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1 VIABILIDADE DE CULTURA NATIVA POTENCIALMENTE PROBIÓTICA EM BEBIDA LÁCTEA FERMENTADA CONTENDO PRODUTOS DA CASCA DE JABUTICABA E SUA INFLUÊNCIA SOBRE A CULTURA STARTER M. C. Almeida Neta 1,2, M. C. de Sousa 1,2, R. L. J. Almeida 2, A. P. R. Queiroga 2, E. R. Florentino 2, F. C. Alonso Buriti 1,2 1 Universidade Estadual da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Rua Juvêncio Arruda s/n CEP: Campina Grande PB Brasil, Telefone: (83) Universidade Estadual da Paraíba, Núcleo de Pesquisa e Extensão em Alimentos, Rua Juvêncio Arruda s/n CEP: Campina Grande PB Brasil, Telefone: (83) Fax: (83) carmelianeta20@hotmail.com RESUMO objetivou-se estudar a viabilidade de uma cultura nativa potencialmente probiótica de Lactobacillus plantarum (CNPC003) e sua influência sobre o comportamento do microrganismo starter (Streptococcus themophilus TA40) em bebidas lácteas fermentadas contendo produtos da casca de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) em comparação a uma cultura potencialmente probiótica comercial (Lactobacillus rhamnosus LR32). O probiótico comercial e a cultura nativa não interferiram no desempenho de S. thermophilus nas bebidas uma vez que a viabilidade deste microrganismo foi superior a 8,8 log UFC/g nos três tratamentos estudados durante o armazenamento sob refrigeração (4 C) de 21 dias. As culturas L. rhamnosus LR32 e L. plantarum CNPC003, ao longo de todo o armazenamento das bebidas T2 e T3, respectivamente, apresentaram viabilidade suficiente para garantir potencial probiótico a estas formulações, com contagens superiores a 6 a 7 log UFC/g, apresentando uma possível alternativa para obtenção de uma microbiota saudável para o consumidor. ABSTRACT the objective of this study was to evaluate the viability of an indigenous culture of Lactobacillus plantarum (CNPC003) and its effect on the behavior of a starter culture (Streptococcus thermophilus TA40) in fermented milk drinks prepared with products from jaboticaba (Myrciaria cauliflora) peels in comparison with a commercial potentially probiotic culture (Lactobacillus rhamnosus LR32). Neither the commercial probiotic nor the indigenous culture interfered in the behavior of S. thermophilus since the viability of this microorganism was higher than 8.8 log CFU/g during 21 days of storage under refrigerated conditions (4 C). The commercial probiotic L. rhamnosus LR32 and the indigenous culture L. plantarum CNPC003 was enough to ensure potential probiotic value for the milk drinks T2 and T3, higher than 6 to 7 log CFU/g over the whole storage, and becoming a possible alternative to result in a healthy microbiota to the consumer. PALAVRAS-CHAVE: bebida láctea; probióticos; cultura nativa. KEYWORDS: milk drink; probiotics; indigenous culture.

2 1. INTRODUÇÃO A relação entre dieta e saúde, destacada nas atuais evidências científicas, têm permitido o surgimento de um mercado de alimentos diferenciados, de rápido crescimento em um período recente, com enfoque no extraordinário potencial dos alimentos em melhorar o estado de saúde dos consumidores (Baldissera et al., 2011). Os produtos alimentares que têm como alvo melhorias das funções fisiológicas dos consumidores são conhecidos como alimentos funcionais (Siegrist et al., 2015). No contexto de promoção da saúde, o estudo de probióticos vem se intensificando, visto que esses microrganismos apresentam capacidade de acarretar benefícios à saúde humana. Probióticos são definidos como microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal, produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo (Santos e Varavallo, 2012). De acordo com dados disponíveis na literatura, para serem alcançados tais benefícios à saúde, seria necessário consumir regularmente 10 8 a 10 9 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) na recomendação diária do produto pronto para o consumo, o que normalmente equivale a um mínimo de 10 6 UFC/g ou ml. Estes valores podem variar conforme indicação do fabricante, pois números menores podem ser aceitos desde que sua eficácia seja comprovada, uma vez que é preciso que um mínimo de probióticos sobreviva à travessia do trato gastrointestinal e colonize o intestino (Castro, 2012). O emprego de bactérias probióticas em produtos lácteos fermentados tem sido amplamente estudado, em especial, para o desenvolvimento de bebidas lácteas fermentadas, em função da sua capacidade em carrear tais microrganismos pelo trato gastrointestinal, e como estimulador desses microrganismos no alimento e da microbiota benéfica do intestino, em decorrência das propriedades funcionais do soro de queijo (Castro, 2012). Apesar da disponibilidade comercial de cepas probióticas bem caracterizadas para uso em alimentos, é necessário o estudo de novos microrganismos com propriedades benéficas à saúde para a incorporação em alimentos, como, por exemplo, cepas nativas de lactobacilos. A utilização de novas cepas com potencial probiótico possibilita um acesso mais amplo a estes microrganismos, especialmente aos pequenos e médios produtores de alimentos em países em desenvolvimento (Vinderola et al., 2008), como é o caso do Brasil. A jabuticabeira (Myrciaria cauliflora Berg) é uma árvore frutífera pertencente à família Myrtaceae, na qual existem inúmeras espéciesbem conhecidas no Brasil (Brasil, 2002). As jabuticabeiras produzem, fruto com reconhecido potencial econômico, ricas em fibras e antioxidantes sua ingestão pode melhorar o desempenho intestinal e proteger o fígado contra ação de radicais livres. Pesquisadores do grupo Compostos Bioativos, Nutrição e Saúde, da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, relataram que o alto conteúdo de fibras da casca da jabuticaba seca, de 25%, contribuiu fortemente, em ratos obesos, para a melhora do trânsito intestinal e para maior excreção de gorduras, impedindo que estas fossem absorvidas, atenuando o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Também foi comprovado que a ingestão de casca de jabuticaba induziu ao aumento do HDL colesterol nos animais obesos, bem como contribuiu para a redução o colesterol total em animais saudáveis (Batista et al., 2013). Embora a jabuticaba seja popular em todo o País, não chega a ter valor comercial muito alto por ser muito perecível, mas possui sua venda assegurada. Apesar de ser grande a produção de um único pé, depois de colhida, a fruta apresenta uma vida útil de até três dias, o que prejudica a sua comercialização. Um maior aproveitamento dessas frações agregaria mais valor a essa fruta (Lima et al., 2008). Este trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade de uma cultura nativa potencialmente probiótica de Lactobacillus plantarum (CNPC003) e sua influência sobre o comportamento do microrganismo starter (Streptococcus themophilus TA40) em bebidas lácteas fermentadas contendo produtos da casca de jabuticaba (Myrciaria cauliflora) em comparação a uma cultura potencialmente probiótica comercial (Lactobacillus rhamnosus LR32).

3 2. MATERIAIS E MÉTODOS Foram produzidos dois lotes com três diferentes tratamentos de bebida láctea fermentada de jabuticaba, em triplicata: T1 com a cultura iniciadora de S. thermophilus TA40 (DuPont); tratamento controle probiótico T2 com S. thermophilus TA40 e a cultura comercial potencialmente probiótica de L. rhamnosus LR32 (DuPont); tratamento experimental T3 com S. thermophilus TA40 e a cultura nativa potencialmente probiótica de Lactobacillus plantarum CNPC003 (EMBRAPA). Esta cultura nativa de L. plantarum foi previamente isolada de leite de cabra e avaliada quanto ao potencial probiótico pela Embrapa Caprinos e Ovinos (Sobral CE). Inicialmente foi realizado o tratamento térmico de soro de queijo em separado a 85 C por 5 minutos, com posterior adição de açúcar e leite em pó e pasteurização por 30 minutos na mesma temperatura. Após o resfriamento foram adicionadas as culturas para o processoo de fermentação, de modo a obter-se a base láctea fermentada, para posterior incorporação de outros ingredientes: pectina YF310 (DuPont), extrato hidroalcóolico obtido da casca de jabuticaba, corante carmim de cochonilha, ácido lático alimentício (Purac Sínteses) e calda de jabuticaba. Foram obtidos 935 g de base láctea cremosa de cada tratamento, incorporadas em 12 potes de 100 g para cada tratamento (T1, T2 e T3) na quantidade de 75 g, juntamentee com geleia de casca de jabuticaba na quantidade de g. Os produtos foram armazenados sob refrigeração a 4 ± 1 C por 21 dias. Na Figura 1 são apresentadas as bebidas lácteas produzidas dos três tratamentos, T1, T2 e T3. Figura 1 Bebidas lácteas fermentadas dos três tratamentos avaliados. Fonte: dados de pesquisa. As bases lácteas das bebidas lácteas fermentadas probióticas foram analisadas microbiologicamente quanto à viabilidade da cultura starter de S. thermophilus e bactérias probióticas no início e final da fermentação, assim como as bebidas lácteas fermentadas nos dias de armazenamento (1, 7, 14 e 21). Para a base láctea cremosa antes e após a fermentação as análises microbiológicas foram realizadas, a partir da transferência de 1,0 ml de amostra para 9,0 ml de solução salina (0,85 g de NaCl/100 ml). A viabilidade de S. thermophilus e das culturas probióticas de Lactobacillus (L. rhamnosus e L. plantarum) foi determinada em triplicata, segundo Buriti et al. (2014). A determinação de S. thermophilus para os três tratamentos foi obtida por plaqueamento de 1,0 ml de cada diluição em ágar M17 com adição de 10% de lactose, com posterior incubação a 36 ± 1 C durante 48 h. As determinações de Lactobacillus sp. para os tratamentos T2 e T3 foram realizadas

4 por plaqueamento de 1,0 ml de cada diluição em ágar MRS acidificado até ph 5,4 com ácido acético, com posterior incubação a 36 ± 1 C durante 72 h. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1 são apresentados os resultados da viabilidade de S. thermophilus e de Lactobacillus sp. nos três tratamentos de bebida láctea fermentada probiótica, antes e após a fermentação e durante o tempo de armazenamento fermentação, com a média e desvio padrão de dois lotes produzidos. Para a viabilidade de S. thermophilus, foi observado que as bebidas lácteas T2 e T3 apresentou uma discreta elevação do dia de fabricação para o dia 1 de armazenamento, sendo semelhante à população deste microrganismo encontrada na bebida láctea T1 durante esse período. Durante os dias de armazenamento do produto final, os valores nas três bebidas lácteas se mantiveram semelhantes, variando entre 8,83 ± 0,41 log unidades formadoras de colônias (UFC)/g e 9,59 ± 0,51 log UFC/g. De acordo com os dados apresentados, a cultura nativa (L. plantarum CNPC003) utilizada para a produção de bebida láctea T3 (teste) não interferiu na viabilidade de S. thermophilus, visto que, ao longo do armazenamento, os valores observados também foram próximos aos obtidos no tempo final da fermentação. Tabela 1 - Viabilidade de S. thermophilus e Lactobacillus sp. (médias ± desvios-padrão) obtida para as bebidas lácteas T1 (controle tradicional), T2 (controle probiótico) e T3 (probiótico experimental) no dia da fermentação (tempo zero e tempo final) e no produto final após 1, 7, 14 e 21 dias de armazenamento sob refrigeração à 4 1 C. Tratamento Período de amostragem Tempo S. thermophilus (log UFC/g) Lactobacillus sp. (log UFC/g) Fermentação Tempo zero (0 h) 6,50 ± 0,19 - Tempo final (5-6 h) 9,22 ± 0,07-1 dia 9,22 ± 0,25 - T1 7 dias 8,95 ± 0,03 - Armazenamento 14 dias 8,83 ± 0,41-21 dias 8,87 ± 0,03 - Tempo zero (0 h) 6,76 ± 0,28 6,81 ± 0,07 Fermentação Tempo final (4-6 h) 8,83 ± 0,49 7,75 ± 0,11 1 dia 9,02 ± 0,22 7,91 ± 0,11 T2 7 dias 8,92 ± 0,12 8,08 ± 0,38 Armazenamento 14 dias 8,92 ± 0,12 7,60 ± 0,15 21 dias 8,89 ± 0,03 7,45 ± 0,13 Tempo zero (0 h) 6,67 ± 0,23 6,78 ± 0,39 Fermentação Tempo final (4-6 h) 9,31 ± 0,54 7,49 ± 0,40 T3 1 dia 9,59 ± 0,51 7,19 ± 0,65 7 dias 9,00 ± 0,21 7,20 ± 0,64 Armazenamento 14 dias 8,89 ± 0,22 6,91 ± 0,49 21 dias 8,96 ± 0,23 6,82 ± 0,48 LEGENDA: - = Não apresenta a cultura probiótica; T1 = S. thermophilus TA40; T2 = S. thermophilus TA40 + L. rhamnosus LR32; T3 = S. thermophilus TA40 + L. plantarum CNPC003. Fonte: dados de pesquisa.

5 Estes resultados foram condizentes com os de Boêno (2014), ao desenvolver uma bebida láctea fermentada usando extrato de arroz vermelho, iogurte natural (que contém Streptococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus), além de sacarose e espessante, no qual a contagem total de células viáveis de bactérias lácticas para todos os tratamentos estudados e durante todo o tempo de armazenamento estudado foi superior a 10 9 UFC/mL. Para a viabilidade de Lactobacillus sp., os valores apresentados pela bebida láctea T3 foram semelhantes aos da bebida láctea T2, a qual possui cultura comercial. Pode-se notar que, do dia 7 ao dia 14, ambas as formulações apresentaram uma discreta diminuição na viabilidade de Lactobacillus sp. Houve maior redução na viabilidade dos probióticos nos últimos dias de armazenamento na bebida láctea T3 quando comparada à bebida T2. Os valores para Lactobacillus sp. variaram de 8,08 ± 0,38 log UFC/g a 7,45 ± 0,13 log UFC/g para T2 (L. rhamnosus) e de 7,20 ± 0,64 log UFC/g a 6,82 ± 0,48 log UFC/g para T3 (L. plantarum), considerando todo os períodos de amostragens. A viabilidade de microrganismos probióticos durante o armazenamento esteve dentro do recomendado pela literatura, acima de 6 a 7 log UFC/g do produto pronto para o consumo (Castro, 2012), o que permitiria que as bebidas produzidas fossem consideradas alimentos funcionais, uma vez que os microrganismos estiveram ativos e viáveis no produto final e durante sua vida útil. Nota-se que na bebida láctea T3, apesar de ter apresentado menores valores de viabilidade de Lactobacillus sp. quando comparada a T2 durante o tempo de armazenamento, em nenhum momento estes valores foram menores que os limites aceitáveis para o consumo humano de probióticos, o que também foi observado por Souza et al. (2013) ao estudar as características físicas, químicas, tecnológicas e sensoriais de leites fermentados usando L. plantarum, obtendo valores de células de L. plantarum de 8,43 log UFC/g e 10,11 log UFC/g, no início e final de fermentação, e ao longo do tempo de armazenamento de 70 dias, de 8,92 ± 0,17 log UFC/g a 10,52 ± 0,05 log UFC/g. 4. CONCLUSÕES A cultura nativa potencialmente probiótica L. plantarum CNPC003, assim como a cultura comercial L. rhamnosus, ao longo dos 21 dias de armazenamento das bebidas lácteas T2 e T3 apresentaram viabilidade suficiente para garantir potencial probiótico a estas formulações, com populações sempre maiores que 6 a 7 log UFC/g, apresentando uma possível alternativa para obtenção de uma microbiota saudável para o consumidor. A cultura nativa L. plantarum CNPC003 utilizada para a produção de bebida láctea experimental T3 não interferiu na viabilidade de S. thermophilus. A utilização da casca da jabuticaba no desenvolvimento de produtos lácteos probióticos surge como uma alternativa inovadora, trazendo compostos benéficos à saúde como as antocianinas e as fibras alimentares presentes na sua casca, tornando o alimento mais nutritivo e funcional para o consumidor. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Pessoal de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES) e Fundação Parque Tecnológico da Paraíba (PaqTcPB) pelo auxílio financeiro e ao Núcleo de Pesquisa e Extensão em Alimentos (NUPEA/UEPB) pela colaboração nas análises do presente estudo. Os autores também agradecem à Embrapa Caprinos e Ovinos pela cultura nativa de L. plantarum, à empresa DuPont pela pectina e pelas culturas de S. thermophilus e L. rhamnosus, bem como à empresa Purac Sínteses pelo ácido lático alimentício cedido à pesquisa.

6 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Baldissera, A. C., Betta, F.D., Penna, A.L.B., & Lindner, J. D. (2011). Alimentos funcionais: uma nova fronteira para o desenvolvimento de bebidas protéicas a base de soro de leite. Semina: Ciências Agrárias, 32(4), Bôeno, J. A. (2014). Bebidas lácteas fermentadas formuladas com leite, soro de leite e extrato de arroz vermelho: aspectos físicos, químicos, microbiológicos e sensorial (Tese de doutorado). Universidade Federal de Goiás, Goiânia. Batista, Â. G., Lenquiste, S. A., Moldenhauer, C., Godoy, J. T.; Reis, S. M. P. M.; Maróstica Júnior, M. R. (2013). "Consumo de casca de jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg.) melhorou a excreção de triglicerídeos e a peroxidação lipídica hepática de ratos alimentados com dieta hiperlipídica. Revista de Nutrição. Campinas, v. 26(5), p ,. Brasil Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Coordenação-Geral da Política de Alimentação e Nutrição. Alimentos regionais brasileiros. Brasília: Ministério da Saúde. Buriti, F. C. A., Freitas, S. C., Egito, A. S., & Dos Santos, K. M. O. (2014). Effects of tropical fruit pulps and partially hydrolysed galactomannan from Caesalpinia pulcherrima seeds on the dietary fibre content, probiotic viability, texture and sensory features of goat dairy beverages. LWT Food Science and Technology, 59, Castro, W. F. (2012). Efeito da concentração de soro de queijo na produção e qualidade sensorial de bebidas lácteas probióticas (Tese de doutorado). Universidade Estadual de Campinas, Campinas. Lima, A. J. B., Corrêa A. D., Alves, A. P. C., Abreu, C. M. P., Dantas-Barros, A. M. (2008). Caracterização química do fruto jabuticaba (Myrciaria cauliflora Berg) e de suas frações. Archivos Latinoamericos de Nutrición, v. 58.n. 4, p Santos, T. T., & Varavallo, M. A. (2012). Conhecimento de universitários sobre probióticos e suas implicações na promoção de saúde. Interbio, 6(1), Siegrist, M., Shi, J., Giusto, A., & Hartmann, C. (2015). Worlds apart: consumer acceptance of functional foods and beverages in Germany and China. Appetite, 92, Souza, A. H. P., Costa, G. A. N., Miglioranza, L. H. D. A. S., Maia, L. F., & Oliveira, A. F. (2013). Microbiological, physical, chemical and sensory characteristics of milk fermented with Lactobacillus plantarum. Acta Scientiarum: H.ealth Sciences, 35(1), Vinderola, G., Capellini, B., Villarreal, F., Suárez, V., Quiberoni, A., & Reinheimer, J. (2008). Usefulness of a set of simple in vitro tests for the screening and identification of probiotic candidate strains for dairy use. LWT Food Science and Technology, 41,