ANÁLISE PROTEÔMICA DAS SEMENTES EM DESENVOLVIMENTO DE MAMONA (Ricinus communis)

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1 ANÁLISE PROTEÔMICA DAS SEMENTES EM DESENVOLVIMENTO DE MAMONA (Ricinus communis) Campos, F. A. P. 1, Jucá, T. L. 1, Nogueira, F. C. S 2, Moura, R. R. 3, Cardoso, C. K. 3, Costa, G. C. L. 3, Stancato, D. 3, Silva, M. J. 3, Domont, G. B. 2 1 UFC, bioplant@ufc.br, 2 UFRJ, 3 CBMEG, UNICAMP RESUMO - A mamoneira (Ricinus communis) é cultivada visando à extração do óleo contido em suas sementes. A torta obtida depois que o óleo é extraído não é usada como alimentação animal pelo fato de possuir proteínas tóxicas e alérgenos. A obtenção de genótipos bem adaptados à produção de biodiesel e desprovidos de proteínas tóxicas e alergênicas é dificultada pela falta de compreensão em relação as vias metabólicas e às enzimas chaves na produção de ácidos graxos e a deposição espaçotemporal de proteínas durante o desenvolvimento das sementes de mamona. Neste trabalho são apresentados nossos resultados relacionados à análise proteômica do desenvolvimento das sementes de mamona. As eletroforeses bidimensionais foram obtidas utilizando uma faixa de ph de 4-7 e 6-11 e uma faixa de massa molecular de 6 a 97 kda. Cada mapa de referência possuía aproximadamente 200 spots. Os spots mais abundantes foram excisados, digeridos com tripsina e analisados por um espectrômetro de massa MALDI-TOF-TOF. 115 proteínas foram identificadas, a maioria das quais foram classificadas como proteínas de reserva de três diferentes classes e várias isoformas da ricina, aglutinina e albumina 2S. Nossos resultados evidenciam que os métodos usados de extração de proteínas 2DE são compatíveis com as técnicas de identificação de proteínas por espectrometria de massa. Novos métodos de fracionamento das proteínas de sementes de mamona estão sendo desenvolvidos pelo nosso grupo, a fim de detectar por eletroforese bidimensional as proteínas menos abundantes. Palavras-chave: Ricinus communis, sementes em desenvolvimento, proteômica. INTRODUÇÃO A mamoneira (Ricinus communis), é cultivada visando unicamente à extração do óleo contido em suas sementes. A torta obtida após a extração do óleo não é usada como alimentação animal pelo fato de possuir proteínas tóxicas e alérgenos. A obtenção de genótipos bem adaptados à produção de biodiesel e desprovidos de proteínas tóxicas e alergênicas é dificultada pela falta de compreensão em relação às vias de síntese de ácidos graxos durante o desenvolvimento das sementes e degradação destes durante a germinação, informações necessárias à clonagem dos genes envolvidos nesses processos. Estas informações teriam uma importância fundamental para a criação de projetos biotecnológicos voltados ao aumento na quantidade e qualidade de ácidos graxos depositados nas sementes e à produção de ácidos graxos desenhados para fins industriais específicos. O resíduo resultante da extração de óleos de sementes de mamona contém a ricina, uma toxina, e a hiperalergênica albumina 2S, que dificultam o cultivo e o

2 aproveitamento dessa espécie. Sendo assim, o conhecimento sobre as proteínas com potencial tóxico/antinutricional presente nas sementes de mamona, particularmente no endosperma, iria permitir o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas que teriam como alvo a eliminação (ou inativação) no genoma dessas espécies dos genes que codificam para estas proteínas, tornando assim possível o aproveitamento do resíduo de extração na alimentação animal. Técnicas proteômicas aplicadas à identificação em larga-escala de proteínas depositadas durante o desenvolvimento de sementes de oleaginosas, onde, geralmente, ficam armazenados os óleos de reserva, possibilitam estabelecer a cinética de expressão de enzimas-chave de rotas específicas na síntese de ácidos graxos. Possibilitam também a compreensão sobre a deposição de proteínas de reserva, entre outras, durante o desenvolvimento das sementes. Neste trabalho são apresentados nossos resultados relacionados à análise proteômica do desenvolvimento das sementes de mamona, utilizando a técnica de eletroforese bidimensional para fracionar o conteúdo de proteínas e a espectrometria de massa para identificar as proteínas selecionadas. MATERIAL E MÉTODOS Por meio de dados de morfologia descritiva foi possível obter sementes de mamona nos diferentes estádios de desenvolvimento, com 5, 10, 20, 40, 60 dias após a antese e sementes maduras, estádios 1, 2, 3, 4, 5 e 6 respectivamente (GREENWOOD; BEWLEY, 1982). Algumas sementes foram germinadas em água à 28 ºC por 1, 3, 6 e 8 dias. Os endospermas das sementes em diferentes estádios de desenvolvimento e de sementes nos diferentes dias após a germinação foram utilizados para a extração de proteínas. O método de extração de proteínas totais e eletroforese bidimensional utilizado neste trabalho foi feito como descrito por Vasconcelos et al. (2005). Para as análises por espectrometria de massas, as proteínas foram excisadas dos géis bidimensionais, descoradas e digeridas com tripsina. Os espectros das massas dos peptídeos gerados e os espectros de fragmentação de pelo menos sete peptídeos precursores de cada amostra foram obtidos utilizando um MALDI-TOF-TOF ABI 4700 (Applied Biosystems). A ferramenta de busca utilizada para analisar os resultados obtidos contra diferentes bancos de dados foi o MASCOT Daemon program (Matrix Science, London, UK). RESULTADOS E DISCUSSÃO Para as sementes em desenvolvimento de mamona, estágios 1 (5 DAA), 2 (10 DAA), 3 (20 DAA), 4 (40 DAA), 5 (60 DAA) e 6 (sementes maduras), foram obtidos mapas proteômicos utilizando uma faixa de ph de 4-7 (e 6-11 para sementes maduras) e uma faixa de massa molecular de 6 a 97 kda (Figura 1). Cada mapa de referência possuía aproximadamente 200 spots. Os spots mais

3 abundantes das eletroforeses bidimensionais dos estágios 4 e 6 foram excisados, digeridos com tripsina e analisados por um espectrômetro de massa MALDI-TOF-TOF (Figura 2). 115 proteínas foram identificadas, a maioria das quais foram classificadas como proteínas de reserva de três diferentes classes e várias isoformas da ricina, aglutinina e albumina 2S. Eletroforeses bidimensionais do endosperma de sementes com 1, 3, 6 e 8 dias após a germinação também foram obtidas. Foi possível observar nesses mapas proteômicos a mobilização das proteínas de reserva de sementes durante o processo de germinação (Figura 3). Nossos resultados evidenciam que a abundância e diversidade das proteínas de reserva contidas nas sementes de mamona, impossibilitou a identificação de proteínas menos abundantes, como as enzimas responsáveis pelo metabolismo dos lipídeos durante o desenvolvimento e germinação das sementes de mamona. Os métodos usados de extração de proteínas e eletroforese bidimensional são compatíveis com as técnicas de identificação de proteínas por espectrometria de massa, embora novos métodos de fracionamento das proteínas de sementes de mamona precisem ser desenvolvidos, a fim de detectar por eletroforese bidimensional proteínas menos abundantes. CONCLUSÃO Neste trabalho o método de extração de proteínas possibilitou a obtenção de mapas proteômicos reprodutíveis tanto para sementes em desenvolvimento quanto para sementes em germinação. Toda a metodologia empregada às proteínas de semente de mamona foi compatível com a análise por espectrometria de massas. A maioria das proteínas identificadas foram proteínas de reserva, pois as mesmas encontram-se bastante abundantes em sementes em desenvolvimento de mamona. Novos métodos de fracionamento das proteínas de sementes de mamona estão em processo de desenvolvimento pelo nosso grupo, pois há o interesse em identificar as enzimas responsáveis pela síntese e degradação dos lipídeos de reserva. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GREENWOOD, J. S.; BEWLEY, J. D. Seed development in Ricinus communis (castor bean). I. Descriptive morphology. Can. J. Bot., v. 60, p , VASCONCELOS, É. A. R.; NOGUEIRA, F. C. S.; ABREU, E. F. M.; GONÇALVES, E. F.; SOUZA, P. A. S.; CAMPOS, F. A. P. Protein Extraction from Cowpea Tissues for 2-D Gel Electrophoresis and Ms Analysis. Chromatographia, v. 62, p , 2005.

4 Figura 1. Padrão de deposição de proteínas durante o desenvolvimento das sementes de mamona. A partir do estágio 3 um grupo particular de proteínas de reserva começa a ser depositado (setas coloridas). As proteínas foram separadas numa faixa de ph de 4-7. Foram aplicados em cada gel 250 µg de proteínas.

5 Figura 2. Eletroforese bidimensional das proteínas extraídas das sementes em desenvolvimento nos estágios 4 (A) e 6 (A e C). Alguns spots foram selecionados, excisados dos géis, digeridos com tripsina e os peptídeos trípticos foram analisados por espectrometria de massa. As proteínas identificadas como proteínas de reserva das classes legumin, seed reserve protein and 2S albumin estão marcadas com setas amarelas, vermelhas e azuis, respectivamente. Outras classes de proteínas estão identificadas com setas pretas. A lista completa das proteínas identificadas está na tabela 1.

6 Figura 3. Padrão de mobilização de proteínas durante a germinação de sementes de mamona colocadas para germinar em água à 28 ºC por 1, 3, 6 e 8 dias. As setas coloridas indicam a mobilização das proteínas de reserve identificadas por espectrometria de massas. As proteínas foram separadas numa faixa de ph de 4-7. Foram aplicados em cada gel 250 µg de proteínas.