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1 VIABILIDADE DE MICRORGANISMO PROBIÓTICO COMERCIAL EM ALIMENTO LÁCTEO NÃO- FERMENTADO REFRIGERADO ELABORADO COM INGREDIENTES OBTIDOS DA CASCA DE JABUTICABA M. C. de Sousa 1,2, M. C. Almeida Neta 1,2, R. L. J. Almeida 2, A. P. R. Queiroga 2, E. R. Florentino 2, F. C. Alonso Buriti 1,2 1 Universidade Estadual da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Rua Juvêncio Arruda s/n CEP: Campina Grande PB Brasil, Telefone: (83) Universidade Estadual da Paraíba, Núcleo de Pesquisa e Extensão em Alimentos, Rua Juvêncio Arruda s/n CEP: Campina Grande PB Brasil, Telefone: (83) Fax: (83) marinacinthia@hotmail.com RESUMO este trabalho avaliou a viabilidade do microrganismo probiótico comercial Lactobacillus rhamnosus LR32 em alimento lácteo não-fermentado refrigerado elaborado com ingredientes obtidos da casca da jabuticaba: calda para cobertura (topping) e incorporação à base láctea, bem como o extrato hidroalcoólico, também incorporado à base láctea. Os alimentos lácteos refrigerados a 4 ± 1 C foram analisados após 1, 7, 14 e 21 dias de armazenamento para a determinação de L. rhamnosus e dos microrganismos indicadores sanitários. Houve uma redução da viabilidade do probiótico no produto final (população de 7,23 log UFC g -1 após 1 dia) em relação à população encontrada no inóculo (média de 9,87 log UFC g -1 ). Contudo, a população deste microrganismo esteve dentro dos parâmetros recomendados para microrganismos probióticos em alimentos (entre 6 a 7 log UFC g -1 ). Os indicadores microbiológicos sanitários estudados apresentaram valores dentro dos limites estabelecidos pela legislação brasileira. ABSTRACT this study evaluated the viability of the probiotic microorganism Lactobacillus rhamnosus LR32 in a non-fermented and refrigerated dairy dessert prepared with ingredients from the jaboticaba peel: syrup used as topping and incorporated into the milk base plus the hydroalcoholic extract also incorporated into the dairy base. The dairy desserts stored at 4 ± 1 C were analyzed after 1, 7, 14 and 21 days storage for obtaining the microbiological results of L. rhamnosus and the sanitary indicators. The viability of L. rhamnosus reduced in the final product (population of 7.23 CFU g -1 in the first day) compared to the population found in the inoculum (average of 9.87 log CFU g -1 ). However, these populations were within the parameters recommended for probiotic microorganisms in food products (between 6 to 7 log CFU g -1 ). The microbial indicators of sanitary quality studied were within the limits established by the Brazilian legislation. PALAVRAS-CHAVE: probiótico; microrganismo; alimento lácteo; casca de jabuticaba. KEYWORDS: probiotic; microorganism; dairy food; jaboticaba peel.

2 1. INTRODUÇÃO Os alimentos funcionais têm por objetivo o reforço da dieta através de substâncias que fornecem benefícios adicionais aos da alimentação habitual do consumidor, podendo reduzir o risco de doenças (Moraes e Colla, 2006). O desenvolvimento de produtos que proporcionam efeitos benéficos na saúde tem sido uma tendência que reflete o aumento da aceitação do papel da dieta na redução dos riscos de doenças crônicas. Nos últimos anos, tem havido um aumento do interesse da indústria de alimentos na incorporação de ingredientes com propriedades benéficas à saúde (Del Ré e Jorge, 2012).. Os alimentos funcionais fizeram parte de uma concepção de alimentos, lançada pelo Japão na década de 80, através de um programa de governo que tinha como objetivo desenvolver alimentos saudáveis para uma população que envelhecia e apresentava uma grande expectativa de vida (Anjo, 2004). Os alimentos funcionais contêm probióticos, microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde como atividade antimicrobiana e antimutagênica, propriedades anticancerígenas, propriedades anti-hipertensivas, efeitos benéficos sobre o metabolismo mineral, especialmente em relação à estabilidade óssea, atenuação de sintomas de doença do intestino e síndrome de Crohn, redução dos sintomas de alergias alimentares, redução dos níveis de colesterol ligado à lipoproteína de baixa densidade (LDL-colesterol), supressão de patógenos, além dos efeitos nutricionais em geral (Granato et al., 2010). Os produtos lácteos destacam-se como o principal veículo para suplementação de microrganismos probióticos. Na elaboração de alimentos probióticos é necessário que haja compatibilidade e adaptabilidade entre as cepas selecionadas e o veículo utilizado, boas propriedades sensoriais, e que as culturas probióticas alcancem uma concentração apropriada durante o armazenamento (usualmente de 10 6 a 10 7 UFC g -1 ou ml), de modo que cheguem ao consumidor, aptas a desenvolverem os efeitos funcionais esperados de forma segura e eficaz (Komatsu et al., 2008). Os antioxidantes naturais apresentam-se como uma alternativa para prevenir a deterioração oxidativa dos alimentos e minimizar os danos oxidativos nos seres vivos já que aqueles sintéticos empregados na indústria de alimentos ou de uso farmacêutico têm sido questionados quanto à inocuidade (Del Ré e Jorge, 2012). Os compostos fenólicos, formados no metabolismo secundário dos vegetais, reagem no organismo animal, com radicais livres, formando radicais estáveis. Estudos atribuem aos compostos fenólicos o aumento do gasto energético, redução da oxidação lipídica, diminuição de doenças cardiovasculares e redução de aparecimento de câncer (Alves et al., 2012). Estudos demonstram que a casca da jabuticaba (Myrciaria cauliflora), produto natural de alta qualidade com duplo benefício à saúde, de alto valor nutricional e propriedades funcionais antioxidantes, origina novo conceito na indústria alimentícia, onde a casca da jabuticaba, descartada como resíduo, desponta como importante produto, pois contêm substâncias de alto valor agregado (Silva, 2012). As bactérias láticas são reconhecidas como um dos grupos de microrganismos mais importantes para o homem tanto pelo papel que exerce na produção e preservação dos alimentos quanto benefícios em diferentes aspectos da saúde humana (Ferreira, 2012). Este trabalho avaliou a viabilidade do microrganismo probiótico Lactobacillus rhamnosus e investigou a presença de contaminantes em alimento lácteo não-fermentado refrigerado, tipo sobremesa, elaborado com ingredientes obtidos da casca de jabuticaba, adicionado do referido microrganismo probiótico. 2. MATERIAIS E MÉTODOS As jabuticabas obtidas foram lavadas, sanitizadas e despolpadas manualmente. Das cascas, foi obtido o extrato aquoso com 25% de sólidos solúveis, usado para produção de calda (topping) e

3 incorporação à base láctea. Parte do resíduo triturado foi utilizado para a obtenção do extrato hidroalcoólico, também incorporado na base láctea. A preparação da base láctea da sobremesa foi adaptada de Correia (2006), utilizando-se amido de milho, leite em pó, ácido lático, açúcar, água, calda e pectina. O amido foi previamente dissolvido em parte da água por meio do agitador magnético. A pectina foi solubilizada aos poucos no leite e adicionada aos demais ingredientes. O ácido lático foi adicionado antes do cozimento. O açúcar foi acrescentado quando a temperatura da base láctea atingiu 65 C durante o aquecimento. A base láctea foi aquecida a 85 C para cocção do amido e aumento da consistência. Antes de desligar o aquecimento a calda foi incorporada à base láctea. Durante o resfriamento, quando a temperatura da base láctea atingiu 40 C, colocou-se o corante carmim cochonilha e o extrato hidroalcoólico. Ao atingir a temperatura de 37 C, foi adicionado 10 ml de leite contendo o inóculo da cultura de Lactobacillus rhamnosus LR32 (DuPont), previamente ativado por 2 h nesta mesma temperatura. A base láctea foi acondicionada em embalagens de polipropileno, com tampa, contendo a calda utilizada como acompanhamento e cobertura. Cada pote continha 85 g de base láctea e 15g de calda. Os alimentos lácteos foram mantidos sob refrigeração a 4 ± 1 C e analisados após 1, 7, 14 e 21 dias de armazenamento para a realizaão das análises microbiológicas. Decorridos o tempo de armazenamento, porções de 25 g do produto foram homogeneizadas com 225 g de solução salina a 0,85% (em condições de assepsia). Diluições decimais seriadas subsequentes foram preparadas usando o mesmo diluente. Foram realizadas as determinações de L. rhamnosus., segundo Correia (2006), coliformes a 35 C, coliformes a 45 C e bolores e leveduras segundo os métodos analíticos oficiais para alimentos de origem animal (Brasil, 2003), além de Staphylococcus coagulase positiva (Himedia, 2015). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da viabilidade de L. rhamnosus obtidos para o inóculo são apresentados na Tabela 1. Considerou-se que a incubação das culturas em leite antes da adição à sobremesa proporcionou desenvolvimento adequado ao microrganismo, uma vez que a viabilidade foi superior a 9 log UFC ml -1. Esta viabilidade média da cultura no inóculo serviu de referência para estimar as possíveis perdas das populações de L. rhamnosus no produto final e nos dias subsequentes de amostragem. Tabela 1 Viabilidade de Lactobacillus rhamnosus (log UFC ml -1 ) no inóculo. Valores médios (desvio-padrão entre parênteses) e respectiva variação (valor mínimo e máximo observado). Lactobacillus rhamnosus (log UFC ml -1 ) Média (DP) Variação 9,87 (0,89) 9,05-11,39 Fonte: dados de pesquisa. Considerando que cada lote do produto rendeu mais de 1 kg e que 10 ml do inóculo continham entre 10 e 12 log UFC, esperava-se que o produto final contivesse 8 log UFC g -1 do probiótico, em média. No entanto, o produto no primeiro dia de armazenamento refrigerado apresentou 7,23 log. UFC g -1, conforme os dados apresentados na Tabela 2, cerca de 0,8 ciclo log inferior ao esperado. Os valores observados no primeiro dia, portanto, demonstraram uma redução de viabilidade em relação à população encontrada no inóculo. A perda observada na viabilidade de L. rhamnosus provavelmente está relacionada à ambientação da cultura aos componentes e ph da formulação e às condições de armazenamento.

4 Tabela 2 Viabilidade de L. rhamnosus nas sobremesas ao longo do armazenamento refrigerado de 21 dias. Tempo (dias) Fonte: dados de pesquisa. Lactobacillus rhamnosus (log UFC g -1 ) Média Desvio Padrão 1 7,23 0,83 7 6,30 0, ,30 0, ,30 0,08 Contudo, a população esteve dentro dos parâmetros considerados para microrganismos probióticos em alimentos, conforme proposto pela literatura, a qual informa que para obter os benefícios atribuídos a esses microrganismos, a dose mínima diária deve ser de 8 a 9 log UFC, o que corresponde ao consumo diário de 100 g de alimento contendo de 6 a 7 log UFC g -1 (Komatsu et al., 2008). No caso específico de sobremesas lácteas, segundo os padrões adotados no Brasil, considera-se 120 g o tamanho de referência da porção de cada ocasião de consumo (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2003). Considerando a viabilidade dos microrganismos ao longo do armazenamento, houve um pequeno decréscimo da população média de L. rhamnosus no sétimo dia de análise no tratamento, sendo os valores mantidos até dia o vigésimo primeiro dia. Em trabalho realizado por Heenan et al. (2004), com sobremesa gelada vegetariana não fermentada, foi observado que durante seis meses, as culturas incorporadas à formulação - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Bifidobacterium lactis e L. rhamnosus - sobreviveram ao armazenamento com populações iguais ou acima de 10 7 UFC g -1. Costa (2014) desenvolveu um sorvete simbiótico de açaí e estudou, entre outras características, a viabilidade de L. rhamnosus GG ao longo de seu armazenamento a -18 por até 112 dias. Naquele estudo, as populações do microrganismo se mantiveram estáveis e entre 8 e 9 log UFC g -1 para todas as formulações, durante todo período de armazenamento, corroborando com estudo realizado por Paula (2012) que verificou a viabilidade de cepas potencialmente probióticas de L. rhamnosus e L. paracasei em sorvetes com leite de cabra e polpa de cajá. Neste último estudo, todas as formulações apresentaram populações médias de Lactobacillus spp. acima de 8 log UFC g -1 e estáveis durante 84 dias de armazenamento a -18 C, apesar dos valores de ph dos sorvetes serem inferiores a 4,5. Os resultados das análises de qualidade sanitária para coliformes a 35 C, Staphylococcus coagulase positiva, bem como bolores e leveduras para os dois lotes de sobremesa ao longo do armazenamento refrigerado são exibidos na Tabela 3. Nos dois lotes produzidos da sobremesa, resultados de coliformes a 35 C foram inferiores a 3 NMP g -1, portanto, abaixo do limite de detecção do método utilizado. Dessa forma, não foram detectados coliformes a 45 C em nenhuma das amostras analisadas. Para Staphylococcus coagulase positiva, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2001) estabelece que a população desse microrganismo em sobremesas lácteas pasteurizadas refrigeradas não deve ultrapassar UFC g -1. Portanto, os resultados deste estudo atenderam para esse microrganismo estando dentro do exigido pela legislação vigente.

5 Tabela 3 Análise microbiológica de contaminantes para as sobremesas lácteas probióticas contendo L. rhamnosus ao longo do armazenamento refrigerado. Parâmetro Coliformes totais (NMP g -1 ) Staphylococcus coagulase positiva (UFC g -1 ) Bolores e leveduras (UFC g -1 ) Tempo (dias) Variação (Valores mínimos máximos) 1 <3 7 n.d. 14 n.d. 21 n.d. 1 <100 - < <100 - < <100 - < < <100 - < <100 - < <100 - < < NMP = número mais provável; n.d. = não determinado (as análises de coliformes totais não foram efetuadas a partir do sétimo dia de armazenamento por terem sido inferiores a 3 NMP ml -1 no primeiro dia). Fonte: dados de pesquisa. A legislação brasileira não estabelece limites de bolores e leveduras em sobremesas lácteas. No entanto, este parâmetro foi avaliado devido às condições ambientais que podem favorecer a presença desses micro-organismos nos produtos. No presente estudo, populações de bolores e leveduras iguais ou superiores a 10 3 foram observadas apenas em amostras aos 21 dias. Buriti et al. (2010), em um estudo sobre o perfil de textura e características sensoriais de mousses de goiaba contendo a cepa probiótica Lactobacillus acidophilus La-5 e a fibra prebiótica oligofrutose, verificaram a presença de bolores e leveduras em algumas amostras, porém não superior a UFC g -1, ao longo de 21 dias de armazenamento. Naquele estudo, os resultados de coliformes totais e Staphylococcus coagulase positiva estavam dentro dos limites estabelecidos pela legislação brasileira. 4. CONCLUSÕES Os resultados obtidos nos dois lotes de alimento lácteo de jabuticaba com potencial probiótico adicionado de L. rhamnosus LR32 mostram que, apesar da redução de viabilidade do probiótico no produto final em relação às populações encontradas no inóculo, ao longo de todo armazenamento tais populações ainda permaneceram dentro dos parâmetros recomendados pela literatura para microrganismos probióticos em alimentos. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Pessoal de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES) e Fundação Parque Tecnológico da Paraíba (PaqTcPB) pelo auxílio financeiro e ao Núcleo de Pesquisa e Extensão em Alimentos (NUPEA/UEPB) pela colaboração nas análises do presente estudo. Os autores também

6 agradecem à empresa DuPont pela pectina e pela cultura de L. rhamnosus, bem como à empresa Purac Sínteses pelo ácido lático alimentício cedido à pesquisa. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2001). Aprova o Regulamento Técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos (RDC nº 12 de 02 de janeiro de 2001). Diário Oficial da União. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2003). Regulamento técnico de porções de alimentos embalados para fins de rotulagem nutricional (RDC nº 359, de 23 de dezembro de 2003). Diário Oficial da União. Alves, A. P. C., Corrêa, A. D., Marques, T. R., Ramos, V. O., Simão, A. A., & Lage, F. F. (2012). Compostos fenólicos e potencial antioxidante de diferentes extratos de farinha de cascas de jabuticaba. In Anais do 52 o Congresso Brasileiro De Química, Recife, Brasil. Anjo, D. F. C. (2004). Alimentos funcionais em angiologia e cirurgia vascular. Jornal Vascular Brasileiro, Porto Alegre, v. 3, n. 2, p Buriti, F. C. A., Castro, I. A., & Saad, S. M. I. (2010). Effects of refrigeration, freezing and replacement of milk fat by inulin and whey protein concentrate on texture profile and sensory acceptance of synbiotic guava mousses. Food Chemistry, 123, Costa, M. G. M. (2014). Desenvolvimento de sorvete simbiótico de açaí (Euterpe oleracea) com Lactobacillus rhamnosus GG e resistência do probiótico em um modelo de digestão gastrintestinal in vitro (Tese de doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. Del Ré, P. V., & Jorge, N. (2012) Especiarias como antioxidantes naturais: aplicações em alimentos e implicação na saúde. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, 14(2), Noonan, W. P., & Noonan, C. (2004). Legal requirements for functional foods claims. Toxicology Letters, 150, Ferreira, C. L. L. F. (2012). Prebioticos e probioticos: atualização e prospecção. Rio de Janeiro: Editora Rubio. Granato, D., Branco, G. F., Cruz, A. G., Faria, J. D. F., & Shah, N. P. (2004). Probiotic dairy products as functional foods. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 9, Heenan, C. N., Adams, M. C., Hoskena, R. W., & Fleet, G. H. (2004). Survival and sensory acceptability of probiotic microorganisms in a nonfermented frozen vegetarian dessert. LWT-Food Science and Technology, 37, Himedia. (2015). Manitol salt agar (Technical Data M118). Mumbai, India. Komatsu, T. R., Buriti, F. C. A., & Saad, S. M. I. (2008). Inovação, persistência e criatividade superando barreiras no desenvolvimento de alimentos probióticos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 44(3), Moraes, F. P., & Colla, L. M. (2006). Alimentos funcionais e nutracêuticos: definições, legislação e benefícios à saúde. Revista Eletrônica de Farmácia, 3(2), Pacheco, M. T. B., & Sgarbieri, V.C. (2003). Alimentos funcionais. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos. Paula, C. M. (2012). Utilização de bactérias do grupo Lactobacillus casei no desenvolvimento de sorvete potencialmente probiótico de leite de cabra e polpa de cajá (Spondias mombin) (Dissertação de mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. Silva, M. C. (2012). Aproveitamento do resíduo de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) para obtenção de pigmentos com propriedades funcionais (Dissertação de mestrado). Departamento de Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga.