Estudo da estabilidade do sistema Paratest usado para diagnóstico das parasitoses intestinais Rev.00 10/01/2011

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1 1 Estudo da estabilidade do sistema Paratest usado para diagnóstico das parasitoses intestinais Rev.00 10/01/ Introdução As parasitoses intestinais representam sério problema de saúde pública, em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, afetando adultos e crianças. As últimas podem sofrer prejuízos no desenvolvimento físico e intelectual, resultantes da ação dos parasitos sobre o hospedeiro, como espoliação nutricional e sanguínea, processos inflamatórios, lesões teciduais, distúrbios digestivos e gastrointestinais dentre outros. Embora a mortalidade não seja demasiado elevada nas afecções humanas por parasitos intestinais, ainda há relatos de morte por hiperparasitismo no país, o que denota a negligencia a que esses agravos da saúde têm sido submetidos. O diagnóstico preciso das parasitoses, com posterior encaminhamento para a terapia adequada, representa uma importante ação em saúde individual e coletiva que conduz à melhoria da qualidade de vida da população. Com esse objetivo, o sistema Paratest é avaliado no presente estudo, como uma abordagem alternativa para o diagnóstico parasitológico que ofereça menor risco biológico e maior praticidade de execução dos exames, mantendo o padrão de qualidade dos resultados. 2. Objetivos Esse trabalho tem por objetivo avaliar a estabilidade do sistema diagnóstico Paratest em relação: a) À temperatura de armazenamento do Kit nas condições originais de produção, ou seja, antes da adição e diluição da amostra (fezes) no líquido diluente / conservante. b) À temperatura de armazenamento do Kit, após a adição e diluição das fezes no líquido diluente / conservante. c) Ao tempo de armazenamento do Kit, especificamente em temperatura ambiente (22 o C 25 o C), nas condições originais de produção, ou seja, antes da adição e diluição da amostra biológica (fezes) no líquido diluente / conservante. d) Ao tempo de armazenamento do Kit, especificamente em temperatura ambiente (22 o C 25 o C), após a diluição das fezes no líquido diluente / conservante. 3. Método 3.1. Sistema (kit) Paratest O Sistema (Kit) Paratest produzido pela empresa Diagnostek é constituído de um frasco plástico cuja tampa é dotada de uma membrana filtrante com poros de

2 2 aproximadamente 266 µm, os quais, retêm grande parte dos detritos e resíduos do bolo fecal deixando passar formas parasitárias que podem ser identificadas por microscopia. O frasco do Kit Paratest possui como líquido diluente / conservante um volume de 7 ml de solução de Formalina a 5%, tamponada com tampão fosfato de sódio em ph 7,0. Para o exame coproparasitológico são diluídos nessa solução cerca de dois gramas de fezes recém-emitidas pelo paciente, sendo que, da suspensão assim obtida, uma pequena fração é gotejada em lâmina de microscopia e examinada microscopicamente por um especialista em parasitologia. O diagnóstico é feito pela identificação morfológica das formas parasitárias observadas ao exame microscópico. Todos os frascos do Kit possuem a identificação do lote, com informações sobre a semana, mês e ano de fabricação o que contribui para a precisão das análises de estabilidade Seleção dos lotes do Kit Paratest para estudos de estabilidade Para análise da estabilidade em relação à temperatura manteve-se fixa a variável relacionada ao lote, utilizando-se frascos exemplares do mesmo lote, em diferentes temperaturas. Para análise da estabilidade em relação ao tempo de armazenamento, antes da adição da amostra fecal, foram utilizados frascos de diferentes lotes, produzidos em datas distintas. Para a análise da estabilidade em relação ao tempo, após adição da amostra fecal, foram utilizados frascos do mesmo lote, com mesma data de fabricação Conceito de estabilidade para Kit Paratest e critério de análise Em relação ao tempo ou temperatura, com e / ou sem amostra biológica diluída, a estabilidade dos lotes do Kit Paratest é definida como a capacidade de preservação (fixação) e manutenção da integridade das formas parasitárias, nas diferentes condições testadas. Essa estabilidade foi aferida com base na morfologia parasitária analisada após manutenção em diferentes temperaturas e em diferentes tempos. Portanto, o critério de análise das amostras para verificação da estabilidade do Kit teve como base a morfologia das formas parasitárias descrita pelos microscopistas conforme convenção abaixo: a) Formas parasitárias íntegras e bem : quando o analista observou formas parasitárias com morfologia idêntica ou muito próxima da morfologia original descrita na literatura e observada em amostras fecais frescas e não conservadas (amostra controle), apenas diluídas no líquido conservante do Paratest (padrão-ouro morfológico), no momento da análise. b) Formas parasitárias alteradas e não : quando o analista observou formas parasitárias com morfologia diferente e distorcida em relação à

3 3 morfologia original descrita na literatura e em relação à observada em amostras fecais frescas e não conservadas (amostra-controle), apenas diluídas no líquido conservante do Paratest (padrão-ouro morfológico), no momento da análise Amostras-controle Os controles das análises em tempos distintos e temperaturas diferentes foram feitos por comparação com formas parasitárias íntegras / bem (padrão-ouro morfológico) examinadas simultaneamente, em tempo real, às amostras-teste. Esse controle era proveniente de amostras fecais frescas sabidamente positivas que foram diluídas na solução conservante do Paratest no exato momento (tempo zero) das análises microscópicas, em temperatura ambiente, e acompanhadas microscopicamente ao longo do tempo Descrição dos ensaios Avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest na condição original de produção, em relação à temperatura de armazenamento. Para esse ensaio, utilizaram-se três frascos do Kit Paratest do mesmo lote de fabricação, com data de fabricação inferior a uma semana, os quais, foram mantidos em temperaturas distintas antes da adição da amostra fecal (Frasco X - temperatura ambiente, entre 22 o C e 25 o C; Frasco Y - refrigeração a 4ºC e Frasco Z - estufa a 37ºC), por 7 dias, antes do início do estudo. O propósito foi verificar se a variação da temperatura afetaria a estabilidade da solução diluente / conservante. No momento do ensaio, a esses três frascos foram adicionados dois gramas da mesma amostra fecal fresca, poliparasitada, e sabidamente positiva para cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos. Imediatamente após a homogeinização das fezes uma alíquota da suspensão de cada frasco foi gotejada em lâmina de microscopia e examinada em microscópio óptico por um especialista em parasitologia, visando à descrição da morfologia. A análise morfológica foi feita em comparação com o padrão ouro do controle prédefinido nesse estudo e a morfologia foi descrita conforme convenção de padrão morfológico, também previamente definido no presente estudo, conforme item Após o primeiro exame, imediatamente após a diluição das fezes (tempo zero), os frascos foram incubados nas temperaturas iniciais e seus conteúdos foram reexaminados após 24 horas (tempo 1) e 48 horas (tempo 2). Os resultados dessas análises estão descritos no item 4.1, Quadro 1. A opção pelo uso de frascos pertencentes a lotes fabricados a menos de uma semana representou apenas uma margem de segurança para eliminar possível variável relacionada ao tempo de armazenamento.

4 Avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest, em relação à variação de temperatura, após adição da amostra fecal. Para esse ensaio, utilizaram-se três frascos do Kit Paratest do mesmo lote de fabricação, com data de fabricação inferior a uma semana, os quais foram mantidos em temperatura ambiente até o momento do ensaio (frasco M, frasco N e Frasco O). Em cada frasco foram adicionados dois gramas da mesma amostra fecal fresca, poliparasitada e sabidamente positiva para cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos. Imediatamente após a homogeinização no líquído diluente/conservante do Kit Paratest, uma alíquota da suspensão de cada um dos três frascos foi gotejada em lâmina e examinada ao microscópio óptico, estabelecendo-se por estas primeiras análises (tempo zero, à temperatura ambiente) o padrão-ouro morfológico das formas parasitárias observadas. Os resultados qualitativos dessas análises imediatas representaram os controles para as análises subsequentes dos conteúdos dos mesmos frascos submetidos a diferentes temperaturas. Na sequência, um desses frascos foi incubado em temperatura ambiente (Frasco M), o segundo foi incubado sob refrigeração, a 4 o C (frasco N), e o terceiro foi incubado em estufa a 37 o C (frasco O). Ao longo de sete dias, os exames foram feitos após 24 horas, 72 horas, 120 horas e 168 horas, quando uma nova alíquota de cada um dos três frascos foi gotejada em lâmina de microscopia para análise. Esses exames microscópicos subsequentes foram realizados sempre pelo mesmo analista, visando à descrição da morfologia. Esta foi feita em comparação com o padrão-ouro, pré-definido nesse estudo e em consonância com a convenção de descrição do padrão morfológico, também previamente definido no presente estudo (conforme item 3.1.2). Os resultados desses exames estão descritos no item 4.2, Quadro 2. A opção pelo uso de frascos pertencentes a lotes fabricados a menos de uma semana representou apenas uma margem de segurança para eliminar possível variável relacionada ao tempo de armazenamento Avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest, em relação ao tempo de armazenamento, em temperatura ambiente (22 o C 25 o C) antes da adição da amostra biológica fecal. Para esse ensaio foram usados sete frascos do Kit Paratest, de lotes distintos produzidos em datas distintas, ao longo de um período de três anos, a saber: Frasco k, com uma semana de produção; Frasco P, com um mês de produção; frasco Q com três meses de produção; frasco R, com seis meses de produção; frasco S, com um ano de produção; frasco T, com 2 anos de produção e frasco U, com 3 anos de produção. Em cada frasco foram adicionados dois gramas da mesma amostra fecal fresca, poliparasitada e sabidamente positiva para cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos. Imediatamente após a homogeinização no líquído diluente/conservante do Kit Paratest (tempo zero), uma alíquota da suspensão de cada um dos três frascos foi gotejada em lâmina e examinada ao microscópio óptico. A análise morfológica das formas parasitárias foi confrontada com o padrão-ouro da amostra

5 5 controle, preparada em tempo real, examinada no tempo zero e após uma semana. O ensaio foi conduzido em temperatura ambiente. Como no controle, foram feitas duas análises para cada frasco: em tempo zero e após uma semana (tempo 1). Os resultados destas análises estão apresentados no item 4.3, Quadro Avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest, em relação ao tempo de armazenamento, em temperatura ambiente (22 o C 25 o C), após a adição da amostra biológica fecal. Para esse ensaio foram usados três frascos (frasco G, frasco H e frasco I) do Kit Paratest, pertencentes ao mesmo lote, fabricado com menos de uma semana de antecedência ao ensaio. Esse tempo de fabricação do lote foi aleatório, objetivandose apenas eliminar a variável tempo do ensaio. Foi adotada a temperatura ambiente para a realização do ensaio durante todo o período de análise, padronizado para um mês. A cada frasco foram adicionados dois gramas da mesma amostra fecal fresca, poliparasitada e sabidamente positiva para cistos de protozoários e ovos e larvas de helmintos. Imediatamente após a homogeinização no líquído diluente/conservante do Kit Paratest, uma alíquota da suspensão de cada um dos três frascos foi gotejada em lâmina e examinada ao microscópio óptico (tempo zero). A análise morfológica das formas parasitárias, no tempo zero, representou o padrão-ouro morfológico, com o qual foram confrontadas as formas parasitárias dos frascos ao longo do mês. Os resultados destas análises estão apresentados no item 4.4, Quadro Resultados 4.1. Estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest na condição original de produção, em relação à variação de temperatura. Conforme mostra a descrição das formas parasitárias, no Quadro 1, constatou-se que, nas três temperaturas de armazenamento do Kit Paratest testadas a estabilidade não foi afetada, garantindo a conservação da amostra e preservação da morfologia das formas parasitárias, em condições ótimas, na comparação com o padrão-ouro do controle. Após a análise no tempo zero, os frascos foram mantidos por mais 48 horas nas temperaturas originais de armazenamento sem que a morfologia das formas parasitárias fossem afetadas. Observou-se, contudo que à temperatura de 37 o C há aceleração da evaporação do líquido conservante / diluente do Kit Paratest.

6 6 Quadro 1: Influência da temperatura de armazenamento do Kit Paratest sobre a morfologia das formas parasitárias. Temperatura inicial do líquido diluente /conservante T ambiente (22 o C-25 o C) (Frasco X) T 4 o C (Frasco Y) T 37 o C (Frasco Z) Controle* * Padrão-ouro Tempo Zero (exame imediato) Descrição das formas parasitárias ao longo do tempo Tempo 1 (após 24 horas) Tempo 2 (após 48 horas) Observação Similar ao padrão-ouro Similar ao padrão-ouro Similar ao padrão-ouro Representa Padrão-ouro 4.2. Resultado da avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest, em relação à variação de temperatura, após adição da amostra fecal. Conforme mostra o Quadro 2, abaixo, a variação da temperatura de incubação do Kit Paratest, após a adição da amostra fecal não exerceu nenhum efeito deletério sobre a conservação das formas parasitáras por período de até sete dias (168 horas) a contar da data da diluição. Entretanto, foi observada uma evaporação aumentada do líquido conservante na temperatura de 37 o C. Quadro 2 Influência da variação de temperatura seguida à adição da amostra biológica sobre as formas parasitárias. Frasco/ (temperatura) Frasco M T ambiente (22 o C-25 o C) Frasco N (T 4 o C) Frasco O (T 37 o C) Controle* (padrão ouro) Tempo Zero (exame imediato) Descrição das formas parasitárias ao longo do tempo Tempo 1 24 horas Tempo 2 72 horas Tempo horas Tempo horas

7 Resultado da avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest, em relação ao tempo de armazenamento, em temperatura ambiente (22 o C 25 o C) antes da adição da amostra biológica fecal. Conforme mostra o Quadro 3, abaixo, o ensaio realizado como descrito no item mostrou que o Kit é estável antes da adição da amostra biológica, por um período de até três anos, quando mantido em temperatura ambiente. Revelou também que após a diluição da amostra fecal as formas parasitárias se mantêm íntegras e por um período de até quatro semanas. Quadro 3. Avaliação da estabilidade do Kit em relação ao tempo de armazenamento antes da diluição da amostra. Frasco / (tempo de produção) Frasco K (1 semana) Frasco P (1 mês) Frasco Q (3 meses) Frasco R (6 meses) Frasco S (1 ano) Frasco T (2 anos) Frasco U (3 anos) Controle* * Padrão-ouro Tempo Zero (exame imediato) Descrição das formas parasitárias ao longo do tempo Tempo 1 (1 semana) Tempo 2 (2 semanas) Estudo em andamento Tempo 3 (3 semanas) Estudo em andamento Tempo 4 (4 semanas) Estudo em andamento 4.4. Resultado da avaliação da estabilidade da solução diluente / conservante do Kit Paratest, em relação ao tempo de armazenamento, em temperatura ambiente (22 o C 25 o C), após a adição da amostra biológica fecal. Conforme mostra o Quadro 4, abaixo, as formas parasitárias mantêm-se íntegras e por até quatro semanas após a diluição no líquído diluente / conservante do Kit Paratest. Esses resultados confirmam aqueles apresentados no item 4.3.

8 8 Quadro 4. Influência do tempo de permanência da amostra fecal no líquido diluente / conservante sobre a morfologia das formas parasitárias. Frasco T ambiente (22 o C-25 o C) Tempo Zero (exame imediato) Frasco G * Frasco H Frasco I Controle* * Padrão-ouro 5. Conclusões Descrição das formas parasitárias ao longo do tempo Tempo 1 (1 semana) Tempo 2 (2 semanas) Tempo 3 (3 semanas) Com base nos estudos de estabilidade descritos acima concluiu-se que Em relação à variável Temperatura : Tempo 4 (4 semanas) - O sistema Paratest, sem a adição da amostra biológica (fezes) mantém a estabilidade quando armazenado em temperatura ambiente ou sob refrigeração ou a 37 o C, por um período de três anos garantindo a integridade e conservação da formas parasitárias quando adicionadas ao líquido diluente / conservante. A Diagnostek recomenda o armazenamento em temperatura ambiente (23 o C 25 o C). - O sistema Paratest após a adição da amostra biológica (fezes) mantém as formas parasitárias íntegras e bem, em temperatura ambiente ou sob refrigeração, assim como à temperatura de até 37 o C, por um período de até uma semana. A Diagnostek recomenda o armazenamento, após diluição da amostra biológica, em temperatura ambiente e salienta que temperaturas próximas a 37 o C poderão acelerar a evaporação do líquido diluente / conservante. Em relação à variável Tempo : - O sistema Paratest, sem a adição da amostra biológica (fezes) é estável por um período de três anos, em temperatura ambiente, mantendo íntegras e bem conservadas as formas parasitárias, quando a amostra fecal é adicionada ao líquido diluente / conservante. - O sistema Paratest, após a adição da amostra biológica (fezes) mantém as formas parasitárias íntegras e bem, em temperatura ambiente por, pelo menos, trinta dias (4 semanas). A Diagnostek recomenda que o exame seja feito em até 10 dias após a adição da amostra fecal no líquido diluente / conservante.

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