Deste modo, a imunologia dos tumores é uma área de conhecimento que envolve o estudo de: IMUNOLOGIA DOS TUMORES

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1 IMUNOLOGIA DOS TUMORES Um dos tópicos mais fascinantes e ainda incompreensíveis no estudo da imunologia se refere à resistência e interação do sistema imune com tumores. Há fortes evidências de que o sistema imune é um fator de fundamental importância na resistência aos tumores principalmente sob a forma de vigilância imunológica". Por vigilância imune compreende-se o conjunto de mecanismos que contribuem para impedir a instalação de um tumor ou qualquer outra patologia. Assim, temos o conhecimento de que em condições de supressão ou deficiência dos sistema imune, fica facilitada a instalação de um tumor maligno. Exemplos são o aparecimento do Sarcoma de Kaposi, em aidéticos, neoplasias variadas em pacientes transplantados sob regime supressor e neoplasias em pacientes com ataxia-telangiectasia (Imunodeficiência T/B). É bom lembrar que células transformadas ou células mutantes, são geradas constantemente e normalmente são destruídas pelas células imunocompetentes. Assim, o sistema imune é normalmente eficiente em realizar a vigilância imunológica. Entretanto, para que se instale um tumor, é suficiente que uma única célula escape ao sistema de vigilância. Assim, o câncer pode corresponder a uma falha momentânea no sistema imunológico e não necessariamente um reflexo de imunodeficiência. Aparentemente este é o ponto comum a maioria dos tumores malignos que afetam a população normal. Células normais têm uma capacidade variável de proliferação e expressão de suas diferentes funções. O crescimento numérico de um determinado tipo celular em um tecido, depende do número de células que morrem naturalmente ou da necessidade fisiológica de síntese aumentada de produtos específicos daquele órgão. Em algumas condições patológicas, o estímulo para a proliferação celular é maior do que o necessário para a simples substituição de células mortas ou velhas, ocorrendo hipertrofia do órgão envolvido, por proliferação policlonal. Se a fonte de estímulo ou a causa de origem dos estímulos é removida, há interrupção do processo de proliferação e após alguns dias o órgão retorna à sua condição original. Em contraste às células não transformadas com crescimento policlonal regulado, algumas células isoladamente podem sofrer transformação maligna dando origem a um clone de células com proliferação independente de fatores externos. A proliferação autônoma e monoclonal de células constitui a base das doenças tumorais ou câncer. Entre as principais características das células tumorais podemos destacar: 1. Falha em responder aos sinais regulatórios do crescimento e reparo tecidual 2. Crescimento autônomo sem necessidade de sinais exógenos de crescimento 3. Crescimento invasivo de tecido normal subjacente 4. Crescimento metastático em órgãos ou tecidos distantes atingidos por via sanguínea ou linfática. 5. Origem monoclonal, embora heterogeneidade genotípica e fenotípica possa se desenvolver após um período de crescimento da massa tumoral 6. Diferenças no aparecimento e antigenicidade de células mesmo que originárias do mesmo tipo celular. 7. Atividades bioquímicas alteradas, por exemplo, o aumento da atividade glicolítica, permitindo o crescimento do tumor mesmo sob baixa concentração de oxigênio; secreção de várias enzimas que degradam a membrana basal e estroma circunjacente; produção de fatores de angiogênese que induzem a formação de vasos no interior do tumor, suprindo-o de oxigênio e nutrientes para sustentar seu crescimento. 8. Anormalidades cromossômicas. As células cancerosas geralmente exibem aneuploidia, com maior ou menor número de cromossomos, além de deleções, translocações e duplicação gênica. Os cânceres podem surgir a partir de qualquer tecido no corpo, recebendo diferentes denominações de acordo com o tipo de célula que lhe der origem de um modo genérico. Os carcinomas são células transformadas originárias de células epiteliais como o fígado, rim, epitélio gastrointestinal e constituem os tipos mais comuns de tumores. Os sarcomas surgem a partir de fibroblastos, células musculares e adiposas. Linfomas são constituídos de massas sólidas de células linfóides, enquanto as leucemias representam a transformação maligna de linfócitos e outras células hematopoiéticas de origem medular e sanguínea ( tumores em suspensão). Desde a década de 50 existe o conceito de que o sistema imune pode combater ou prevenir o aparecimento de tumores através de mecanismos de vigilância imunológica, embora este fenômeno nem sempre pareça ser eficiente. Deste modo, a imunologia dos tumores é uma área de conhecimento que envolve o estudo de: 1. Propriedades antigênicas de células transformadas; 2. Respostas do hospedeiro às células tumorais; 3. Conseqüência imunológicas do crescimento das células malignas e 4. Os meios pelos quais o sistema imune pode ser modulado, reconhecer e erradicar as células tumorais. DESENVOLVIMENTO DOS TUMORES A transformação de uma célula pode resultar de mutações espontâneas ou induzidas por agentes químicos, físicos ou virais. A indução de tumores por agentes químicos foi inicialmente descrita no século 18 quando se observou que limpadores de chaminé apresentaram uma freqüência anormal de carcinoma de escroto. Descobriuse então que hidrocarbonatos aromáticos policíclicos presentes na fuligem e alcatrão constituem uma das principais classes de carcinógenos químicos. Outra importante classe de carcinógenos são as aminas aromáticas, cuja atividade foi descoberta a partir das observações de que era muito freqüente a incidência de câncer de bexiga em operários das fábricas que usavam corantes à base de anilina. Evidências de tumores induzidos por agentes físicos evoluíram após a descoberta do Raio X, no século 19. Muitos dos primeiros radiologistas desenvolviam radiodermatite e após longo período de latência podiam apresentar câncer de pele. A evidência mais dramática de que radiações ionizantes podem induzir câncer esta nos sobreviventes da bomba atômica lançada no Japão, que por mais de 20 anos após o holocausto apresentaram tumores variados. A radiação ionizante presumivelmente provoca injurias no DNA, resultando em mutações, quebras cromossômicas e rearranjo anormal mas o longo período de latência requerido para o aparecimento dos tumores sugere que a expressão de malignidade pode requerer a presença de um promotor e eventos genéticos adicionais. Com relação à radiação ultravioleta, que induz câncer de pele em partes do corpo expostas à luz solar, os mecanismos de indução podem ser vários, incluindo a produção de radicais livres e possivelmente imunossupressão. A oncogênese viral é de interesse particular para a imunologia dos tumores por causa da grande probabilidade de que a introdução de genes virais no genoma da célula hospedeira resulte na expressão de novos antígenos na superfície celular, que podem ser reconhecidos pelo sistema imune. Os vírus oncogênicos podem ser do tipo DNA ou RNA. A maioria das células infectadas por vírus DNA permite a replicação do vírus, resultando em lise a célula hospedeira. A infecção de células não permissivas pode ocasionar a integração do DNA viral ao genoma da célula e expressão dos chamados oncogenes virais. Exemplos de vírus tipo DNA que parecem ser oncogênicos são o vírus de Epstein-Barr (EBV), associado ao linfoma de Burkitt e carcinoma nasofaríngeo, o vírus da herpes simplex associado ao carcinoma de colo uterino, o vírus da hepatite B associada ao câncer hepático primário. Os vírus oncogênicos tipo RNA possuem a transcriptase reserva que permite a síntese de DNA tendo seu RNA como molde e recebem o nome de retrovírus. Um exemplo destes é o HTLV (human T leukemia viruses) associado ao HIV. Uma característica importante deste vírus é a possibilidade de transmissão horizontal de indivíduos infectados para pessoas normais e a resistência à tumorigênese parece depender. em partes, da capacidade de desenvolvimento de uma resposta imune eficiente. ANTÍGENOS TUMORAIS Para que o organismo desenvolva uma resposta imune contra o tumor é necessário que as células imunocompetentes interajam com estruturas reconhecidas como não-próprias na superfície das células tumorais. Células tumorais podem expressar antígenos com maior ou menor capacidade imunogênica. Estes antígenos podem ser basicamente de dois tipos, os antígenos tumor-específicos únicos e os antígenos tumorassociados. Os Ag tumor-específicos únicos são encontrados apenas em células tumorais e portanto representam um alvo ideal para o ataque imunológico. Em contraste os Ag tumor-associados podem ser encontrados em células tumorais e também em algumas células normais, porém características quantitativas e qualitativas permitem diferenciar sua presença em células tumorais ou normais. MECANISMOS MOLECULARES RESPONSÁVEIS POR Ag TUMORAIS

2 1. Biossíntese de moléculas novas (antígenos controlados por vírus) 2. Expressão de genes normalmente silentes (expressão aberrante ao Ag fetais ou Ag de diferenciação) 3. Alterações na estrutura de moléculas normais (mutações e mudanças na estrutura de carboidratos) vírus) 1. Biossíntese de moléculas novas (antígenos controlados por Uma pequena parte dos tumores conhecidos tem sua origem associada à infecção por vírus, os chamados vírus oncogênicos, do tipo DNA e os retrovírus (RNA), como citado anteriormente. Após infecção os vírus expressam genes homólogos aos oncogenes celulares ou proto-oncogenes, os quais codificam fatores que controlam o crescimento e a divisão celular. Falhas no controle destes genes podem determinar transformação potencialmente maligna. Peptídios virais associados ao MHC n superfície de células tumorais comportam-se como poderosos antígenos de transplante, dando origem a linfócitos Tc específicos. Todos os tumores induzidos por um determinado vírus geralmente expressam os mesmos antígenos de superfície, independentemente de sua origem celular. Portanto, teoricamente, a imunização de um indivíduo com qualquer destes tumores poderia conferir proteção contra desafios subsequentes, o que infelizmente não ocorre na prática. 2. Expressão de genes normalmente silentes (expressão aberrante ao Ag fetais ou Ag de diferenciação) A divisão celular descontrolada das células cancerosas cria uma condição na qual produtos de genes normalmente silenciosos podem ser expressos. Algumas vezes eles codificam antígenos de diferenciação normalmente associados a estágios de desenvolvimento fetal. Assim, tumores derivados de um mesmo tipo celular geralmente expressam antígenos oncofetais, presentes também nas células embrionárias. Estes são os antígenos tumor-associados melhor caracterizados e são expressos durante a embriogenese mas são ausentes ou difícies de serem detectados no tecido normal adulto. O protótipo deste antígeno é o CEA = Antígeno carcinoembriônico, uma glicoproteína presente no intestino fetal e no câncer de cólon humano, mas não no cólon normal. Pacientes com doenças inflamatórias envolvendo células de origem endodérmica como colite e pancreatite e pacientes com outros tumores também apresentam níveis séricos aumentados de CEA. A despeito das limitações, o acompanhamento dos níveis de CEA tem sido úteis na monitoração da progressão e resposta a terapia da doença (ocorrem em 75% dos casos de tumor colorretal e 90% dos tumores de pâncreas. A alfa fetoproteína é uma alfa globulina normalmente secretadas pelo fígado fetal e células do saco vitelínico e presente no soro de paciente com tumor hepático e pode ser utilizado como marcador do estado da doença (70% dos tumores hepáticos, 80% dos carcinomas testicular e ovariano e presente também na cirrose e hepatite B). Outro antígeno descoberto mais recentemente é o MAGE-1, normalmente presente nas c élulas germinativas do testículo, encontrado com frequencia considerável em melanomas, tumor de cabeça e pescoço, alguns tipos de câncer pulmonar e carcinoma de bexiga. Entre os antígeno de diferenciação podemos citar o CD5 um antígeno característico de linfócito T e que é comumente expresso em tumor de linfócitos B (leucemia linfocitária crônica). 3. Alterações na estrutura de moléculas normais (mutações e mudanças na estrutura de carboidratos) Alterações induzidas por mutações pontos podem resultar na geração de moléculas modificadas ou na simples ausência das mesmas, permitindo o escape das células tumorais Podem ser encontrados também alterações na expressão de carboidratos de membrana, como ocorre com os antígenos do sistema Lewis (Le a ), que aparece em células de câncer gastrointestinal, mesmo em pacientes que são Le(a -,b - ) O papel do MHC na imunidade anti-tumoral A maior ou menor expressão de MHC para células tumorais pode ser fundamental para seu reconhecimento e destruição pelo sistema imune, uma vez que a interação das células imunes específicas é restrita pelo MHC. Este aspecto poderá determinar se o tumor é imunogênico ou não imunogênico. Mecanismos de Imunidade anti-tumoral Virtualmente os mecanismos efetores de células tumorais mas alguns deles podem ser mais importantes do que outros, dependendo das características do tumor. De um modo geral, os mecanismos de imunidade celular parecem ser mais requisitados que a resposta humoral. Células T. As células T são as mais importantes no combate aos tumores, atuando tanto na destruição das células malignizadas quanto na ativação de outros mecanismos efetores. Assim, há um grande envolvimento das células Thelper que atua na resposta global pela geração de linfocinas. As células Tc também podem secretar citocinas mas media seu efeito, principalmente através de lise direta do tumor. A eficiência destas células reside principalmente no fato de que há geração de um clone específico e numeroso além de citocinas como a linfotoxina que podem atuar diretamente no combate ao tumor. Devem ser lembrado que as células T atuam de modo MHC restrito e que alguns tumores não expressam Ag associados ao MHC, escapando à ação destas células. Nestes casos, a ação de células como NK, não-restrita pelo MHC, pode ser fundamental. Havendo a interação célula efetora:célula alvo, e prevalecendo os sinais de ativação, forma-se, em poucos minutos, uma sinapse imunológica estável entre as membranas celulares. No espaço intercelular dessa sinapse, a célula NK promove a liberação do conteúdo de seus grânulos citoplasmáticos, lisossomos secretórios especializados, presentes apenas nas células citolíticas (NK e CTL). De modo semelhante ao que ocorre com as CTLs, inicialmente os monômeros de perforina polimerizam-se na superfície da célula alvo, formando poros na membrana celular, por onde penetram outros componentes presentes nos grânulos da célula efetora. A perforina é uma proteína que guarda forte homologia com o componente C9 do sistema complemento e os poros formados na membrana plasmática também se assemelham aos que ocorrem após ativação do referido sistema. Entre os demais componentes presentes nos grânulos, os mais importantes são os membros da família das granzimas, serina-proteases altamente específicas, que no meio acídico dos grânulos se mantém inativas. As granzimas A e B são as mais abundantes e parecem ser os principais responsáveis pela destruição do alvo, especialmente a granzima B, que induz apoptose através da ativação da via das caspases. Na realidade a granzima B tem um amplo espectro de substratos e, dependendo do contexto, a enzima pode promover a morte celular por ativação das caspases, rompimento de mitocôndrias e clivagem do BID para citocromo c, fragmentação de DNA por desrepressão da CAD ou por clivagem de proteínas estruturais na membrana nuclear. A granzima A, por sua vez, induz morte celular por uma via independente das caspases, provocando danos em fitas simples de DNA e rápida perda de integridade da membrana plasmática. Essa enzima ainda provoca a destruição do envelope nuclear por agir sobre a laminina e desencadeia a destruição do DNA através de sua ação sobre as histonas. Além das granzimas A e B, os grânulos contém os demais membros da família dessas serina proteases (C, D, E, F, G, H, K e M), a calrreticulina (inibidora das perforinas) e a família das catepsinas (que ativam as granzimas ou que protegem a célula efetora de autodestruição). As granulosinas, também presentes nos grânulos, parecem ter sua ação preferencialmente dirigida à destruição de microrganismos. Células NK podem também expressar receptores como FasL e TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), que induzem a apoptose da célula alvo através da ativação de DNAse. Além da indução de morte celular programada, as células NK podem destruir o alvo por indução de lise osmótica, provocando perda de material intracelular e entrada de água através dos poros formados. A ação da perforina parece ser fundamental para que qualquer célula citolítica exerça sua função efetora, visto que animais destituídos dessa proteína não conseguem destruir as células alvo in vitro e os demais componentes dos grânulos não são suficientes, por si só, para provocar a lise ou apoptose do alvo. Assim, a essa interação entre as membranas celulares, que pode durar de poucos minutos a horas, denomina-se lethal hit, pois mesmo após o desligamento das células o alvo já está com sua morte programada. Células NK A atividade "natural killer" (NK) é desempenhada por células linfóides mononucleares não-aderentes, não T e não B, presentes no sangue

3 periférico e vários órgãos como o baço e pulmão. Estas células reconhecem antígenos tumorais de modo não-restrito pelo MHC e sem a necessidade de sensibilidade prévia. Deste modo, atuam rapidamente e parecem constituir a principal linha de vigilância imunológica. Sabe-se, hoje, que a interação da célula NK com moléculas de histocompatibilidade ocorre através de diferentes receptores presentes em sua superfície. De acordo com sua estrutura, os receptores das células NK humanas podem ser agrupados em 2 categorias, os receptores Ig-símiles (KIR e LIR) e os lectina-símiles (CD94/NKG2 e NKG2D) A molécula NKG2D é uma proteína da família das C-type lectinlike receptors, que apresenta apenas 20-30% de homologia com as outras NKG2 (A/B, C ou E). É um receptor ativador homodimérico expresso por células NK, CD8 + e Tγδ e que fica ligado à molécula adaptadora DAP 10, através do qual desencadeia a lise de certas células tumorais. Diferentemente dos heterodímeros CD94/NKG2, que reconhecem as moléculas HLA-E, os receptores NKG2D interagem com as estruturas homólogas às moléculas CPH-I, MICA e MICB, compostos de domínios α1, α2 e α3 das moléculas de classe I, mas sem a cadeia β2-microglobulina nem o peptídeo associado. Essas estruturas são escassas na superfície de células normais, porém apresentam-se em densidade elevada nos tumores de células epiteliais servindo, portanto, como importante alvo para a ação citotóxica das células NK Os receptores KIR (killer cell Ig-like receptors), também conhecidas como CD158, correspondem a uma série de moléculas que interagem com estruturas CPH-I. Em geral, os receptores KIR3D reconhecem alelos HLA-A e B, enquanto KIR2D reconhecem alelos HLA- C, havendo pequenas variações na estrutura dos receptores que os tornam aptos a interagirem com os diferentes alótipos codificados por cada um dos loci gênicos. Embora se acredite que a função principal dos KIRs seja promover uma varredura sobre a expressão normal de CPH-I, o reconhecimento não é totalmente independente do peptídeo ligado ao CPH, como demonstrado pelo fato de que substituições de aminoácidos nas porções 7 e 8 de um nonâmero peptídico resulta em interação do conjunto com um receptor diferente. Embora se apresentem pré ativadas no organismo, a atividade destas células pode ser exacerbada pela presença de citocinas como a IL-2 e os vários tipos de interferon. Estes produtos têm a propriedade também de induzir a atividade citotóxica em células NK que ainda não tenham desenvolvido seu potencial efetor. Células ativadas pela IL-2 são denominadas LAK cells (lymphokine-activated killer cells). O fato de que as células NK respondam a estas citocinas, indica que após o desenvolvimento de resposta especifica pelas células T, os dois tipos celulares podem atuar em sinergismo contra o tumor. Neutrófilos Em paralelo com as células NK, os neutrófilos parecem constituir um importante mecanismo primário de vigilância imunológica, atuando efetivamente no desenvolvimento de reação inflamatória no local de implante do tumor. Além de atuar diretamente na citólise das células tumorais pela secreção de enzimas proteolíticas e radicais de oxigênio, os neutrófilos ainda tem a capacidade de atrair ao local outras células imunocompetentes como os macrófagos e linfócitos. Macrófagos Como em outras ocasiões de desenvolvimento da resposta imune, os macrófagos atuam em 2 momentos importantes. Na apresentação de antígenos e como células efetoras da destruição do tumor. Como células apresentadoras os macrófagos são particularmente importantes nas infecções virais, apresentando antígenos virais associados aos Ag de classe II aos linfócitos T helper. No caso de tumores induzidos por outros agentes, os macrófagos podem ser importantes na apresentação de antígenos solúveis secretados pelas células tumorais ("Shedding" de Ag tumorais). Como células efetoras, os macrófagos precisam ser ativados por interferon gama produzido pelas células Th, para que desenvolvam sua atividade citolítica (tumoricida) e citostática, Estes efeitos são possíveis pela produção e secreção de produtor como enzima proteolíticas, água oxigenada (H 2O 2), óxido nitrico (NO) e fator de necrose tumoral (TNF). ADCC O fenômeno de ADCC ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos é mediado por anticorpos específicos e células que apresentem receptores para a porção Fc de IgG. Assim, há uma integração entre a resposta adaptativa (Ig) e a natural (NK, K e M ) na tentativa de destruição das células malignizadas Papel das citocinas na ação antitumoral das células NK Os primeiros estudos direcionados à avaliação da interação entre as citocinas e as células NK foram delineados para investigar o efeito de diferentes citocinas sobre o comportamento in vitro e in vivo dessas células. Um dos achados mais importantes nesse aspecto foi a descoberta precoce de que a IL-2 estimula a atividade lítica CPH-independente. As células NK apresentam toxicidade variada contra diferentes células alvo e que a incubação das células com IL-2 ou interferon do tipo I (/) resulta em potente estimulação da atividade lítica. Esses linfócitos ativados por IL-2 foram denominados LAK cells (lymphokine-activated killer cells) por Grimm, observando-se posteriormente que essa função é prioritariamente desempenhada pelas próprias células NK. Foi também amplamente demonstrado que a IL-2 medeia a atividade antitumoral tanto em modelos experimentais quanto em estudos clínicos. Nesse período foram realizados vários trabalhos clínicos para avaliar a eficiência da imunoterapia antitumoral, observando-se que entre os pacientes com melanoma que receberam transferência passiva de linfócitos infiltrantes do tumor (TIL) estimulados in vitro com IL-2, 33% apresentaram resposta completa ou parcial ao tratamento. A infusão contínua de altas doses de IL-2 intravenosa ou esplênica e subseqüente transferência adotiva de células LAK em 9 pacientes com melanoma que apresentavam metástases hepáticas, também resultou em resposta completa ou parcial em 1/3 dos pacientes, com aumento da sobrevida estimada em meses. O mesmo grupo observou também que o tratamento de pacientes com metástases hepáticas de melanoma, através de inóculo intraportal de IL-2 e LAK mostra-se mais eficaz que o tratamento sistêmico, indicando um comportamento diferenciado entre as células mais próximas ao sítio tumoral. A mesma proporção de pacientes com tumor cerebral respondeu ao tratamento local com IL-2/LAK, demonstrando regressão total ou parcial do tumor na avaliação por tomografia e sinais clínicos. Além da resposta clínica ao tratamento com IL-2/LAK ser considerada relativamente baixa, muitos autores relataram efeitos adversos importantes como disfunções pulmonares que podiam determinar insuficiência respiratória em alguns pacientes, trombocitopenia por destruição dos progenitores de megacariócitos, alterações nos processos de coagulação, isquemia de cólon e diarréia severa, além de sintomas menores como alterações cutâneas. Assim, as propostas de Rosemberg de utilização de IL-2/LAK na terapia antitumoral não redundaram em uma técnica terapêutica segura, em vista da dificuldade de se estabelecer uma dose IL- 2/LAK que fosse eficaz com o mínimo de reações adversas ao paciente. Um aspecto importante a ser levado em consideração é o fato de que, em geral, os testes clínicos para as propostas terapêuticas novas são aplicados em pacientes em estágio avançado da doença e, geralmente, resistentes aos tratamentos convencionais, fato que dificulta sobremaneira a obtenção de dados conclusivos sobre a eficácia dos tratamentos propostos, bem como a padronização de doses eficazes seguras. A IL-15, uma citocina cuja estrutura apresenta alguma homologia com a IL-2 também tem sido estudada quanto ao seu potencial antitumoral. Essa citocina é um fator crucial para o desenvolvimento das células NK na medula óssea tanto para o homem quanto para o camundongo, sendo produzida no estroma da medula óssea. A IL-15 interage com receptores triméricos (IL-15R) presentes em 99% das células NK, cuja cadeia α associa-se às mesmas cadeias β e γ do IL-2R, A citocina tem a capacidade de induzir a diferenciação in vitro de células hematopoéticas progenitoras em células NK e é requerida para o desenvolvimento e homing das células NK, NKT, subpopulações de linfócitos T CD8 +, Tγδ e linfócitos intestinais intraepiteliais (IELs) como demonstrado através de estudos experimentais com camundongos knock out. Além disso, in vitro a IL-15 induz proliferação e sustenta a sobrevida e funções efetoras das células NK, de modo mais intenso que a IL-2. Além da homologia entre os receptores IL-15R e IL-2R, a IL-15 apresenta homologia com a própria IL-2 e ambas promovem a produção de INF-γ pelas células NK, abrindo a possibilidade de seu uso na imunoterapia. O fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e os interferons do tipo (IFN-α e β) inibem a ocorrência de metástases hepáticas do carcinoma 26 de cólon em camundongos, efeito atribuído à capacidade dessas citocinas de aumentar a atividade NK, tanto isoladamente quanto em sinergismo. Outros autores oservaram que o IFN-α humano recombinante inibe a ocorrência de metástases pulmonares desse carcinoma. Depois da IL-2, a citocina melhor estudada em relação à ação antitumoral é a IL-12, um potente estimulador das células NK. Lieberman et al. observaram que linfócitos humanos do sangue periférico, a IL-12 aumenta a atividade NK e ADCC contra linhagens de células de carcinoma de cólon humano. Essa citocina age sobre os linfócitos T e NK aumentando

4 a geração e atividade citotóxica dessas células, além de induzir a produção de INF-γ e ser a maior responsável pela ativação de células TH1 e, conseqüentemente, células citotóxicas CD8 +. Assim, no modelo de melanoma murino B16, Kodama et al. observaram que a ação da IL-12 depende essencialmente da participação das células NK que matam as células tumorais de modo dependente da perforina. Martinolli et al. observaram que massas tumorais de células do carcinoma C26 de cólon, transfectadas com genes de IL-12, são infiltradas por células NK e linfócitos CD8 +. O autores observaram que o tratamento in situ com anti-cd4 aumenta a infiltração dessas células, o que, à luz dos conhecimentos atuais, pode ter sido decorrente da eliminação das células T reg (CD4 + /CD25 + ) O linfoma experimental de Burkitt também se mostra sensível à ação da IL-12, com infiltração de células NK circundando pequenos vasos. Sob ativação com IL-12, as células se tornam citotóxicas para células endoteliais, provavelmente através da liberação de INF-γ, indicando o envolvimento da IL-12 e NK como supressores de neovascularização. A ação antiangiogênica da IL-12 não é, entretanto, dependente de NK, visto que a citocina inibe a angiogênese de tumores murinos ou humanos em camundongos SCID depletados de NK. No plano das investigações clínicas, vários trabalhos também têm testado a importância da IL-12 na resposta antitumoral e alguns autores observaram que a injeção i.v. de IL-12 em pacientes com câncer resulta em aumento na atividade NK e proliferação de linfócitos T. Essa observação, entretanto, não se aplica a uma série de outros tumores clínicos, de forma que o emprego dessa citocina na terapia antitumoral também não atendeu às expectativas geradas através dos estudos experimentais. Descoberta mais recentemente (2000) a IL-23 é outra citocina com significativo efeito estimulador da atividade NK. Trata-se de um heterodímero formado pela subunidade p40 da IL-12, ligada a uma subunidade p19, cuja estrutura apresenta alguma semelhança com a IL-6, com o G-CSF e menor homologia com a p35 da IL-12. De acordo com os autores, essa citocina atua preferencialmente sobre linfócitos T de memória, induzindo sua proliferação e a produção de INF-γ, deferindo, portanto, da IL-12 que tem ação preferencial sobre linfócitos T virgens. estudo utilizando em uma linhagem de células tumorais transfectadas com os genes da IL-23 mostra que sua produção in situ reduz a tumorigenicidade e ocorrência de metástases da célula de carcinoma de cólon 26. A citocina reduz significativamente a ocorrência de metástases, mas é menos eficiente que a IL-12, talvez porque essa última é mais eficiente em desencadear uma resposta celular específica contra os antígenos tumorais. A IL-21, produzida por linfócitos T CD4 + ativados, também apresenta homologia com IL-2, IL-4 e IL-15 e promove expansão e diferenciação in vitro de NK, a partir de células progenitoras da medula óssea e aumenta a atividade lítica dessas células. O inóculo de DNA plasmidial com os genes da IL-21 induz produção constante da citocina, mantendo seus níveis séricos elevados e esse tratamento inibe o crescimento do melanoma B16 e do fibrosarcoma MCA-205. A depleção in vivo de CD4 + ou CD8 + não afeta o efeito antitumoral da IL-21, mas a depleção de NK abole completamente a resistência dos animais ao crescimento tumoral, evidenciando a importância dessas células no combate a melanomas. Mecanismos de Evasão Embora esteja claro que o sistema imune pode responder à células tumorais, o fato de que muitos indivíduos morrem a cada ano de câncer, sugere que a resposta imune ao tumor é ineficaz. Assim, o estabelecimento e desenvolvimento de um tumor, pode depender de falhas no sistema imune do hospedeiro ou de fatores inerentes ao próprio tumor, permitindo que as células tumorais consigam escapar ao controle do sistema imune. 1. Alguns tumores são fracamente imunogênicos em alguns hospedeiros, por deficiência do próprio hospedeiro em processar e apresentar adequadamente os Antígenos tumorais. 2. A expressão moléculas do MHC pode estar sub-regulada nas células tumorais, dificultando o reconhecimento dos Ag-tumorais pelas células imunocompetentes, especialmente CTLs. 3. Alguns animais são totalmente tolerantes a um determinado tumor seja por causa de uma exposição neonatal seja por exposição às formas tolerogênicas do tumor. Ex. 1) O desenvolvimento de tumor mamário induzido por vírus em animais adultos, anteriormente infectados com o vírus por amamentação neonatal. 4. A cinética do crescimento tumoral pode permitir o estabelecimento de tumores imunologicamente resistentes antes do desenvolvimento de uma resposta imune efetiva. - Implantação furtiva - pequenas doses - desenvolvimento do tumor - Doses maiores - resposta - Doses muito grandes - tumor 5. Mutação e seleção de células tumorais que perderam a expressão de proteínas imunogênicas. 6. Modulação antigênica que implica em perda (shedding), inibição da expressão, ou endocitose dos Ags tumorais (p. ex. após interação com Ac) sem alterar as características de crescimento do tumor "Shedding" (liberação dos antígenos de superfície para o meio extracelular) com formação de imunocomplexos circulantes. Os I.C. podem bloquear células NK através da ocupação de seus receptores para Fc de IgG ou induzir a geração de células supressoras Endocitose de imunoglobilinas que se ligam aos antígenos de superfície e até mesmo de complexos MAC que se formam na superfície da célula após ativação do sistema complemento 7. Mascaramento antigênico por moléculas de superfície como o mucopolissacáride contendo ácido siálico, produzido em maior quantidade pelas células tumorais que pelas células normais. 8. Ativação do sistema de coagulação e formação de um casulo de fibrina, dificultando o acesso de elementos do sistema imune 9. Imunossupressão por produtos do tumor. Ex. TGF β, prostaglandinas. 12. Enhancement tumoral - A presença de anticorpos além de ineficientes em combater células tumorais pode facilitar o escape das mesmas, através do bloqueio dos antígenos reconhecíveis pelas células Tc ou NK. Associado ao fenômeno de shedding os IC formados poderão estar bloqueando a ação de NK e M. Imunoterapia Adjuvantes imunológicos Existem alguns protocolos de imunoterapia que envolvem a ativação não-específica dos sistema imune para aumentar a resposta às células tumorais. Vários adjuvantes, cujos efeitos potencializadores foram demonstrados na resposta a microrganismos têm mostrado eficiência em aumentar a resposta anti-tumoral. O adjuvante mais amplamente utilizado na imunoterapia antitumoral é o BCG (M. bovis - bacilo de Calmette- Guérin). O BCG ativa macrófagos e assim aumenta a produção de IL-1 e expressão de B7 na membrana. As duas moléculas podem mediar o sinal coestimulatório necessários para a ativação de célula TH, resultando no aumento generalizado da resposta humoral e celular. Os efeitos do BCG são mais claramente observados quando injetado diretamente no tumor, promovendo imunoestimulação local (no interior da massa tumoral). Os estudos clínicos mostraram efeitos benéficos do tratamento com BCG, como o retardamento do crescimento de metástases de tumor de mama e melanoma maligno em uma pequena parcela dos pacientes e atualmente só é indicada para casos de câncer superficial de bexiga. Outros agentes têm sido estudados como imunoestimulantes, porém com menor eficiência que o BCG, entre eles, Corinebacterium parvum, uma droga anti-helmíntica chamada levamisole, e dois mitógenos chamados azimezone e isoprinosina. Terapia com citocinas A clonagem de genes de várias citocinas facilitou sua produção em grande escala. Vários protocolos experimentais e clínicos foram desenvolvidos para o uso isolado ou combinado de citocinas recombinantes para estimular a resposta imune aos tumores. Entre as citocinas estudadas com este propósito encontramos os interferons alfa, beta e gama, IL-1,2,4 e 5, GM-CSF e TNF. Apesar de alguns resultados satisfatórios, existem ainda uma série de obstáculos a serem vencidos até as citocinas possam ser adotadas como terapêutica. O principal obstáculo prático é justamente a grande complexidade da rede de citocinas que torna difícil saber com precisão como o uso de uma determinada citocina vai afetar a produção in

5 vivo de outras citocinas. Mesmo no caso de citocinas que atuem de modo antagônico, a prática tem demonstrado que a aplicação de um protocolo objetivando o aumento de um dos ramos da resposta pode resultar em sua supressão (de acordo com a dose, frequencia e as características do tumor), Interferons A maioria dos experimentos clínicos com interferon têm sido realizados com interferon alfa. Os estudos mostram que a administração diária deste produto induz regressão completa ou parcial do tumor em pacientes com leucemias, linfomas e mielomas. No caso de tumores sólidos os estudos foram satisfatórios contra melanoma maligno, sarcoma de Kaposi, câncer renal e câncer de mama. A efetividade do IFN alfa depende, em parte, do grau de malignidade do tumor. Por exemplo, entre pacientes com linfoma não-hodkins tratados com doses diárias de INF alfa, 50% daqueles com nível de malignidade baixa ou intermediária exibiram remissão completa ou parcial. Contrariamente, os pacientes que apresentaram tumores com alto grau de malignidade falharam completamente em responder ao tratamento. Os mecanismos pelos quais o interferon atua no combate ao tumor incluem a indução de expressão dos antígenos de classe I nas células tumorais, aumento da expressão de classe II nos macrófagos, inibição da divisão celular, aumento da atividade de Tc, NK e macrófagos. Fator de necrose tumoral (TNF) Tem sido demonstrado que os fatores de necrose tumoral (alfa e beta) desempenha atividade antitumoral direta, matando células tumorais e reduzindo o índice de proliferação das mesmas. Na presença destes fatores, o tumor sofre visível necrose hemorrágica e regressão. O TNF-alfa mostra também a capacidade de inibir a angiogênese nos tumores, através da destruição de células endoteliais ao redor da massa tumoral, diminuindo, desta forma a o fluxo de sangue e de oxigênio necessários para o crescimento tumoral. Apesar dos resultados encorajadores, o TNF apresenta algumas limitações. Seu efeito é mais eficiente se aplicado diretamente no tumor, embora em alguns casos mesmo esta forma de aplicação não apresente resultados satisfatórios. Sua meia vida muito curta requer a aplicações freqüentes. Além disso, os pacientes podem apresentar efeitos adversos como febre, mudanças na pressão sanguínea e diminuição nas contagens de leucócitos. Células LAK e TIL Trabalhos experimentais têm demonstrado que linfócitos podem ser ativados in vitro contra antígenos tumorais, através do cultivo de linfócitos com células tumorais irradiadas, na presença de IL-2. Estes linfócitos apresentam-se mais efetivos em destruir o tumor que linfócitos não-tratados, quando são reinjetados em animais portadores de tumor. Entretanto, a obtenção de tais células in vitro e em quantidade suficiente e com especificidades apropriadas constitui uma barreira bastante difícil de ser transposta para o uso terapêutico destas células. Em 1980, Rosemberg, trabalhando com este método de sensibilização de linfócitos observou que na presença de grandes quantidades de IL-2 e mesmo sem a presença de antígenos tumorais, era possível gerar uma grande quantidade de linfócitos ativados, capazes de destruir células tumorais frescas. A estas células ele denominou LAK cells (lymphokine-activated killer cells). Em estudos posteriores, este pesquisador observou que a infusão de células LAK juntamente com IL-2 recombinante em animais portadores de tumor resultava em efetiva destruição das células tumorais. As células LAK, são representadas por uma população heterogênea de células com características de NK e de NC (natural cytotoxic cells), que destroem tumores sem a necessidade de especificidades definidas. Vários experimentos clínicos foram posteriormente desenvolvidos, utilizando-se células LAK autólogas associadas à IL-2 recombinante. Na triagem mais extensa realizada em 1987, foram estudados 222 pacientes, dos quais 16 apresentaram completa regressão do tumor. Entretanto, ocorrem efeitos adversos, devidos à grande quantidade de IL-2 requerida para a ativação das LAK, O mais importante destes efeitos é uma síndrome vascular que envolve a migração de leucócitos e plasma do sangue periférico para os tecidos, resultando em choque. Os tumores contém em seu interior, linfócitos que presumivelmente participando da resposta anti-tumoral. Algumas destas células podem ser isoladas a partir de biópsias, cultivadas e expandidas in vitro pelo uso de IL-2. Estes linfócitos são chamados de TIL cells (tumorinfiltrating lymphocytes). Muitas destas células parecem ter atividade não específica como ocorre com as NK, porém as células TIL têm atividade citolítica específica para os tumores autólogos. O uso destas células é interessante porque apresentam elevada atividade antitumoral e requerem uma concentração 100 vezes menor de IL-2 para sua ativação dos que as LAK. Como exemplo pode ser citado um trabalho no qual células TIL foram geradas a partir de biópsias de melanomas e de câncer renal. A reinjeção das células autólogas nos pacientes resultou em regressão parcial de 29% dos carcinomas renais e 23% dos melanomas. Terapia gênica Em 1991, 50 pacientes com melanoma maligno avançado tiveram suas células TIL modificadas por engenharia genética, pela introdução de genes que codificam a produção de TNF alfa, seguindo-se sua reintrodução nos pacientes autólogos. O principio deste tratamento está no fato de que as células TIL ao atacarem as células tumorais podem liberar elevadas concentrações de TNF, mediando sua destruição. Em outro trabalho desenvolvido no mesmo ano, células tumorais, isoladas de melanoma maligno foram modificadas geneticamente com genes de IL-2 ou de TNF. A idéia no caso, é que estas células, quando reintroduzidas nos pacientes, sejam reconhecidas pelas células imunocompetentes, sendo ativadas pelas citocinas produzidas pelas células modificadas. Este poderia ser um modelo de vacina contra tumores. De modo similar ao protocolo anterior, introduziu-se em células de melanoma, genes responsáveis pela expressão do antígeno HLA B7 (MHC de classe I), tornando-a mais imunogênica para a ação de células T específicas. Anticorpos monoclonais Vários anticorpos monoclonais têm sido testados experimentalmente como agentes terapêuticos contra o câncer, através da preparação de imunotoxinas. Estes agentes consistem da cadeia inibidora de uma toxina (p.ex. toxina diftérica), ligada a um anticorpo dirigido contra antígenos tumorais. Estudos in vitro têm demonstrado que estes projéteis mágicos podem matar células tumorais sem danificar células normais. Em outro modelo de estudos, têm sido utilizados anticorpos dirigidos contra linfócitos T. Por exemplo, a administração de anticorpos anti-cd3 poderia induzir a ativação inespecífica dos linfócitos T. Em camundongos inoculados com células de fibrosarcoma, o tratamento conseguiu proteger cerca de 60% dos animais. Quando os animais receberam uma segunda dose do tumor, eles mostraram-se resistentes, não desenvolvendo câncer. Um dos problemas com relação a este método é que o limite entre a estimulação e a supressão ocasionada pela presença de anticorpos anti T, é muito sutil, o que constitui um risco muito grande para seu uso humano. Outra possibilidade de uso de anticorpos é pela produção de heteroconjugados, isto é, imunoglobulinas com duas especificidades. Assim, anticorpos podem ter um de seus sítios de ligação específico para antígenos tumorais e o outro específico para o marcador CD3. A ligação do anticorpo com cada um dos antígenos que reconhece resulta na aproximação das células tumorais e os linfócitos T, aumentando sua atividade destrutiva. Também têm sido estudados os anticorpos contra receptores de fator de crescimento, presentes na superfície das células tumorais. Deste modo, a ligação dos anticorpos nos receptores inibiria a interação dos fatores de crescimento específicos, impedindo sua atividade. Vacina antitumoral Um modelo bastante animador de terapia antitumoral é representado pelo uso de células tumorais autólogas, mortas por radiação X e reinjetadas nos pacientes conjuntamente com BCG. Trabalhos recentes demonstram que cerca de 25% dos pacientes com melanoma maligno submetidos a este tipo de tratamento apresentam remissão total ou parcial do tumor. Um problema desse tipo de terapia é o risco de que células tumorais resistentes à radiação permaneçam viáveis e proliferem no paciente, gerando um tumor mais resistente. Outra forma de vacina em desenvolvimento por diversos grupos é baseada no uso de células dendríticas (DC). O princípio dessa terapia é a obtenção e sensibilização in vitro de DC autólogas ou alogênicas com antígenos tumorais, seguida de transferência passiva para o paciente. Os estudos envolvendo pacientes com diferentes tipos de tumor têm apresentado bons resultados em alguns dos indivíduos mas a otimização depende do estágio de desenvolvimento da doença, características particulares do tumor e disponibilidade de DCs para repetições dos inóculos.

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