Viabilidade de Lactobacillus casei 431 em derivados lácteos de leite ovino

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1 Viabilidade de Lactobacillus casei 431 em derivados lácteos de leite ovino Celso F. Balthazar 1, Alexandre H. Vieira², Janaína S. Nascimento 3, Adriano G. Cruz 3 1 Universidade Federal Fluminense (UFF), Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Vital Brazil Filho, 64, Niterói, , Rio de Janeiro, Brasil. celsofasura@id.uff.br 2 Instituto GPA - NATA, Rua Capitão Juvenal Figueredo sn, Colubande, São Gonçalo, Rio de Janeiro, Brasil. e- mail: a-hargreaves@hotmail.com 3 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Equipe de Alimentos, Rua Senador Furtado, 171, Maracanã, , Rio de Janeiro, Brasil. adriano.cruz@ifrj.edu.br RESUMO Os probióticos são microrganismos vivos, quando administrados em quantidades adequadas conferem saúde e bem estar ao hospedeiro. Desses alimentos e bebidas, os produtos lácteos, incluindo os sorvetes, são adicionados tipicamente com bactérias probióticas do gênero Lactobacillus. O objetivo deste experimento foi verificar a viabilidade do microrganismo sabidamente probiótico Lactobacillus casei 431, como crescimento e sua manutenção nos derivados lácteos de leite ovino, a saber, leite fermentado e sorvete, ao longo da estocagem. O leite ovino provou ser uma adequada matriz alimentar para o desenvolvimento de microrganismos probióticos em derivados lácteos, pois o crescimento do microrganismo foi 12 log UFC/g em todos os tratamentos e sua viabilidade permaneceu por 60 e 225 dias, respectivamente. ABSTRACT Probiotics are live microorganisms when administered in adequate amounts confer health and well being to the host. These foods and beverages, dairy products, including ice cream, are typically added with probiotic bacteria Lactobacillus genus. The objective of this experiment was to determine the viability of the known probiotic microorganism Lactobacillus casei 431, such as growth and maintenance in dairy products from sheep milk, as fermented milk and ice cream, along the storage. The sheep milk proved to be a proper food matrix for the development of probiotic microorganisms in dairy products because the growth of the microorganism was 12 log CFU / g in all treatments and viability remained for 60 and 225 days, respectively. Palavras-chave: acidez, probiótico, leite de ovelha. Keywords: acidity, probiotic, sheep milk. 1. Introdução Os probióticos são microrganismos vivos, quando administrados em quantidades adequadas conferem saúde e bem estar ao hospedeiro (FAO/WHO, 2001), prevenindo doenças (COSTA et al., 2013). Normalmente, os probióticos veiculados em alimentos são ativos no intestino, embora já fossem descritos outros locais de ação (Lenoir-WijnkooP et al., 2007). Os alimentos e as bebidas são veículos cada vez mais populares para o carreamento dos probióticos ao organismo, aumentando a opção de produtos na dieta humana. Desses alimentos e bebidas, os produtos lácteos, incluindo os sorvetes, são adicionados tipicamente com bactérias probióticas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium (Sanders; Marco,

2 2010). Dentre a família Lactobacilli, cepas pertencentes às espécies de L. acidophilus e L. casei são os mais frequentemente usados como probióticos (Granato et al., 2010). Vários efeitos benéficos à saúde foram atribuídos ao consumo de L. casei, incluindo inibição de organismos patogénicos, aumento das respostas imunológicas e melhora do sistema imunitário no trato digestivo (Nezhad et al., 2015). Culturas probióticas não modificam fortemente as características sensoriais de sorvetes e outras sobremesas congeladas e normalmente apresentam boa viabilidade durante o período de armazenamento do produto. Além disso, é importante confirmar se, após longos períodos de armazenamento, as culturas probióticas são ainda capazes de conferir os mesmos benefícios para a saúde já observados em outros alimentos com curta validade comercial e temperaturas de armazenamento mais elevadas, como iogurtes e leites fermentados (Cruz et al., 2009). O valor nutricional e a qualidade sensorial do iogurte são influenciados pela composição química do leite. O leite ovino é mais rico em gordura, proteínas, cinzas, cálcio, ferro, manganês, fósforo, zinco, ácidos gordos de cadeia média, ácidos gordos monoinsaturados, ácido linolénico, todos os aminoácidos essenciais e a maioria das vitaminas (exceto o caroteno) do que os leites bovino e caprino, transformando-o em um alimento de alto valor biológico e de alta digestibilidade, hipoalergenicidade e alcalinidade. Assim, o leite de ovelha e seus derivados lácteos, a partir do ponto de vista nutricional, promovem efeitos benéficos à saúde (Balthazar, 2014). O objetivo deste experimento foi verificar a viabilidade do microrganismo sabidamente probiótico Lactobacillus casei, como crescimento e sua manutenção nos derivados lácteos de leite ovino, leite fermentado e sorvete, ao longo da estocagem. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Processamento do leite fermentado e sorvetes de leite de ovelha A fim de se elaborar leite fermentado e sorvete de leite de ovelha contendo probiótico, leite de ovelha cru integral contendo 5% (v/v) de gordura (aproximadamente 13% (p/v) de extrato sólido desengordurado) foi obtido de um rebanho da raça Lacaune, localizado na região serrana do Estado do Rio de Janeiro. Na usina de leite do Núcleo Avançado de Educação em Tecnologia de Alimentos e Gestão de Cooperativismo (NATA, São Gonçalo/RJ, Brasil), o leite foi desnatado a 1,72 % (p/p) de gordura e tratado termicamente (72-75 C / 15 s) em pasteurizador a placas (BCISMINI, EQUILATI, São Paulo, Brasil). Para o processamento de leite fermentado foram elaborados dois tratamentos: leite fermentado de ovelha controle (LFOC) e leite fermentado de ovelha probiótico (LFOP). Ao LFOC foi adicionados 1 g/ 1L (p/v) Lactococcus lactis (6 log UFC/g, LR-35, Chr Hansen, Valinhos, SP, Brasil) e ao LFOP, 1 g/ 1L (p/v) de cultura probiótica de Lactobacilus casei (6 log UFC/g, L. casei 431, Chr Hansen, Valinhos, SP, Brasil), como orienta o fabricante. Em cada tratamento foram utilizados 2L de leite de ovelha semidesnatado (1,72 % p/v) (Brasil, 2011), submetidos à fermentação por 37 ±1 C por 12 horas até atingir o ph de 4,7-4,6 e armazenados a 5 ± 2 C, por 60 dias, em recipientes de polipropileno de 1L. Foram processados dois sorvetes: o sorvete de leite de ovelha convencional (SLOC), sem microrganismo probiótico; e o sorvete de leite de ovelha probiótico (SLOP), adicionado de bactéria probiótica. Em relação ao SLOP, foi adicionado 1 g/ 1L (p/v) Lactobacilus casei

3 (6 log UFC/g, L. casei 431, Chr Hansen, Valinhos, SP, Brasil), como orienta o fabricante, homogeneizado por cinco minutos com auxilio de um misturador e submetido a fermentação por 37 ±1 C por 12 horas, com objetivo de atingir ph de 4,7-4,6. Em ambos os processamentos foi utilizando equipamento de incorporação de ar descontínua para sorvetes (Arpifrio Pro 9, Santo André, SP, Brasil). Ao SLOP foi incorporado cultura probiótica contendo 0,1 % (p/v) L. casei (log 6 UFC/g) ao leite de ovelha desnatado a 0,33 % (p/v) de matéria gorda, sendo o restante do procedimento idêntico ao SLOC como descrito a seguir. Foram adicionados 10 % (p/p) de creme de leite de ovelha (40 % p/p gordura) ao leite desnatado de ovelha; estabilizante e emulsificante (0,99 % p/v) (Selecta, Duas Rodas, Jaraguá do Sul, Brasil), açúcar (14,75 % p/v) (UNIÃO Refinado, São Paulo, SP, Brasil) e essência de baunilha (0,01 % v/v) (Arcolor, São Paulo, SP, Brasil). As misturas para sorvete foram aquecidas a 50 C para dissolução dos ingredientes, sendo a essência de baunilha adicionada após o arrefecimento da mistura, estas misturas foram submetidas à maturação a 5 C ±2 por 24 h. A incorporação de ar foi ajustada para 45 %, 3 min, -5 C; o armazenamento a 18 C, por 250 dias, foi em recipientes de propileno de 200 ml cada Análises microbiológica, de ph e estatística A enumeração de L. lactis e L. casei foi utilizando o meio Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) agar (Lactobacillus MRS Agar M641, HiMedia Laboratories, Mumbai, India) incubado a 37 C ± 1 C por 72 h em condições de aerobiose para o primeiro microrganismo e anaerobiose para o segundo microrganismo. O valor de ph foi determinado através de potenciômetro digital (Model PG1800, Cap Lab, SP, Brazil) de acordo com AOAC International (2005). As analises foram realizadas em triplicata a cada semana por 28 dias. Os leites fermentados permaneceram estocados em refrigerador (5 ±2 C), enquanto os sorvetes foram estocados em freezer (-18 C) por 28 dias. Os dados foram tratados através de Análise de Variância (ANOVA) e Teste de Tukey ao nível de p < 0,05, utilizando o programa XLSTAT for Windows 2012 (Adinsoft, Paris, France). Todas as análises foram realizadas em triplicata. 3. Resultados e Discussões Durante o experimento, os leites fermentados (60 dias) e sorvete probiótico de leite d ovelha (225 dias) mantiveram contagens microbiológicas constantes (LFOC: 6 log UFC / ml; LFOP: 12 log UFC/mL; SLOP: 12 log UFC / g) e viabilidade probiótica, podendo-se dizer que o leite de ovelha provou ser uma matriz alimentar propícia ao crescimento de bactérias acido lácticas, assim como o iogurte prebiótico de leite de ovelha (Balthazar et al., 2016). A etapa de incorporação de ar no processamento do sorvete e o armazenamento não causaram diminuição significativa da viabilidade probiótica, como verificado por Di Criscio et al. (2010). De acordo com Bedani et al. (2013) os organismos probióticos devem estar presentes no alimento em concentrações mínimas de 6 log - 7 log UFC / g ou ml, sendo a dose terapêutica diária cerca de 8-9 log UFC / g ou ml. Tais números elevados foram sugeridos para compensar as perdas possíveis nos números dos organismos probióticos durante a passagem através do estômago e intestino. Entretanto, a International Dairy Federation (IDF, 1992) sugeriu um mínimo de 7 log células bactérianas probióticas por grama do produto devem estar viáveis na época do consumo e a ANVISA, log 8 a log 9 UFC / g ou ml (Brasil, 2008). Assim, o leite

4 fermentado de ovelha (LFOP) semidesnatado e sorvete de leite de ovelha probióticos (SLOP) apresentaram contagens superiores às citadas e, portanto os mesmos podem ser considerados alimentos funcionais que proporcionarão benefícios inerentes aquele microrganismo utilizado aos consumidores que os ingerirem durante o período de 28 dias (Nezhad et al., 2015). No entanto, acredita-se que o SLOP tenha potencial probiótico por três a quatro meses, pois foi demonstrado por Homayouni et al. (2008) e Di Criscio et al. (2010), em sorvete probióico de leite bovino, contagens superiores a 6 log de L. casei ao final do período de armazenamento. Segundo Di Criscio, o armazenamento a temperatura de -20 C não interfere negativamente na sobrevivencia do L. casei, como foi verificado no presente estudo. De acordo com a Figura 1, o ph do LFOP (3,99 3,71) foi significativamente menor que o do LFOC (4,31 4,30) durante o período de estocagem (p < 0,05), logo supõe-se que o L. casei possui maior poder de acidificação do meio que o L. lactis. O ph do LFOC permaneceu inalterado durante a estocagem (60 dias), demonstrado que o L. lactis não possui capacidade de pós acidificação do produto durante a estocagem. Contudo, houve uma diminuição significativa do ph em LFOP entre o 1 (ph 3,99) e o 15 (ph 3,75) dias de estocagem (p < 0,05), indicando uma possível pós acidificação realizada pelo L. casei durante a primeira quinzena de estocagem, provavelmente relacionada ao choque pelo frio (Nezhad et al., 2015). O mesmo não foi verificado para cultura de L. casei no ambiente sorvete, pois seu ph permaneceu constante durante a estocagem (SLOP: ph 5,45), devido a diminuição do metabolismo das células probióticas a temperatura extremamente baixa (-18 C) (Cruz et al., 2009), visto que sua contagem permaneceu constante (12 log UFC/g). Microrganismos probióticos conseguem sobreviver durante um longo período a temperaturas de congelamento. No entanto, a membrana celular do probiótico é danificada pelo processo de congelamento, levando a injurias que comprometem a atividade metabólica vital da célula, reduzindo-a ou interrompendo-a (Akin et al., 2007; Tripathi; Giri, 2014). O SLOC também não apresentou variação de ph durante a estocagem e seu ph (6,81) foi significativamente maior que o SLOP (p < 0,05), considerado dentro da faixa de ph do próprio leite de ovelha (Bathazar et al., 2015; Park et al., 2007). Resultado este já esperado, tendo em vista que o mesmo não possuía microrganismos ou ingredientes capazes de ocasionar uma queda significativa no ph, como é o caso dos outros derivados de leite de ovelha mencionados anteriormente. Entretanto, no 225 dia, houve diminuição significativa do ph do SLOC (6,73; p < 0,05), o que foi atribuído ao início da deterioração do produto, determinando o fim do experimento. 4. Conclusão A cultura probiótica utilizada no experimento, Lactobacillus casei 431, demonstrou excepcional crescimento e manutenção nos derivados lácteos elaborados, atingindo a concentrações superiores as estipuladas para probióticos em alimentos como determinado pela literatura e legislações. Assim, o leite ovino provou ser uma adequada matriz alimentar para o desenvolvimento de microrganismos probióticos. Devido ao sorvete ser um alimento que mantém suas características próprias para consumo por um longo período, o mesmo demonstra potencial como carreador de probióticos por mais de sete meses, ao contrário do leite fermentado. Logo, sugere-se novos estudos utilizando-se concentrações iniciais do microrganismo probiótico inferiores ao recomendado pelo fabricante para verificar seu crescimento durante a fermentação, viabilidade durante o processamento e armazenamento do sorvete. 5. Bibliografia Akin, M. B., Akin, M. S., & Kirmaci, Z. (2007). Effects of inulin and sugar levels on the viability of yogurt and probiotic bacteria and the physical and sensory characteristics in probiotic icecream. Food Chemistry, 104, AOAC International. (2005). Official Methods of Analysis. 18th ed. AOAC International, Gaithersburg, MD.

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6 Figura 1 - Comportamento do ph dos leites fermentados de ovelha controle (LFOC) e probiótico (LFOP); sorvete de leite de ovelha convencional (SLOC) e probiótico (SLOP) e sorvete de leite de ovelha controle (SLOC) durante o armazenamento de 60 e 225 dias, respectivamente. 7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 ph 5,50 5,25 5,00 4,75 4,50 4,25 4,00 3,75 3, Dias LFOC LFOP SLOC SLOP