CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, ENZIMÁTICA E CITOTÓXICA DE UMA FOSFOLIPASE A2 ÁCIDA ISOLADA DA PEÇONHA DE BOTHROPS PAULOSENSIS.

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1 CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 2008 UFU 30 anos CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, ENZIMÁTICA E CITOTÓXICA DE UMA FOSFOLIPASE A2 ÁCIDA ISOLADA DA PEÇONHA DE BOTHROPS PAULOSENSIS. Francis Barbosa Ferreira 1 Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia, Av. Pará, 1720, Uberlândia-MG, CEP: francisbbio@yahoo.com.br Renata Santos Rodrigues 3 Thomas Cardoso 2 Veridiana de Melo Rodrigues Ávila 3 veridiana@ingeb.ufu.br Resumo: As fosfolipases A 2 catalisam a hidrólise de fosfolipídeos, liberando como produtos ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. As fosfolipases das peçonhas de serpentes são amplamente estudadas devido à variedade de seus efeitos farmacológicos como neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativação ou inibição da agregação plaquetária, anticoagulação, edema, convulsão, hipotensão, hemorragia interna, dentre outras. Porém, nem todas as PLA 2 induzem todos esses efeitos. Este trabalho teve como objetivo a purificação e caracterização química e enzimática de uma fosfolipase A 2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis, bem como a avaliação de sua ação bactericida sobre E. coli e citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia). A fosfolipase A 2 isolada foi denominada de CM1b-F5. Esta enzima foi purificada por cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose Fast Flow seguido por filtração em Sephadex G-75 e finalizando em Phenyl Sepharose CL-4B. CM1b-F5 apresentou uma massa molecular de 15.8kDa, atividade fosfolipásica de 289 U/MG. Não apresentou ação bactericida e baixa atividade citotóxica, no entanto outras linhagens celulares deverão ser utilizadas para uma análise mais criteriosa dessa ação. Novos estudos deverão ser realizados com a PLA 2 ácida isolada da peçonha de Bothrops pauloensis com intuito de obter parâmetros estruturais e funcionais que poderão contribuir para a utilização da mesma como modelo estrutural para a síntese de novos agentes terapêuticos. Palavras-chave: fosfolipase A 2 ; Bothrops pauloensis; citotoxicidade 1. INTRODUÇÃO No Brasil, a morbidade notificada por serpentes do gênero Bothrops é de aproximadamente 15 a cada pessoas (Chipaux, 1998). Devido à ação de várias enzimas, especialmente fosfolipases A 2 (PLA 2 ) e metaloproteases. As peçonhas botrópicas 1 Acadêmico do curso Ciências Biológicas; 2 - Acadêmico do curso Medicina Veterinária; 3 Orientador(es). 1

2 produzem fortes danos em tecidos biológicos, bem como a interferência em quase todas as fases da hemostase humana (Higuchi et all, 2007). As enzimas PLA 2 de peçonhas de serpentes vêm sendo amplamente estudadas devido à variedade de seus efeitos farmacológicos, como neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativação e/ou inibição da agregação plaquetária, anticoagulação, edema, convulsão, hipotensão, hemorragia interna, dentre outras, porém, nem todas as PLA 2 induzem todos esses efeitos (Francischetti et all, 1998; Kini, 2003 e Masuda et all, 2005). As PLA 2 catalisam a hidrólise especificamente na ligação 2-acil éster de fosfolipídios, liberando como produtos os lisofosfolipídios e ácidos graxos livres (Six e Dennis, 2000). Estas enzimas podem possuir um resíduo de aspartato na posição 49 (D49), ou um resíduo de lisina na mesma posição (K49). As D49 são enzimaticamente ativas e as k49 possuem baixa ou nenhuma atividade enzimática (Ownby et all, 1999 e Ketelhut et all, 2003). Existem variantes da subclasse Lys49, como Arg 49 e Ser 49 presentes em algumas PLA 2 s de peçonhas ofídicas já isoladas. Chijiwa et all (2006) isolaram duas PLA 2 s da peçonha de Protobothrops elegans que possuem um resíduo de Arg na posição 49 (Arg49), denominadas PeBP(R)-I e PeBP(R)-II, mas com alto grau de homologia com as K49 já isoladas. As fosfolipases A 2 podemser encontradas em diferentes organismos e tipos teciduais e exercerem diferentes funções. São divididas em cinco grupos principais: PLA 2 secretórias (spla 2 ), citosólicas (cpla 2 ), Ca 2+ independentes, acetilhidrolases fator de agregação plaquetária (PAF-AH) e as lisossômicas, divididas de acordo com o mecanismo catalítico e suas características funcionais e estruturais. As PLA 2 secretórias foram subdivididas em quatorze grupos, de acordo com o número de resíduos de aminoácidos e posição das ligações dissulfeto, sendo que as PLA 2 das peçonhas de serpentes estão incluídas nos grupos I e II (Schaloske e Dennis, 2006). Essas enzimas são pequenas, com o peso molecular variando de 13 a 18 kda, e causam destruição pela interferência nos processos fisiológicos normais da vítima (Kini, 2003). As PLA 2 e suas isoformas oferecem um grande desafio para os pesquisadores, no sentido de desvendar a sua estrutura e função. Pesquisas nesta área auxiliarão a determinar os mecanismos dos efeitos farmacológicos, bem como ampliar nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação destas toxinas, seus efeitos deletérios, ou para efeitos contrários a algumas doenças importantes. Estes estudos são de extrema importância, pois podem subsidiar conhecimentos em áreas correlatas como o desenvolvimento de drogas para tratamento de vítimas de acidentes ofídicos, desordens hemostáticas, bem como para o desenvolvimento de novas drogas com ação bactericida e antitumorais. Além disso, estes estudos resultarão em inovadoras oportunidades e caminhos para encontrar respostas para a toxicidade das PLA 2 e também para o desenvolvimento de proteínas com novas funções biológicas (Kini, 2003). Portanto, este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar química e enzimaticamente uma fosfolipase A 2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis, bem como avaliar a sua ação bactericida e citotóxica sobre a linhagem de células tumorais K-562 (leucemia). 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material A peçonha da serpente botrópica foi cedida pela Pentapharm do Brasil Comércio e Exportação Ltda. Após a coleta, a peçonha foi imediatamente dessecada à vácuo em temperatura ambiente e conservado a -20ºC. Foram utilizados os seguintes materiais: Acetato de sódio, Glicina, Acrylamida, Metanol, BCTA, Bicarbonato de Amônio, Bis-acrilamida, CaCl 2, Coomassie Brillant Blue R250, SDS, Deoxicolato de Sódio, TEMED, Tris, Glicerol e β-mercaptoetanol (SIGMA- Aldrich Brasil LTDA); Resinas cromatográficas de afinidade, interação hidrofóbica, troca iônica e 2

3 gel-filtração, espectrofotômetro e HPLC AKTA Prime Plus (GE Healthcare Life Science); Liofilizador (Edwards Lifesciences LLC); Coagulômetro Quick Timer (DRAKE); Plasma Bovino, obtido na fazenda experimental da Universidade Federal de Uberlândia. Os demais reagentes foram de grau analítico Purificação da fosfolipase A 2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis A purificação da fosfolipase A 2 ácida foi realizada de acordo com Rodrigues et al (2007), com modificações. Cerca de 180 mg da peçonha botrópica foram ressuspendidos em 2,0 ml de tampão bicarbonato de amônio 50 mm, ph 7.8. Em seguida a amostra foi centrifugada a xg por 10 min. a 4 C e o sobrenadante aplicado a uma coluna de troca iônica contendo a resina CM Sepharose Fast Flow (2,0 x 20,0 cm), previamente equilibrada com o mesmo tampão. A amostra foi eluída em temperatura ambiente pelo estabelecimento de um gradiente convexo de concentração usando o tampão bicarbonato de amônio nas concentrações de 0,05 a 0,5 M. Frações de 3 ml/tubo foram coletadas num fluxo de 20mL/hora. A fração com atividade fosfolipásica foi coletada e submetida em Sephadex G-75, equilibrada com um tampão AMBIC 0,05M ph 7.8. A fração ativa foi coletada e aplicada em Phenyl-Sepharose previamente equilibrada com o tampão Tris-HCl 10mM com 2M de NaCl, ph 8.5. A eluição procedeu à temperatura ambiente, seguido por tampão Tris-HCl 10mM, ph 8.5, com concentrações decrescentes de NaCl (1 e 0,5 M) até 10 mm de Tris-HCl ph 8.5, encerrando o processo de eluição com água Caracterização química Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com agente desnaturante: As eletroforeses com agente desnaturante (SDS) foram realizadas segundo a técnica descrita por Laemmli (1970). Esta técnica foi realizada para a identificação, estimativa da massa molecular e análise do grau de pureza da toxina de interesse Ensaios Enzimáticos Atividade Fosfolipásica (PLA 2 ) Essa atividade foi determinada por titulação potenciométrica segundo o método descrito por De Haas et all (1968). Como substrato foi utilizada uma emulsão de gema de ovo em presença de deoxicolato de sódio 0,03 M e CaCl 2 a 0,6 M. Os ácidos graxos liberados enzimaticamente foram titulados com uma solução padrão de NaOH 0,1208N em ph 8,0 e temperatura ambiente. A atividade fosfolipásica foi expressa em microequivalentes de base consumida por minuto e a atividade específica pelo número de µequivalentes de base consumida por minuto, por mg de proteína. Para cada ensaio foram utilizados 10 µg de proteínas Atividade bactericida Escherichia coli, cepa ATCC 25922, foi adquirida pelo Laboratório Genética Molecular da UFU, cedidas gentilmente pelo Dr. Luiz Ricardo Goulart, INGEB. As bactérias individuais, E.coli, foram inicialmente inoculadas em meio de cultura estéril BHI (Brain Heart Infusion-Broth infusão desidratada de coração e cérebro 1,75% (m/v), Triptose 0,1% (m/v), glicose 0,2% (m/v), NaCl 0,5% (m/v), Na 2 HPO 4 0,25% (m/v), ph 7,4 ± 0,2 a 25 O C da Diagnolab, Espanha) e ativadas por 16 horas a 37 O C em repouso. As culturas foram diluídas 100 vezes em BHI estéril. Retirou-se 2mL para o plaqueamento em microplaca de 96 poços, na presença ou na ausência da toxina em concentrações de 0,4 e 0,8 µg.ml -1 diluídas em BHI. Inicialmente e após 6 3

4 horas de incubação a 37 o C sem agitação, a densidade óptica foi monitorada em espectrofotômetro (Leitor de microplacas Camberra-Packard) utilizando-se o filtro de interferência de 600nm Ensaios de Citotoxicidade Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em colaboração com a Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Foram utilizadas células tumorais K-562 (leucemia), fornecidas pelo Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás UFG e células normais humanas Human foreskin fibroblasts HFF (fibroblasto), fornecidas pelo Laboratório de Imunologia da Universidade Federal de Uberlândia Meio de cultura celular para células tumorais Para a manutenção da linhagem de células tumorais, a dissolução da toxina testada e a realização dos ensaios de citotoxicidade, seguiram-se o protocolo do ATCC (American Type Culture Collection), utilizando meio RPMI 1640 suplementados com 10% de soro fetal bovino (SFB), 20 mm de L-glutamina, 7,5% de bicarbonato de sódio e 10µg/mL de gentamicina (meio completo). Este meio foi preparado na hora do uso e esterilizado por filtração em membranas de 0,22µm. Como controle negativo foi utilizado o meio RMPI 1640 com L-glutamina, suplementado com 10% de soro fetal bovino Atividade citotóxica Como controle positivo, foi utilizada a droga ciclofosfamida, diluída em meio incompleto em concentração de 5mg/mL. A ciclofosfamida é um fármaco antineoplásico com amplo espectro de ação antitumoral, utilizada também como alternativa na supressão da rejeição imunológica dos órgãos transplantados (Craig e Stitzel, 1996). Para avaliar a atividade citotóxica da toxina foi utilizado o método colorimétrico com 3- (4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazólio), o MTT. O princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Quando as células estão vivas as desidrogenases mitocondriais são capazes de agir sobre substratos como o MTT levando a quebra dessa molécula e a redução desta, formando assim o Azul de Formazan. Portanto, quanto maior a viabilidade celular em uma determinada amostra, mais Azul de Formazan é formado. O Azul de Formazan é solubilizado com Dodecilsulfato de Sódio (SDS) ou Isopropanol em meio ácido. A leitura da quantidade de Azul de Formazan foi medida através de espectofotometria, utilizando-se filtro de interferência de 550 nm. Para avaliar a ação da toxina, foram plaqueadas 2x10 5 células em microplacas de 96 poços. Após o plaqueamento, as células foram tratadas com 100 µl de toxinas nas concentrações descritas acima e incubadas por 24h em estufa a 37 C contendo 95% de ar e 5% CO 2. Ao fim da incubação, foram adicionados aos poços de cultivo celular, 10 µl de MTT na concentração de 5mg.mL -1. A placa foi novamente incubada e após 3 horas foram adicionados 50 µl SDS 10% HCL 0,01 N. A atividade citotóxica foi avaliada como a capacidade de inibir a proliferação das células. 3. RESULTADOS 3.1. Isolamento da PLA 2 e Caracterização Química O fracionamento da peçonha de Bothrops pauloensis por cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose produziu seis picos principais (Figura. 1a). Para cada pico foi testada a atividade fosfolipásica por titulação potenciométrica e verificado o perfil protéico em PAGE-SDS. A 4

5 eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% com SDS foi realizada para verificar o grau de pureza das proteínas presentes em cada fração. A fração CM1 é constituída pela maioria dos componentes presentes no veneno total, já a fração CM4 e CM5 apresentam um bom grau de pureza, mas necessitam de novas etapas de purificação. A fração CM1 apresentou alta atividade fosfolipásica (Tabela 1) e foi recromatografada em uma coluna contendo a resina Sephadex G-75, resultando em 3 frações principais, denominadas CM1a, CM1b e CM1c (Figura 1b). A fração CM1b apresentou atividade PLA 2 (Tabela 1) e foi aplicada em Phenyl-Sepharose CL-4B, resultando em 6 novas subfrações, denominadas CM1b-F1 a F5 (Figura 1c). A homogeneidade da fração CM1b-F5 foi mostrada por PAGE-SDS (Figura 5). A proteína purificada consiste em um polipepitídeo de cadeia única, com massa molecular de aproximadamente Da. A B C D Figura 1: Processos de purificação da PLA 2 da peçonha de B. pauloensis. A) Cromatografia em CM-Sepharose de 180 mg da peçonha bruta de Bothrops pauloensis. Coluna de 20 x 2 cm, equilibrada com tampão bicarbonato de amônio 0,05M ph 7,8, com fluxo de 20ml/h, coletadas frações de 3ml/tubo e gradiente convexo de bicarbonato de amônio 0,5M ph 7,8; B) Cromatografia em Sephadex G-75 de 40mg da fração CM1. A resina foi equilibrada com o tampão AMBIC 0,05M, ph 7.8 e eluída com o mesmo tampão à temperatura ambiente. Este fracionamento resultou em 3 subfrações: CM1a, CM1b e CM1c; C) Cromatografia de 16,4 mg da fração CM1b em Phenyl- Sepharose Fast Flow (coluna de 20 x 1.2 cm), equilibrada com tampão Tris-HCl 10mM ph NaCl 2M com fluxo de 20ml/h. Foram coletadas frações de 2,0ml/tubo. A eluição foi realizada com Tris-HCl 10mM com concentrações molares decrescentes de NaCl (1M e 0,5M), finalizando a eluição com água; D) Eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em condições desnaturantes. Tampão Tris-Glicina ph 8.3 tempo de corrida 80 minutos a 20mA constante e voltagem variando de 100 a 200V. Após a corrida o gel foi corado com Coomassie Blue R-250 a 2,5% por 10 minutos e em seguida descorado com ácido acético 10%, etanol 30% e água desionizada. 5

6 Foi avaliada a recuperação protéica nos diferentes passos cromatográficos em relação à quantidade total de proteína aplicada em cada fracionamento, bem como a atividade fosfolipásica das mesmas (Tabela 1). No primeiro fracionamento, em CM-Sepharose, obteve-se um rendimento protéico de aproximadamente 22% para a fração CM1 e uma recuperação da atividade fosfolipásica de 45,15%, para a mesma fração. No segundo passo cromatográfico, Sephadex G-75, a fração com atividade fosfolipásica, CM1b, teve um rendimento protéico e recuperação da atividade fosfolipásica de 41% e 25,62%, respectivamente. No terceiro fracionamento, em Phenyl-Sepharose, o rendimento protéico foi de 1,82% e a recuperação da atividade fosfolipásica foi de 40,29% para a fração CM1b-F5 (PLA 2 ácida). Tabela 1: Rendimento protéico do fracionamento da peçonha bruta de Bothrops pauloensis e atividade fosfolipásica Caracterização Enzimática Comparação da atividade fosfolipásica durante as etapas de purificação A atividade fosfolipásica foi determinada em triplicata por titulação potenciométrica. Podemos observar que houve uma queda de atividade da fração CM1 para a CM1b, porém, em comparação com a fração CM1b-F5, esta atividade aumentou satisfatoriamente (Figura 2). A atividade da fração CM1b-F5 é quase 5 vezes maior do que a atividade da peçonha bruta. Figura 2: Comparação da atividade fosfolipásica da peçonha bruta e das frações resultantes dos passos cromatográficos. 6

7 3.3. Atividade Citototóxica A figura 3a apresenta a atividade citotóxica da PLA 2 ácida sobre células tumorais K-562 (leucemia). Como pode ser observado a PLA 2 apresentou baixa citotoxicidade quando comparado com o controle positivo ciclofosfamida. Surpreendentemente, nas concentrações extremas testadas (0,001mg/mL e 100mg/mL) essa inibição foi mais satisfatória, cerca de 20% de inibição da proliferação. Quando testada sobre células normais HLL (fibroblastos) a PLA 2 foi capaz de induzir a proliferação celular de uma forma dose dependente (Figura 3b). A Inibição de Proliferação (%) C+ PLA2 (mg.ml -1 ) B Inibição de Proliferação (%) C C+ PLA2 (mg;ml -1 ) Figura 3: Atividade antitumoral: A) Inibição da proliferação de células K562 induzida por diferentes concentrações da PLA 2 ácida de B. pauloensis. B) : Inibição da proliferação de fibroblastos (Human foreskin fibroblasts HFF) induzida por diferentes concentrações da PLA 2 ácida de B. pauloensis. 4. DISCUSSÃO As PLA 2 s representam uma classe de enzimas versáteis, considerando sua função, localização, regulação, mecanismo de ação, seqüência, estrutura e papel dos íons metálicos bivalentes. Durante os últimos 20 anos houve um grande interesse em se estudar estas toxinas, resultando no isolamento e caracterização estrutural e funcional de várias PLA 2. A grande maioria das PLA 2 s isoladas de peçonhas de serpentes botrópicas, descritas até agora, são proteínas de caráter básico, ponto isoelétrico variando entre 7.0 e 10.0, que possuem atividade catalítica ou não, sobre substratos artificiais. As análises da composição em aminoácidos indicaram que essas toxinas são ricas em aminoácidos básicos e hidrofóbicos (Homsi-Brandeburgo et all, 1988; Selistre et all, 1990; Lomonte et all, 1990 ; Mancuso et all, 1995 e Angulo et all, 1997). Apresentam também um alto número de resíduos de meia-cistina, o que sugere a presença de várias pontes dissulfeto intracadeia. As PLA 2 s tóxicas são muito estáveis, provavelmente como resultado da extensa ligação cruzada, tornando-as ativas em uma ampla faixa de ph e temperatura. Entretanto, várias PLA 2 s ácidas também já foram isoladas das peçonhas botrópicas, como por exemplo: SIIISPIIA, SIIISPIIB, SIIISPIIIA e SIIISPIIIB por Ketelhut et al. (2003); P1, P2 e P3 por Daniele et all (1995). Da peçonha de B. pauloensis já foram isoladas várias PLA 2 s. Duas fosfolipases A 2 Asp-49 (Rodrigues et all, 2004), duas miotoxinas Lys-49, BnSP-6 e BnSP-7 (Rodrigues et all, 1998) e uma fosfolipase A 2 ácida (Rodrigues et all, 2007). No presente trabalho isolamos a PLA2 ácida de Bothrops pauloensis segundo Rodrigues et all (2007) com algumas modificações. Introduzimos uma etapa intermediária, onde substituímos a utrafiltração em AMICON YM (30.000) por uma filtração em coluna de Sephadex G-75. Com essa nova metodologia pretendíamos obter a toxina com um maior rendimento e grau de pureza. Com a 7

8 utilização deste método, que combina cromatografias de troca iônica, gel-filtração e interação hidrofóbica, conseguimos um alto grau de pureza da PLA 2 (CM1b-F5) de interesse (figura 7). No entanto, comparando nossos resultados com Rodrigues et all (2007) concluímos que o rendimento protéico não foi tão satisfatório, mas a recuperação da atividade PLA 2 foi maior (Tabela 1). O primeiro fracionamento, em CM-Sepharose, indica que a PLA 2 é uma proteína ácida, pois estava presente na primeira fração denominada CM1. Esta fração continha as enzimas com carga negativa, ou seja, que não interagiam com a resina. Rodrigues et all (2007) determinou o pi da PLA 2 ácida de B. pauloensis em torno de 4,34. A massa molecular da PLA 2 estimada por SDS- PAGE é aproximadamente Da, valor também encontrado por Rodrigues et all (2007). Este valor está dentro da faixa de massa molecular ( a ) encontrada para as fosfolipases A 2 já purificadas e caracterizadas (Kini, 2003). A atividade específica aumentou significativamente da peçonha bruta para a fração CM1b- F5, 63 U/mg e 289 U/mg, respectivamente. Porém, pode-se observar que a atividade caiu, quando comparadas as atividade das frações CM1 e CM1b. De acordo com Villalobos et all (2007), algumas fosfolipases A 2 são capazes de induzir a citotoxicidade, bem como o rompimento de membranas bacterianas. Neste trabalho foi avaliada a atividade bactericida sobre Escherichia coli e citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia) e fibroblastos (Human foreskin fibroblasts - HFF). Esta enzima não foi capaz de induzir atividade bactericida (resultados não apresentados) e induziu uma baixa atividade antitumoral (Figura 8). A ação antitumoral de venenos de serpentes tem sido alvo de várias pesquisas atualmente. Muitos desses efeitos são induzidos por PLA 2 s básicas cuja ação citotóxica independe da atividade catalítica dessas enzimas (Stabeli et all, 2006). A ação antitumoral de PLA 2 s ácidas isoladas de venenos de serpentes ainda não foi demonstrado, embora no presente estudo verificamos uma discreta ação citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia). Novos estudos com outras linhagens celulares deverão ser realizados para se verificar o potencial antitumoral dessa toxina. Estudos na área de purificação e caracterização funcional de toxinas animais abrem perspectivas para a utilização das mesmas como modelos moleculares para a síntese de novos agentes terapêuticos que poderão ser utilizados na terapia do câncer. 5. AGRADECIMENTOS Este trabalho foi financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Nós agradecemos ao Prof. Dr. Luís Ricardo Goulart (INGEB-UFU) e a Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda (UFG) pela colaboração nos ensaios de atividade citotóxica. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Angulo, Y., Chaves, E.; Alape, A.; Rucavado, A.; Gutierrez, J. M. and Lomonte, B., 1997, Isolation and characterization of a myotoxic phospholipase A 2 from the venom of the arboreal snake Bothriechis (Bothrops) schlegelii from Costa Rica, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 339, pp Chijiwa, T.; Tokunaga, E.; Ikeda, R.; Terada, K.; Ogawa, T.; Oda-Ueda, N.; Hattori, S.; Nozaki, M. and Ohno, M., 1998, Discovery of novel [Arg 49 ] phospholipase A 2 isozymes from Protobothrops elegans venom and regional evolution of Crotalinae snake venom phospholipase A 2 isozymes in the southwestern islands of Japan and Taiwan, Toxicon, Vol. 48, pp Chippaux, J. P., 1998, Snake-bites: appraisal of the global situation, Bulletin of the World Health Organization, Vol. 75, pp Craig, C. R. and Stitzel, R. E., 1996, Farmacologia moderna, 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, pp

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