CENTRO DE ENSINO FACULDADE SÃO LUCAS. Keila de Assis Vitorino

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1 CENTRO DE ENSINO FACULDADE SÃO LUCAS Keila de Assis Vitorino PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FíSICO-QUÍMICA PARCIAL DE UMA FOSFOLIPASE A 2 BÁSICA DO VENENO DE Bothrops moojeni DO PARAGUAI Porto Velho RO 2015

2 KEILA DE ASSIS VITORINO PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FíSICO-QUÍMICA PARCIAL DE UMA FOSFOLIPASE A 2 BÁSICA DO VENENO DE Bothrops moojeni DO PARAGUAI Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Biomedicina da Faculdade São Lucas, para obtenção do grau de Bacharelado da Faculdade São Lucas. Orientador: Dr. Andreimar Martins Soares Porto Velho RO 2015

3 KEILA DE ASSIS VITORINO PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FíSICO-QUÍMICA PARCIAL DE UMA FOSFOLIPASE A 2 BÁSICA DO VENENO DE Bothrops moojeni DO PARAGUAI Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Biomedicina da Faculdade São Lucas, para obtenção do grau de Bacharelado da Faculdade São Lucas. Aprovado (a): de Dezembro de 2015 Presidente Membro 1 Membro 2 Membro 3 Porto Velho RO 2015

4 Agradecimentos Aos meus pais, Saulo e Ceir, pela confiança, pelo apoio e pelo exemplo que sempre me deram. Vocês são meu alicerce e minha maior riqueza. Aos meus irmãos, Katieli e Faelbe, pela paciência e por fazer parte da construção do ser humano que sou hoje. Aos meus colegas e amigos, principalmente a Rafaela, Micheli, Nauanny e Weusley, esses quatro anos foram mais alegres graças a vocês, torço muito pelo vosso sucesso. A Caio Calixto, obrigada por acreditar em mim mais do que eu mesma e pelo carinho de sempre. Meu orientador, Dr. Andreimar Soares, agradeço pelo conhecimento passado, apoio e confiança. Ao Ms. Jorge Alfonso, não tenho palavras para agradecer sua paciência e a dedicação em me ajudar em cada etapa desse trabalho. A Ms. Rafaela Diniz e toda equipe do laboratório CEBio, agradeço imensamente pelos ensinamentos, tudo que pude aprender com vocês levarei para sempre na minha vida.

5 RESUMO A purificação e a caracterização de biomoléculas do veneno de serpentes têm contribuído significativamente para o avanço das Ciências em Saúde, devido ao seu grande potencial biotecnológico. Essas enzimas estão envolvidas numa grande variedade de processos fisiopatológicos e de intoxicação. As fosfolipases A 2 (PLA 2 ) são as proteínas com maior prevalência nos venenos ofídicos e induzem diversos efeitos farmacológicos, como ação miotóxica, inibição da agregação plaquetária e efeito bactericida e antiparasitário. Esse trabalho descreve o isolamento e caracterização de uma PLA 2 básica Lys49 isolada do veneno de Bothrops moojeni, oriunda do Paraguai, por meio de duas etapas: uma Cromatografia de Troca Catiônica em coluna CM- Sepharose, que demonstrou 14 frações, e posteriormente uma Cromatografia de Fase Reversa em coluna C-18 da fração 13. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida a PLA 2 apresentou alto grau de pureza com massa molecular de aproximadamente 14 kda. A proteína foi dosada pelo método de Bradford, tendo a concentração de 0,67 mg/ml. A espectrometria de massa em MALDI apresentou dois picos, sendo que a PLA 2 apresentou massa molecular de ,67 Da e uma isoforma de ,73 Da. É importante isolar e caracterizar biomoléculas de diferentes espécies de serpentes, de diferentes regiões, e posteriormente usá-las como protótipo em ensaios experimentais para verificar seu potencial farmacológico e as diferenças que o habitat pode causar. Palavras-chave: Venenos de serpentes, PLA 2, purificação, Bothrops moojeni.

6 ABSTRACT Purification and characterization of snake venom of biomolecules have contributed significantly to the advancement of health sciences, because of its great potential biotechnology. These enzymes are involved in a variety of pathophysiological processes and intoxications. Phospholipases A 2 (PLA 2 ) are proteins with higher prevalence in snake venoms and induce various pharmacological effects, such as myotoxic action, platelet aggregation inhibition and antibacterial and antiparasitic effect. This work describes the isolation and characterization of a PLA 2 basic Lys49 isolated from the venom of Bothrops moojeni, originating in Paraguay, by means of two chromatographic steps: a cationic exchange chromatography on CM-Sepharose column, which showed 14 fractions, and a reverse phase chromatography on C-18 column of fraction 13. When subjected to polyacrylamide gel electrophoresis PLA 2 showed a high degree of purity with a molecular mass of approximately 14 kda. Protein was measured by the Bradford method, with the concentration of 0.67 mg / ml. The MALDI mass spectrometry showed two peaks, in which PLA 2 appear with molecular mass of Da and isoform Da. Is important to isolate and characterize biomolecules of different snake species in different regions and subsequently use them as a prototype in experimental tests to verify its pharmacological potential and differences that the habitat can cause. Keywords: Snake venoms, PLA 2, purification, Bothrops moojeni.

7 LISTA DE FIGURAS Gráfico 1 - Relação dos acidentes ofídicos no Brasil causados pela família Viperidae 10 Gráfico 2 - Relação dos acidentes ofídicos no Paraguai causados pelos principais gêneros de serpentes encontradas no país 11 Figura 1 - Bothrops moojeni 13 Figura 2 - Especificidade de hidrólise de uma molécula de 1,2- diacilglicerolfosfolipídeo pelas fosfolipases 14 Figura 3 - Representação do sítio de ligação ao cálcio de uma PLA 2 Asp49 e a região homóloga de uma PLA 2 Lys49 16 Figura 4 - Cromatografia de Troca Catiônica do veneno bruto de Bothrops moojeni 25 Figura 5 - Eletroforese das frações da cromatografia de troca catiônica do veneno de Bothrops moojeni 27 Figura 6 - Cromatografia de Fase Reversa da fração F13 oriunda de cromatografia de troca catiônica 28 Figura 7 - Gel de poliacrilamida SDS-PAGE da PLA 2 oriunda de cromatografia de fase reversa 29 Figura 8 - Espectrometria de Massa da PLA 2 parcialmente purificada 29

8 SUMÁRIO INTRODUÇÃO SERPENTES PEÇONHENTAS ACIDENTES OFÍDICOS GÊNERO Bothrops Bothrops moojeni COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES FOSFOLIPASE A FOSFOLIPASES A 2 DE VENENOS DE SERPENTES FOSFOLIPASE A 2 LYS RELEVÂNCIA DOS ESTUDOS DE VENENOS DE SERPENTES OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS OBTENÇÃO DO VENENO CROMATOGRAFIA DE TROCA CATIÔNICA DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DE BRADFORD ELETROFORESE SDS-PAGE CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA ESPECTROMETRIA DE MASSA RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO... 31

9 9 INTRODUÇÃO Estão catalogadas cerca de espécies de serpentes no mundo, que são agrupadas em 465 gêneros e 20 famílias. O Brasil possui representantes em 9 famílias, 75 gêneros e 321 espécies (SILVA e SPERANDIN, 2005). Enquanto no Paraguai existem 100 espécies de serpentes, sendo 10 venenosas (VERA, et al., 2006). Duas famílias são consideradas peçonhentas, Viperidae e Elapidae, sendo a primeira com maior especialização no aparelho venenífero, tendo um sistema de produção e estocagem bastante complexo (CUNHA e MARTINS, 2012). A família Viperidae é composta pelos gêneros Bothrops, Bothriopsis, Bothrocophias, Crotalus e Lachesis (BERNARDE, 2009). As serpentes do gênero Bothrops, também conhecidas como jararacas, estão divididas em mais de 30 espécies e subespécies, distribuídas do sul do México até o norte da Argentina. São altamente agressivas, representando cerca de 90% dos casos de acidentes ofídicos no Brasil (SILVA e SPERANDIN, 2005).

10 SERPENTES PEÇONHENTAS As serpentes são répteis vertebrados e carnívoros, que podem ser classificadas em dois grupos: peçonhentas, que conseguem inocular veneno no corpo de sua presa e não peçonhentas (FIOCRUZ, 2009). As serpentes peçonhentas possuem glândulas de veneno desenvolvidas associadas ao aparelho inoculador, que tem como função matar e digerir suas presas (BERNARDE, 2009). 1.2 ACIDENTES OFÍDICOS Os acidentes ofídicos possuem grande importância médica, devido sua gravidade e frequência. Acontece em todas as regiões do Brasil cerca de casos de acidentes por ano, sendo um problema de saúde pública se não tratado com sorologia precocemente (BRASIL, 2010). Do ponto de vista epidemiológico de acidentes ofídicos, o gênero Bothrops é o mais importante, correspondendo a 87,5% dos casos de envenenamento no Brasil, como mostra a Figura 1 (BRASIL, 2007). No Paraguai acontecem aproximadamente 400 acidentes com serpentes peçonhentas por ano, sendo 92% causados pelo gênero Bothrops (Figura 2) (VERA et al., 2006). Gráfico 1: Relação dos acidentes ofídicos no Brasil causados pela família Viperidae. Fonte: TEIXEIRA, 2009.

11 11 Gráfico 2: Relação dos acidentes ofídicos no Paraguai causados pelos principais gêneros de serpentes encontradas no país. Fonte: Adaptado de VERA et al., O veneno dessas serpentes manifesta ações proteolíticas, com edema, bolhas e necrose, ações coagulantes, que podem causar incoagulabilidade sanguínea, e ações hemorrágicas (BRASIL, 2010). As manifestações locais da picada por serpentes do gênero Bothrops são dor e edema de instalação precoce e de rápida progressão, equimoses, sangramentos e bolhas, que podem estar acompanhadas de necrose. Além disso, pode-se observar manifestações sistêmicas, como gengivorragias, epistaxes, hematêmese e hematúria. Hipotensão arterial, choque, oligoanúria ou hemorragias intensas definem o caso como grave (FUNASA, 2011). O tratamento utilizado é a soroterapia com antiveneno específico. Quando o antiveneno é administrado precocemente os efeitos sistêmicos são normalmente revertidos, entretanto os efeitos locais são dificilmente neutralizados, podendo evoluir para necrose com subsequente perda do membro afetado (GUTIÉRREZ et al., 2007). Algumas moléculas presentes em plantas medicinais possuem propriedades inibitórias para esses efeitos locais, como o ácido aristolóquico (papode-peru), ácido rosmariníco (erva-baleeira) e ácido cafeico (assa-peixe) (BICUDO, 2015). Da Silva e colaboradores (2007) isolaram saponinas de Pentaclethra macroloba que neutralizaram metaloproteases de B. atrox. Outras espécies, como Curcuma longa, Casearia sylvestris, Eclipta próstata, Calendula officinalis,

12 12 Hypericum brasiliense demonstram atividade inibitória sobre toxinas do veneno de serpentes (SOARES et al., 2005). 1.3 GÊNERO Bothrops O nome Bothrops, que vem do grego bothros, fosseta e ops que significa olho ou face, faz alusão à fosseta loreal, localizada entre a narina e o olho dessas serpentes (CAMPBELL e LAMAR, 2004). O interesse científico pelas serpentes do gênero Bothrops vem aumentando nos estudos de Herpetofauna da América Latina, pois são os maiores causadores de acidentes ofídicos (CAMPBELL e LAMAR, 1989). Os representantes do gênero mostram uma grande diversidade no tamanho, variando entre 30 a 180 cm. Habitam com maior frequência ambientes terrícolas, mas também podem demonstrar hábitos semi-arborícula (BERNARDE, 2009). Quanto à alimentação, os exemplares juvenis preferencialmente se alimentam de centípedes, lagartos e anfíbios, enquanto os adultos escolhem aves e roedores (CAMPBELL e LAMAR, 2004). Essas serpentes possuem bastante diversidade na composição e atividade do veneno, que pode ter implicação na soroterapia de tratamento, na sua produção e em estudos evolutivos das toxinas e de taxonomia (SANTORO et al., 2009). 1.4 Bothrops moojeni Essa serpente, conhecida popularmente como caissaca, é identificada por possuir glândulas de veneno associadas com dentição maxilar reduzida e um par de presas caniculares de grande mobilidade (CAMPBELL e LAMAR, 2004). Podem alcançar 230 cm de comprimento, entretanto a maioria não chega a 160 cm, sendo as fêmeas maiores que os machos (NOGUEIRA et al., 2003).

13 13 Figura 1: Bothrops moojeni. Fonte: BERNARDE, A distribuição geográfica abrange Argentina, Paraguai e Brasil, ocorrendo nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Mato Grosso, Goiás, Bahia, Tocantins, Piauí e Maranhão (CAMPBELL e LAMAR, 2004). Essa serpente é responsável por grande parte dos acidentes ofídicos, sendo relatada como a mais frequente em um estudo feito por Rojas e colaboradores (2007). 1.5 COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES Venenos são secreções produzidas em glândulas especiais que quando em contato com um organismo causa efeitos deletérios e/ou letais. São usados em mecanismos de defesa e ataque, para imobilização, morte das presas e digestão (PIRES, 2006). Os venenos de serpentes são compostos por misturas complexas de proteínas (70 a 90%), carboidratos (10 a 30%) e pequenas proporções de lipídeos, aminas biogênicas, nucleotídeos, peptídeos e componentes inorgânicos (MOURA- DA-SILVA et al., 1990). Dentre eles, os venenos botrópicos são capazes de alterar drasticamente a homeostasia pela ação de algumas enzimas como fosfolipase A 2 PLA 2 ), metaloproteases e serinoproteases. Além dessas toxinas, ainda possuem proteínas que a atividade enzimática é ausente, como desintegrinas e lectinas do tipo C (BRAUD et al., 2000).

14 14 Teixeira (2009) descreve três principais atividades fisiopatológicas do veneno botrópico: 1) Atividade Inflamatória Aguda, causada pela ação de proteases, hialuronidases e fosfolipases; 2) Atividade sobre a Coagulação decorrente da ativação de fator X e protrombina; e 3) Atividade Hemorrágica, atribuída as metaloproteases. Mesmo os acidentes ofídicos podendo ser mortais, os venenos ofídicos possuem grande potencial terapêutico e são usados numa grande variedade de condições patológicas em medicina popular. Com o avanço das pesquisas nesse campo, já foram comprovadas a eficácia de tais tratamentos (KOH et al., 2006). 1.6 FOSFOLIPASE A 2 As fosfolipases são enzimas que degradam fosfolipídeos, classificadas em A 1, A 2, B, C e D de acordo com a ligação hidrolisada no fosfolipídeo, como mostrado na figura 2. As PLA 2 catalisam a hidrólise da ligação 2 acil éster de 3-sn-fosfolipídeos, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídeos (DENNIS e SIX, 2000). Figura 2: Especificidade de hidrólise de uma molécula de 1,2-diacilglicerolfosfolipídeo pelas fosfolipases. Fonte: CALDERON, 2012.

15 15 Além do seu papel no metabolismo de lipídeos estão intensamente ligadas à liberação de AA (ácido araquidônico), percursor de prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos que atuam na regulação do sono, resposta imune, inflamatória e percepção de dor (ARNI e WARD, 1996). Estas enzimas estão envolvidas com uma ampla variedade de processos fisiológicos e patológicos, o que explica o elevado interesse médico-científico. Segundo Schaloske e Dennis (2006), essa família de proteínas é composta por 15 grupos e seus subgrupos, incluindo cinco tipos distintos: PLA 2 s secretadas (spla 2 ), PLA 2 citosólicas (cpla 2 ), independentes de Ca 2+ (ipla 2 ), acetil-hidrolases de fatores de plaquetas (PAF-AH) e lisossomais. As spla 2 possuem Mr variando entre e Da, normalmente contendo de 5 a 8 pontes dissulfeto. São enzimas que em seu sítio ativo apresentam uma histidina e requerem presença do íon Ca 2+ para catálise. 1.7 FOSFOLIPASES A 2 DE VENENOS DE SERPENTES As PLA 2 s de veneno de serpentes (svpla 2 ) estão classificadas nos grupos I e II. As PLA 2 do grupo I estão presentes nos venenos das serpentes da família Elapidae, enquanto que as PLA 2 do grupo II encontram-se nos venenos dos Viperídeos (OWNBY et al., 1999). Embora ambos os grupos possuam estruturas altamente conservadas, como idêntica maquinaria catalítica e a presença de sete pontes dissulfeto, é possível identificar características individuais específicas, como a presença de um loop elapídico, formado por dois a três aminoácidos inseridos na região 52-65, no caso das PLA 2 do grupo I e uma extensão de cinco a sete aminoácidos na região C-terminal presente no grupo II (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011). Outra diferença importante consiste na posição de uma das sete pontes dissulfeto, pois nas PLA 2 dos Elapídeos observa-se uma ponte dissulfeto nas posições Cys11-Cys77, por outro lado, nos venenos dos Viperídeos, observa-se uma ponte dissulfeto na região Cys51-Cys133 (BURKE e DENNIS, 2011). As PLA 2 do grupo II são divididas em subgrupos, onde dois se destacam: PLA 2 Asp49, com um resíduo de ácido aspártico na posição 49, o que concede a essas enzimas atividade catalítica e PLA 2 Lys49, com um resíduo de lisina na

16 16 posição 49, causando baixa ou nenhuma atividade catalítica sobre substratos artificiais, mas com uma ampla variedade de efeitos farmacológicos nos organismos vivos (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011). A catálise da reação PLA 2 -fosfolipídeo envolve o ataque nucleofílico de uma molécula de água na ligação sn-2 do substrado fosfolipídico. O próton na posição 3 do anel imidazólico do resíduo His48 envolvido com o grupo carboxilato do Asp99, impede que ocorra rotação do anel imidazólico e mantém o nitrogênio na posição 1. Uma molécula de água promove então o ataque nucleofílico ao carbono do grupo éster do substrato e o anel imidazólico da His48 recebe um próton da molécula de água, facilitando a reação. Este próton é doado pelo anel imidazólico para o oxigênio, que forma o grupo álcool do lisofosfolipídeo a ser liberado juntamente com o ácido graxo. O íon Ca 2+, coordenado pelo resíduo Asp49, uma molécula de água e os átomos de oxigênio dos resíduos Gly30, Trp31 e Gly32 são responsáveis pela estabilização do intermediário reativo, funcionando como um cofator (MACKESSY, 2010). A substituição de um resíduo de Asp49 por Lys49 impede a coordenação de Ca +2 no sítio alostérico, que é então ocupado pela cadeia lateral da lisina, inativando o sítio catalítico e impossibilitando a reação enzimática (Figura 3) (ARNI e WARD, 1996). Figura 3: Representação do sítio de ligação ao cálcio de uma PLA 2 Asp49 e a região homóloga de uma PLA 2 Lys49. Fonte: ARNI e WARD, 1996.

17 17 Apesar de as PLA 2 Lys 49 e Asp 29 serem as mais conhecidas e estudadas, Polgár e colaboradores (1996) descreveram atividade enzimática significativa em PLA 2 com outros aminoácidos na posição 49, com o aspartato substituído por serina e a tirosina substituída por fenilalanina. Embora não seja descrita atividade enzimática das isoformas Lys49, as fosfolipases A 2 Lys49 apresentam uma grande variedade de efeitos farmacológicos, como miotoxicidade, atividade anticoagulante e edematogênica (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011). 1.8 FOSFOLIPASE A 2 Lys49 As PLA 2 s Lys49 são proteínas não glicosiladas contendo 121 resíduos de aminoácidos e massa molecular aproximada de 14 kda (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011). Uma característica bem específica do grupo de PLA 2 s Lys49 é a presença de um grande número de resíduos básicos, sendo que a lisina compreende 15% dos resíduos totais. A região C terminal é bastante rica em lisina, incluindo duas sequências de ligação a heparina, o que explicaria sua sensibilidade à neutralização pela heparina (OWNBY et al., 1999). É sugerido que a região C terminal seja responsável por diversos efeitos farmacológicos. Peptídeos sintéticos formados pelas regiões 115 a 129, correspondente a região C-terminal da miotoxina II de B. asper, pode induzir citotoxicidade e a mesma região da miotoxina AppK49 de A. piscivorus foi capaz de induzir mionecrose em ratos (LOMONTE et al., 1994). Foi proposto por Gutiérrez e Lomonte (1995) que resíduos de aminoácidos de cadeia lateral com propriedades básicas e apolares presentes na região hidrofóbica da extremidade C-terminal são relevantes para induzir danos na membrana. Acredita-se que as PLA 2 s Lys49 são enzimaticamente inativas devido à inversão da ligação peptídica Cys29-Gly30 e sua incapacidade estereoquímica em vincular o cofator íon cálcio e assim estabilizar o intermediário tetraédrico, que é observado na reação catalítica promovida por PLA 2 Asp49. Alguns estudos tentaram comprovar a existência de uma limitada atividade catalítica, porém foram revogados (WARD et al., 1998). Além da substituição de Asp49 por Lys49, existem outras

18 18 substituições que podem contribuir para a perda da atividade enzimática das PLA 2, como a substituição do resíduo Tyr28, que estabiliza o loop ligante de cálcio por uma interação com o resíduo de Gly35 (FERNANDES et al., 2010). A primeira atividade tóxica relatada para PLA 2 Lys49 foi a capacidade da mesma em induzir mionecrose local em roedores, quando injetados por via intramuscular (OWNBY et al., 1999). Além desta, outras atividades foram descritos como: (i) efeitos biológicos relacionados a desestabilização de membranas, tais como destruição de lipossomos, atividade microbicida, citotóxica, antitumoral, mitogênica e de bloqueio neuromuscular; (ii) efeitos relacionados as respostas inflamatórias, desencadeada como resultado de necrose muscular e edema; (iii) e efeitos pela interação com outras moléculas, como lipopolissacarídeo bacteriano, heparina e fator Xa, levando a inibição de sua bioatividade (LOMONTE e RANGEL, 2012). É bastante comum encontrar isoformas de PLA 2 s em uma mesma espécie, sendo dificultosa a separação das mesmas, porque possuem massa molecular, ponto isoelétrico e sequência primária muito semelhantes (GUTIÉRREZ e LOMONTE, 1995). Por exemplo, mais de dez isoformas de PLA 2 s foram relatadas para as espécies Naja naja, Daboia (Vipera russellii), Trimeresurus flavoviridis, Austrelaps superbus e Pseudechis australis (MACKESSY, 2010). Ketelhut e colaboradores (2003) isolaram da peçonha de B. jararacussu quatro isoformas de PLA 2 ácidas. Duas isoformas de PLA 2 foram purificadas do veneno de B. insularis por Cogo e colaboradores (2006). Além disso, foi relatado o isolamento de duas variantes de PLA 2 Lys49 do veneno de B. moojeni, comprovando essa variabilidade também no gênero Bothrops (PERCHUC et al., 2010). 1.9 RELEVÂNCIA DOS ESTUDOS DE VENENOS DE SERPENTES A purificação de componentes do veneno de serpentes serve a dois objetivos principais: entender a participação desses componentes no processo fisiopatológico do envenenamento e como protótipo de modelos com aplicações biotecnológicos. Por esses motivos, diversas PLA 2 s têm sido isoladas e caracterizadas (CALDERON, 2012).

19 19 É bastante discutida a relação entre dieta e a composição do veneno em Toxinologia e Herpetologia, alguns desses estudos apontam também outros fatores relacionados com essa variação, como nicho ecológico, diferentes tipos de presas, sexos dos indivíduos, ontogenia, habitat, distribuição geográfica e fatores sazonais, como temperatura e precipitação (SOUSA et al., 2013; LOMONTE et al., 2014). Considerando tais estudos, pode existir diferenças entre as PLA 2 s isoladas do veneno das mesmas espécies, que habitam lugares distintos. A biodiversidade oferece uma variedade de moléculas que podem possuir potencial aplicável em biotecnologia e ter utilidade na produção de novos fármacos (CALDERON et al., 2009). Um exemplo de grande sucesso na indústria farmacêutica é o Captopril, um anti-hipertensivo baseado no peptídeo potencializador de bradicinina do veneno de B. jararaca (CALDERON et al., 2010). A Eptibatida, encontrada no veneno da cascavel Sistrurus miliarius barbouri e o Tirofiban, isolado a partir da peçonha da víbora Echis carinatus agem no receptor GPIIb/IIIa, evitando agregação plaquetária e formação de trombos (HARVEY, 2014). Novos produtos baseados nas toxinas de serpentes têm sido elaborados, baseados no potencial antitumoral das lectinas e desintreginas e possível inibição de agentes bacterianos e protozoários (KOH et al., 2006). Muitas PLA 2 revelam atividade antimicrobiana. Páramo e colaboradores (1998) relataram atividade bactericida de PLA 2 Lys49 e Asp49 isoladas do veneno de B. asper sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas. MjTX-II, encontrada na peçonha de B. moojeni apresentou ação contra E. coli e C. albicans, além de atividade antiparasitária sobre Schistosoma mansoni e Leishmania ssp. (STÁBELI et al., 2006). Rodrigues e colaboradores (2004) relataram efeitos antibacterianos de outra PLA 2, oriunda do veneno de B. neuwiedi pauloensis, esta demonstrou ação sobre E. coli e S. aureus.

20 20 2 OBJETIVOS 2.1 GERAL Realizar o isolamento e a caracterização físico-química preliminar de uma fosfolipase A 2 básica do veneno de Bothrops moojeni do Paraguai. 2.2 ESPECÍFICOS Isolar uma fosfolipase básica do veneno de Bothrops moojeni proveniente do Paraguai; Determinar concentração de proteínas das frações obtidas a partir do primeiro passo cromatográfico; Determinar a massa molecular aparente da fosfolipase purificada mediante SDS-PAGE; Determinar a razão massa carga da proteína isolada por Espectrômetro de Massa (MALDI).

21 21 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 OBTENÇÃO DO VENENO Veneno oriundo de serpentes do biotério da Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción-Departamento de Medicina do Paraguai e armezenado a 4ºC no Centro Para el Desarrollo de la Investigación Científica (CEDIC), no mesmo país. Posteriormente foi transportado e mantido refrigerado (-20º C) no Banco de Venenos Amazônicos do Centro de Estudo de Biomoléculas Aplicadas a Saúde (CEBio- FIOCRUZ-RO). 3.2 CROMATOGRAFIA DE TROCA CATIÔNICA Aproximadamente 35 mg de veneno bruto foi solubilizado em 1 ml de tampão Bicarbonato de Amônia (NH 4 HCO 3 AMBIC, 0,05M, ph 8,0), sendo centrifugado a 2000xg durante 5 minutos para retirada do material insolúvel. O veneno foi submetido a uma cromatografia líquida em FPLC, usando coluna CM- Sepharose (1x 30cm), cuja matriz é composta de agarose e o grupo funcional de Carboximetil, previamente equilibrada com solvente A (Bicarbonato de Amônia 0,05 M, ph 8,0) e eluída sob gradiente de 0 a 100% com Solvente B (Bicarbonato de Amônia 0,5 M ph 8,0) em cinco volumes de coluna, sob o fluxo de 1mL/minuto em sistema de cromatografia Akta purifier (GE). A eluição das frações foi monitorada em 280 nm e coletadas individualmente, sendo posteriormente identificadas, liofilizadas e armazenadas a -20º C. 3.3 DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DE BRADFORD As 14 frações coletadas foram dosadas pelo método de Bradford. No procedimento foi utilizado um espectrofotômetro da marca Thermo, modelo BioMate. Foram utilizados cinco pontos com concentração proteica pré-estabelecida para calibração do equipamento, sendo de 0,4, 8, 12, 16, e 20 µg/ml. Os cinco pontos formaram uma base para construção de uma reta de primeira ordem com coeficiente de confiabilidade de 0,99%. As frações foram solubilizadas em PBS 1X (0,1M de tampão fosfato, a ph 7,4, 27 mm KCl, 1,37 M NaCl). A partir disso foram retirados 5

22 22 µl de amostra de cada fração ou PBS, para diluir em 995 µl de reagente Bradford e realizar a leitura. Esse procedimento também foi realizado com a proteína isolada. 3.4 ELETROFORESE SDS-PAGE Conforme descrito por Laemmli (1970), a eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% (m/v) foi realizada em condições redutoras, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) e em sistema descontínuo de ph. As frações obtidas após cromatografia foram solubilizadas em água deionizada e misturadas na razão 1:1 (v/v) com tampão de amostra (SDS 4%, Azul de Bromofenol 0,2%, Glicerol 20% e Tris 100 mm ph 6,8). A mistura foi aquecida em 75ºC por 15 minutos e aplicadas no gel. Ao término da separação o gel foi lavado com água deionizada para retirar o excesso de SDS. Em seguida o gel foi fixado em solução aquosa de etanol 40% (v/v) e ácido acético 7% (v/v) por 30 minutos. As bandas de proteínas foram evidenciadas através da imersão e leve agitação em solução contendo Coomassie Brillant Blue G ,08% (m/v), sulfato de alumínio 8% (m/v), ácido fosfórico 1,6% (m/v) e metanol 20% (v/v) pelo período de uma hora. O excesso de corante foi retirado em solução descorante contendo etanol 20% e ácido acético 3% (v/v) em água. Esta solução foi trocada várias vezes até a obtenção de coloração adequada. A imagem dos géis foi obtida com o equipamento Image scaner (GEHelthcare Lifesc.) e a massa molecular relativa (Mr) determinada com o uso do programa IQTL (GE Helthcare Lifesc.), comparando-se as distâncias relativas de migração das amostras e dos padrões de massa molecular. 3.5 CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA A fração 13, proveniente da cromatografia de troca catiônica, foi liofilizada e solubilizada com Solução A (TFA 0,1%) e a cromatografia de fase reversa em coluna C18 (25x 0,45 cm Discovery), previamente equilibrada com Solução A e eluída sob o gradiente de 0 a 100% de Solução B (99,9 % Acetonitrila e 0,1% TFA) sob o gradiente de 0 a 100%, em cinco volumes de coluna e fluxo de 1 ml/minuto. A eluição das frações foram monitoradas em 280 nm, sendo coletadas manualmente,

23 23 identificadas, liofilizadas e armazenadas em -20º C. A fração de interesse cromatográfico foi submetida a eletroforese para analisar seu grau de purificação. 3.6 ESPECTROMETRIA DE MASSA A Espectrometria de Massa foi realizada em equipamento MALDI (ionização e dessorção a laser assistida por matriz) com analisadores TOF (AXIMA TOF 2 Shimadzu Biotech), operando em modo linear, utilizando ácido sinapínico como matriz e 1µg da proteína, em uma proporção 3:1, respectivamente. Os calibrantes utilizandos foram: Insulina (5.734,5 Da), Citocromo C (12.361,9 Da), Apomioglobina (16.952,2 Da), Aldolase (39.212,2 Da) e Albumina (66.430,0 Da).

24 24 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A seleção do método cromatográfico empregado deve considerar as características físico-químicas e/ou biológicas e funcionais da proteína em questão. Para isso deve-se observar os resultados e as metodologias descritas (MACKESSY, 2010). Calgarotto e colaboradores (2008) purificaram uma PLA 2 básica Asp49 do veneno de B. moojeni, utilizando somente um passo cromatográfico em coluna de fase reversa M-Bondapak C18, que foi nomeada como BmTX-I. Enquanto Queiroz e colaboradores (2011) isolaram uma PLA 2 homóloga, a qual chamaram BmooMtx, com a combinação de uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-Sephacel e cromatografia de gel filtração em Sephadex G-75. A BthTX-II, uma PLA 2 Asp 49 do veneno de B. jararacussu foi purificada por dois métodos cromatográficos combinados, cromatografia de gel filtração e troca iônica (SANTOS et al., 2010). Um método bastante aplicado é o descrito por Soares e colaboradores (1998) e empregado por Soares e colaboradores (2000), utilizando coluna CM-Sepharose, onde isolaram uma PLA 2 Lys49 do veneno de B. moojeni, denominada MjTX-I. Considerando essa metodologia, o trabalho aqui apresentado utilizou como primeira etapa cromatográfica uma cromatografia de troca iônica (catiônica) em coluna CM- Sepharose para fracionar os componentes do veneno de Bothrops moojeni do Paraguai, que demonstrou 14 frações, designados F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10, F11, F12, F13 e F14 (Figura 4).

25 25 Figura 4: Cromatografia de Troca Catiônica do veneno bruto de Bothrops moojeni. Perfil cromatográfico do veneno de B. moojeni (35 mg) em coluna CM-Sepharose. A coluna foi equilibrada com tampão AMBIC 0,05 M, ph 8,0 e eluída com gradiente de concentração de 0-100% de tampão AMBIC 0,5 M, ph 8,0. Fluxo constante de 1 ml/minuto. A absorbância foi monitorada a 280 nm. As 14 frações cromatográficas foram coletadas, liofilizados e submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% em condições redutoras. A seta indica a fração com a proteína de interesse. A cromatografia de troca catiônica funciona por interações eletrostáticas entre os íons da fase móvel e da fase estacionária. A fase estacionária é revestida por cátions, resina de CM-Sheparose, com grupamento carboximetil, e a fase móvel representada pelo Tampão AMBIC ph 8,0 sendo possível separar moléculas com pequenas diferenças nas suas propriedades de carga (LOUGH e WAINER, 1995). Considerando o ponto isoelétrico da proteína de interesse e o gradiente crescente do AMBIC, as proteínas ligadas a resina tendem a se desprender da coluna, devido ao aumento da força iônica produzida pelo tampão B e as proteínas básicas, como a PLA 2 Lys49 acabam eluindo nas últimas frações. Dosou-se a concentração de proteínas em cada fração coletada na Cromatografia Catiônica pelo método de Bradford, que tem como princípio a interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contêm aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No ph de reação a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm (ZAIA e LICHTIG, 1998). Foi observada grande quantidade de proteínas nas frações

26 26 F2 e F6, sendo que a fração F13 apresentou 9,26 mg/ml de proteína e a F12 2,36 mg/ml (Tabela 1). Tabela 1 - Dosagem de Proteínas pelo método de Bradford das frações F1 a F14 da Cromatografia de Troca Catiônica. Fração Concentração (mg/ml) F1 0 F2 27,02 F3 4,62 F4 0 F5 7,8 F6 28,65 F7 0 F8 6,2 F9 0 F10 0,74 F11 0 F12 2,36 F13 9,26 F14 0 As frações colhidas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, onde se pode observar a massa molecular aparente das proteínas presentas nas diversas frações obtidas a partir do primeiro passo cromatográfico. Nas frações 2 e 3 é possível distinguir bandas pertencentes a proteínas com pi (ponto isoelétrico) ácido, de massa molecular próxima a 14 kda, provavelmente PLA 2 s ácidas e lectinas. Por outro lado, as frações 12 e 13 que são frações com características básicas, apresentaram bandas principais com massa molecar aproximada a 14 kda. A fração 13 foi escolhida por apresentar maior grau de purificação e concentração de proteínas que a fração 12 (Figura 5 e Tabela 1). A eletroforese é baseada no princípio de migração de moléculas carregadas em um meio sob a influência de um campo elétrico contínuo (GOMES-ARIZA et al., 2005). As propriedades mais importantes no ponto de vista eletroforético são a massa molar, a carga e a conformação. A eletroforese em uma dimensão pode

27 27 analisar a proteína na forma nativa ou dissociada, nesse primeiro não há alteração na conformação e as proteínas são separadas de acordo com sua carga (GAO et al., 2003). Já o sistema de dissociação, descrito por Laemmli (1970), utiliza SDS como agente desnaturante. Nestas condições o detergente interage com as proteínas, carregando-as negativamente e permitindo que elas migrem pelo gel de poliacrilamida em direção a um eletrodo positivo, dessa forma são separadas de acordo com suas massas molares. Figura 5: Eletroforese das frações da cromatografia de troca catiônica do veneno de Bothrops moojeni. Eletroforese a 12,5 % das 14 frações cromatográficas liofilizadas, oriundas da cromatografia de troca catiônica (Figura 4). MM: Padrão de Massa Molecular; linha 1, F1; linha 2, F2; linha 4, F4; linha 5, F5; linha 6, F6; linha 7, F7; linha 8. F8; linha 9, F9; linha 10, F10; linha 11, F11; linha 12, F12; linha 13, F13 e linha 14, F14. Na linha 13, destacada em vermelho, podemos observar uma banda com massa molecular de aproximadamente 14 kda. A fração 13 passou por uma segunda etapa, a Cromatografia de Fase Reversa em Coluna C18, caracterizada pela alta capacidade resolutiva. Neste tipo de cromatografia a fase móvel é mais polar do que a fase estacionária, sendo assim o mecanismo para separação acontece por meio da interação hidrofóbica entre os grupamentos da resina e as regiões hidrofóbicas superficiais das proteínas. As moléculas de natureza apolar são retidas por mais tempo e as polares são eluídas nas primeiras frações (LOUGH e WAINER, 1995). A acetonitrila, solvente mais comumente utilizado, possui propriedades físicoquímicas que permite uma grande precisão no isolamento. É possível obter alta

28 28 resolução de picos cromatográficos, separando moléculas por pequenas diferenças de hidrofobicidade (MACKESSY, 2010). Figura 6: Cromatografia de Fase Reversa da fração F13 oriunda de cromatografia de troca catiônica. Cromatografia de Fase Reversa da Fração 13, proveniente da cromatografia de troca catiônica (Figura 4). Cromatografia realizada em coluna Discovery (C18 25 x 0,45 cm), previamente equilibrada com TFA 0,1% (Solvente A) e eluída com Acetonitrila 99% + TFA 0,1% (Solvente B) em gradiente 0-100%, sob fluxo constante de 1mL/minuto. A eluição foi monitorada em 280 nm. O pico principal, indicado com uma seta, foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5 % em condições redutoras (Figura 7). A Cromatografia de Fase Reversa apresentou um pico central no gradiente de 40% de acetronitrila e 30 minutos de corrida (Figura 6). Esse pico foi submetido a eletroforese, que mostrou uma única banda, com massa molecular de aproximadamente 14kDa (Figura 7). A fração foi dosada pelo método de Bradford, obtendo-se 0,67 mg/ml de proteína. Para confirmar a purificação e a massa molecular dessa PLA 2, a mesma foi analisada por Espectrômetria de Massa. O espectro de massas apresentou picos com a razão massa carga de ,68 na forma monoprotonada [M+H] + e de 6.827,81 para a forma duplamente protonada [M+2H] 2+, obtendo assim o valor de massa molecular de ,67 Da (Figura 8). Além disso, pode-se observar uma isoforma de massa molecular ,73 Da, que confirma a presença de isoformas das PLA 2 s.

29 29 Figura 7: Gel de poliacrilamida SDS-PAGE da PLA 2 oriunda de cromatografia de fase reversa. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% da fração principal obtida na cromatografia de fase reversa (Figura 6). Na linha 1 pode-se observar uma proteína com alto grau de pureza com massa molecular aparente de 14 kda, compatível com PLA 2 e na linha 2 vemos o padrão de massa molecular (MM). A amostra foi submetida a espectrometria de massa em MALDI TOF para determinação de massa molecular exata e confirmação de purificação (Figura 8). Figura 8: Espectrometria de Massa da PLA 2 parcialmente purificada. Espectro de massa MALDI TOF da proteína de interesse, demonstrando o valor de m/z de ,68 na forma mono protonada e de 6.827,81 na forma duplamente protonada, obtendo-se assim o valor de massa molecular de , 67 Da. Observa-se também uma isoforma de ,73 Da. Foi utilizada como matriz ionizante uma solução saturada de ácido sinapinico em acetonitrila que foi homogeneizada com a amostra em uma proporção de 3:1 (matriz/proteína), sendo colocada para cristalizar em placa de MALDI em temperatura ambiente para posterior introdução na câmara a vácuo e análise em modo linear. Moura e colaboradores (2014) isolaram três fosfolipases A 2 básicas com a combinação de cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose e

30 30 cromatografia de fase reversa do veneno de B. mattogrossensis. Considerando que as três fosfolipases identificadas são provenientes da mesma fração da cromatografia de troca catiônica, comprova-se a presença de numerosas isoformas de fosfolipases do veneno de serpentes. Observando os resultados de Soares e colaboradores (1998 e 2000), podemos classificar essa proteína como uma PLA 2 Lys49, pois foi utilizada a mesma metodologia, com o veneno da mesma espécie de serpente e os resultados foram semelhantes. O isolamento de uma proteína é o processo inicial para um trabalho experimental com biomoléculas. A partir dessa etapa é possível realizar ensaios biológicos in vitro e in vivo e analisar o possível potencial biotecnológico da mesma. Além disso, as proteínas isoladas são importantes para serem usadas como substratos de ensaios em busca de inibidores das mesmas, com o fim de melhores terapias em acidentes ofídicos.

31 31 5 CONCLUSÃO Utilizando-se duas etapas de purificação, cromatografia de troca catiônica e cromatografia de fase reversa, foi possível isolar parcialmente uma fosfolipase A 2 básica Lys49 do veneno da serpente Bothrops moojeni oriunda do Paraguai. A proteína apresentou massa molecular de ,67 Da e concentração de 0,67 mg/ml quando dosada. Observou-se no espectrofotômetro de massa outro pico de massa molecular de ,73, que indicam a presença de duas PLA 2 s básicas na mesma peçonha, sugerindo heterozigose na expressão dessas isoenzimas. O trabalho apresentado, isolamento e caracterização protéica, é o passo inicial para posterior utilização dessas biomoléculas na biotecnologia, sendo necessário seguir com experimentos in vitro e in vivo para melhor definir suas propriedades farmacológicas.

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