibiu somente o crescimento das colônias de Lactobacillus rhamnosus e o Lactobacillus paracasei (LBC) cresceu 85,07% em relação ao meio padrão. As contagens em triplicata do LBC em meio MRS padrão (com azul de anilina) e em meio MRS acrescido de safranina, incubadas em aerobiose, encontram-se na Tabela 1. A Safanina por tanto, mostrou-se como um corante eficiente para a diferenciação das colônias de Lactobacillus. Tabela 1. Contagem em placa de Lactobacillus paracasei em UFC/mL Contagem LBC (UFC/mL) Azul de anilina Safranina Repetição1 3,20x10 9 2,80x10 9 Repetição2 3,03x10 9 2,80x10 9 Repetição3 2,96x10 9 2,22x10 9 Média 3,06x10 9 ±0,10 2,60x10 9 ±0,27 A Figura 5, mostra o crescimento das colônias de BL, LBC e LR nas placas contendo o meio MRS com safranina, sendo que o BL e o LBC na diluição conhecida de crescimento (10-7 ), tiveram contagens aproximadas ao padrão e o LR não cresceu devido à inibição causada pela safranina.

6 Figura 5. Bifidobacterium longum, Lactobacillus paracasei e Lactobacillus rhamnosus plaqueados em Agar MRS acrescido do corante safranina. 4. CONCLUSÃO Não houve variação na identificação e quantificação das colônias em relação ao teor dos corantes, sendo, portanto, selecionada a menor concentração estudada.o crescimento de Lactobacillus rhamnosus foi inibido em meio com safranina. Conclui-se que o método para contagem diferenciada de Lactobacillus em mistura poderá ser feito por plaqueamento simultâneo em MRS com azul de anilina e com safranina em condições aeróbias e anaeróbias. A contagem final de Lactobacillus rhamnosus será a diferença entre a contagem total em aerobiose de Lactobacillus em azul de anilina e a contagem em aerobiose de Lactobacillus paracasei em safranina. A contagem de Bifidobacterium longum será por diferença entre as contagens em MRS com azul de anilina em anaerobiose e em aerobiose. 5. AGRADECIMENTOS Às agências financiadoras, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pela concessão da bolsa de mestrado e pelo auxílio financeiro para apresentação do trabalho, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelos auxílios prestados aos projetos de pesquisa realizados no Laboratório de Bioprocessos da Universidade Federal de Lavras. E à empresa Danisco Dupont pelas doações dos microrganismos utilizados na pesquisa.

7 6. REFERÊNCIAS BRASIL - Agência Nacional De Vigilância Sanitária ANVISA, Resolução RDC nº323 de l0 de novembro de Aprova o regulamento técnico de registro, alteração e revalidação de registro dos medicamentos probióticos. Disponível em: LOURENS-HATTINGH, A.; VILJOEN, B.C. Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal. v. 11, p. 1-17, MONDRAGÓN-BERNAL, O.L.; MAUGERI, F.F; ALVES, J.G.L.; RODRIGUES, M.I. Synbiotic Soy Beverages: Principles and Sensory Attributes. Capítulo 6, p Em: HUI, Y.H. Handbook of Plant-Based Fermented Foods and Beverages. SecondEdition. Crc Press, Taylor & Francis Group, 2012, 791p. MONDRAGÓN-BERNAL, O.L. Desenvolvimento de alimento simbiótico fermentado de soja. Campinas, 2009, 192p.. Tese (Doutorado em Engenharia de Alimentos). Faculdade de Engenharia de Alimentos. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). MONDRAGÓN-BERNAL, O.L. Desenvolvimento de uma bebida fermentada a partir de extrato hidrossolúvel de soja contendo agentes probióticos e probióticos. Campinas, 2004, 102p. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos). Faculdade de Engenharia de Alimentos. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). PELCZAR JR, Michael Joseph; CHAN, E.C.S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia conceitos e aplicações. Traducao: Celso Vataru Nakamura. São Paulo: Makron Books, p. ROBERFROID, M. Functional food concept and its application to prebiotics. Digestive and Liver Disease. v. 34, Suppl. 2, p , SAAD, S.M.I.; CRUZ, A.G.; FARIA, J.A.F. Probióticos e Prebióticos em Alimentos: Fundamentos e Aplicações Tecnológicas. 1ª ed. São Paulo: Livraria Varela, 671 p., SANTOS, E.F. et. al. Alimentos funcionais. Revista de Pesquisas Biológicas da UNIFEV, São Paulo, n l, p.l3-l9, jan./jul.2006.