PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA E BIOLÓGICA PARCIAIS DA HIALURONIDASE PRESENTE NA PEÇONHA DE CROTALUS

Transcrição

1 CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 2008 UFU 30 anos PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA E BIOLÓGICA PARCIAIS DA HIALURONIDASE PRESENTE NA PEÇONHA DE CROTALUS DURISSUS COLLILINEATUS Letícia Eulálio Castanheira 1, Maria Inês Homsi Brandeburgo 2, Veridiana de Melo Rodrigues Ávila 2, Amélia Hamaguchi 3 Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica. Av. Pará, 1720, B.: Umuarama. Uberlândia, Minas Gerais. C.E.P.: leticia_casth@yahoo.com.br Resumo: Acidentes ofídicos constituem um grave problema de saúde pública nos países tropicais, sendo as cascavéis, representadas pelo gênero Crotalus no Brasil, responsáveis pelos maiores índices de letalidade. O envenenamento crotálico caracteriza-se predominantemente por efeitos sistêmicos, como insuficiências agudas renal e respiratória, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, miotoxicidade e hemorragias. A hialuronidase é uma enzima não tóxica conhecida como fator de espalhamento, por facilitar a difusão de toxinas durante o envenenamento, pois degrada a matriz extracelular das vítimas. Este trabalho relata a purificação e a caracterização parciais da hialuronidase da peçonha de Crotalus durissus collilineatus. Observou-se que a enzima possui massa molecular aproximada de 70 kda. Dentre os passos cromatográficos realizados, o fracionamento da peçonha bruta em CM-Sepharose C-25 foi o mais efetivo, verificando-se poucos contaminantes na fração com atividade hialuronidásica positiva, apesar do rendimento de 0,21%. Miotoxicidade e letalidade não foram detectadas em nenhuma das frações obtidas, ao contrário da peçonha bruta, confirmando a ação da hialuronidase como fator de espalhamento das toxinas no envenenamento pela peçonha estudada. Palavras-chave: Crotalus durissus collilineatus, hialuronidase, fator de espalhamento. 1. INTRODUÇÃO O ofidismo representa um problema de saúde nacional desde o Brasil colônia, sendo considerado como umas das grandes pragas daquela época, em virtude do significativo número de óbitos. Segundo dados do Ministério da Saúde (2001), ocorrem anualmente no Brasil de a acidentes por picadas de serpentes, com índice de letalidade de 0,4%. Apesar de a região Sudeste apresentar o maior número de casos ( acredita-se que haja subnotificações nas regiões Norte e Nordeste, devido às dificuldades de acesso ao serviço de saúde. As serpentes do gênero Bothrops, conhecidas popularmente como jararacas, jararacuçu ou urutu são responsáveis por 90,5% dos acidentes no Brasil, seguidas das serpentes do gênero Crotalus (cascavéis), com 7,7% dos casos e das serpentes do gênero Lachesis (surucucus), com 1,4%, e Micrurus ( corais verdadeiras ), com 0,4% dos acidentes relatados (Fundação Nacional da Saúde, 1998). Contudo, o maior número de casos fatais está relacionado com as cascavéis, seguidos das serpentes dos gêneros Lachesis, Micrurus e Bothrops, respectivamente (Cardoso, 2003). ¹- Graduanda do curso de Ciências Biológicas; ² - Co-orientadoras; ³ - Orientadora 1

2 Os principais efeitos fisiológicos decorrentes dos acidentes crotálicos, assim como a alta toxicidade da peçonha, devem-se à presença de diversas toxinas, a saber: crotoxina, crotamina, giroxina, convulxina, serinoproteases e fosfolipases A2 (Oshima-Franco et al., 1999), em que as duas primeiras são as mais extensivamente estudadas. A crotoxina consiste de duas subunidades polipeptídicas que formam um complexo responsável pela paralisia respiratória, seguida de morte da vítima (Hawgood, 1990). Por sua vez, a crotamina é um polipeptídeo básico ativador de canais de sódio no músculo esquelético, resultando em miotonia (Vital Brasil, 1990), ou seja, incapacidade de relaxamento muscular após a contração. Em contrapartida, dentre as enzimas não-tóxicas, destaca-se a hialuronidase, enzima que naturalmente degrada o ácido hialurônico, o maior componente da matriz extracelular dos vertebrados (Kreil, 1995). Por sua vez, o ácido hialurônico liga-se a outras glicosaminoglicanas formando a substância fundamental do tecido conjuntivo, responsável por lubrificar tendões e cartilagens, além de atuar como uma barreira para a invasão de patógenos e toxinas. Em 1933, Duran-Reynalds descobriu que a hialuronidase aumentava a difusão de agentes virais em extratos de testículos e denominou-a de fator de espalhamento. No corpo humano, a hialuronidase é encontrada em testículos, baço, pele, olho, fígado, rim, útero e placenta, e em líquidos corporais como lágrima, sangue e esperma (Menzel e Far, 1998). Essa enzima ainda está presente em bactérias e em peçonhas de diversos animais, tais quais taturanas, abelhas, lagartos, aranhas, escorpiões, serpentes, dentre outros. Por conseguinte, durante o envenenamento, a atividade da hialuronidase é considerada crucial para a difusão das toxinas e supõe-se que a mesma distorce a integridade da matriz extracelular, por meio da degradação do ácido hialurônico (Girish et al., 2002). Hialuronidases são extensivamente usadas em muitas áreas tais como: ortopedia, cirurgia, oftalmologia, medicina interna, dermatologia, ginecologia, oncologia, etc. (Menzel e Farr, 1998). Estudos clínicos sugeriram, recentemente, que o uso tópico ou sistêmico de hialuronidases como adjuvantes pode aumentar o índice terapêutico de drogas anticâncer, pois aumentariam a difusão local de drogas associadas em tecidos e tumores. Terapeuticamente, as hialuronidases são usadas para acelerar a absorção e diminuir o desconforto causado pela injeção subcutânea ou intramuscular de fluídos, para promover a reabsorção de excessos de fluídos e extravasamento de sangue nos tecidos, e para aumentar a eficiência de anestésicos. O extravasamento de drogas intravenosas e infusões podem causar sérias perdas de tecido frouxo e cicatrização ao redor de nervos, junções e tendões. Nestes casos, costuma-se fazer injeção local de hialuronidases, entre outros procedimentos (Menzel e Farr, 1998; Girish e Kemparaju, 2005). O atual trabalho teve por objetivo fracionar e caracterizar biológica e enzimaticamente a hialuronidase da peçonha de uma cascavel presente na região do Triângulo Mineiro, Crotalus durissus collililneatus, de modo a verificar sua ação como fator de espalhamento das toxinas que caracterizam o envenenamento crotálico. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Animais de experimentação Os camundongos Swiss machos foram fornecidos pelo Biotério da empresa VALEÉ NORDESTE S/A e mantidos no Laboratório de Experimentação Animal da Universidade Federal de Uberlândia (LEA) Obtenção das peçonhas As peçonhas brutas cristalizadas de serpentes botrópicas e crotálicas foram fornecidas pela empresa Pentapharm do Brasil Comércio e Exportação Ltda e mantidas a -20 C. A peçonha foi dissolvida e centrifugada a rpm, durante 10 minutos a 4 C, de modo que apenas o sobrenadante foi utilizado para os experimentos posteriores. 2

3 2.3. Determinação quantitativa de proteínas Foi realizada a dosagem de proteínas segundo o Bradford (1976), sendo que a cada tubo continha 3 ml do Reagente de Bradford (100 mg de Comassie G, 50 ml de etanol, 100mL de ácido orto-fosfórico e o volume completado para 1L com água destilada). As amostras foram adicionadas à solução até que se obtivesse a coloração azul, de modo que o volume final das amostras, juntamente com a água destilada, deveria ser 100 µl. A cor desenvolvida foi quantificada a 595 nm e a concentração de proteínas foi determinada em µg/µl pela equação da curva padrão, previamente estabelecida Atividade hialuronidásica Teste turbidimétrico (FERRANTE, 1956, modificado por PUKRITTAYAKAMEE et al., 1988) Para determinar a atividade hialuronidásica, a amostra da enzima foi dissolvida em acetato de sódio 0,2 M; ph 6,0, contendo NaCl 0,15 M. A esta solução foram adicionados 25 µl ácido hialurônico 0,5% em um volume final de 250 µl. Essa nova solução foi incubada a 37 ºC por 15 minutos e a reação interrompida pela adição de 500 µl de brometo de cetiltrimetilamônio (BCTA) a 2,5% em solução de NaOH 2%. Posteriormente realizou-se a leitura das amostras a 400 nm por espectrofotometria. A atividade de redução turbidimétrica foi expressa como a quantidade de peçonha necessária para hidrolisar 50% do ácido hialurônico Teste de Zimograma (CEVALLOS et al., 1992) Foi usado o sistema de eletroforese descrito por Laemmli (1970), com uma única modificação: 1,48 ml de ácido hialurônico a uma concentração de 1,08 mg/ml foi acrescentado à matriz do gel para a polimerização. Após a eletroforese, o gel foi lavado duas vezes em 50 ml de uma solução de Triton X-100 5% em tampão fosfato de sódio 0,1 M; ph 5,8; contendo 0,15 M de NaCl por uma hora. Em seguida, o gel foi lavado novamente em 50 ml de Triton X-100 0,05% no mesmo tampão e no mesmo ph por uma hora e, finalmente, no mesmo tampão sem Triton X-100 por 10 minutos. O gel foi incubado a 37 C por 30 minutos, lavado duas vezes por 15 minutos em tampão Tris-HCl 0,015M; ph 7,95 e corado com uma solução de 0,1% de "Stains-All" estoque em formamida pura Fracionamento da peçonha bruta Preparação da amostra para cromatografia convencional Foram utilizados os mesmos passos para a preparação da amostra aplicada em HPLC, com a diferença de que foram pesados 100 mg de peçonha bruta que, posteriormente foram dissolvidos em 1mL do tampão Tris-HCl 0,1 M, ph 8, Cromatografia em CM Sepharose C-25 Foram emulsificados 200 mg de peçonha bruta em tampão acetato de amônio 0,05M; ph 5,5 e a solução foi centrifugada como descrito anteriormente. Após a dosagem quantitativa de proteínas, o sobrenadante foi aplicado na coluna de 50 ml, num fluxo de 0,3 ml/minuto. A coluna foi equilibrada e eluída com tampão acetato de amônio 0,05M; ph 5,5 e durante a cromatografia estabeleceu-se um gradiente step-wise com tampão acetato de amônio 0,5; ph 4,0; sendo coletados 3 ml por tubo. As amostras de cada tubo foram lidas em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 280 nm e testadas quanto à atividade hialuronidásica pelo método turbidimétrico. 3

4 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e revelação das proteínas em gel Foi realizado o método descrito por Laemmli (1970), que consiste em eletroforese em gel de poliacrilamida descontínua na presença de agentes desnaturantes (SDS) para a determinação das massas moleculares das proteínas contidas na peçonha. Esse método (sem agentes desnaturantes) também permite verificar o grau de pureza presente nas frações obtidas pelas cromatografias. O experimento foi realizado de acordo com o sistema de Höefer, com tampão de corrida Tris glicina SDS ph 8,3, gel de separação 12%, 25,0 A, 30 W e 600 V, durante cerca de 45 minutos. Após o período de corrida das amostras em gel, o mesmo foi corado por trinta minutos em solução de Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v) dissolvido em solução fixadora [Metanol 50% (v/v) e ácido acético 10% (v/v)]. Posteriormente o gel foi descorado com solução descorante [Etanol 30% (v/v) e ácido acético 10% (v/v)]. Por fim, o gel foi prensado entre duas folhas de papel celofane poroso e deixado secar à temperatura ambiente Atividade de espalhamento da hialuronidase As atividades de espalhamento da hialuronidase foram realizadas utilizando camundongos divididos em três grupos (n=3). O primeiro grupo recebeu injeção subcutânea de salina como controle negativo, o segundo recebeu peçonha bruta, como controle positivo, e o terceiro recebeu a fração de peçonha que não apresentou atividade hialuronidásica Letalidade (WEIL, 1952) Para determinação da letalidade, preparou-se uma solução mãe da peçonha bruta e da fração em que foi extraída a hialuronidase, com concentrações determinadas previamente, que foram diluídas em salina 0,9 %. Injetou-se intraperitonealmente 100µL de cada dose em cada camundongo. Os camundongos foram observados durante 24 horas e a DL50 foi determinada, com limites de confiança a 95%, sendo que foram utilizados seis animais para cada tipo de injeção recebida Atividade miotóxica indireta (RODRIGUES, 1996) Amostras contendo 10 µg de proteína foram diluídas em um volume final de 50 µl em salina, e injetadas intramuscularmente no músculo gastrocnêmio direito de camundongos (25g a 30g de peso), sendo que os controles receberam somente salina. Passadas 3 horas, os animais foram anestesiados com éter de petróleo, e o sangue dos camundongos coletado por punção cardíaca na presença de EDTA. Em seguida, o sangue foi centrifugado em baixa rotação (2000 rpm) por 10 minutos a 4 C. A atividade Creatina Quinase foi expressa em unidades/litro e determinada fotometricamente pela velocidade de formação do NADPH. Para tal procedimento foram incubados 20 µl do plasma com 1 ml do reativo dissolvido em tampão imidazol ph 6,7 contendo glicose por 1 min a 37 C (kit CK NAC Cinético da Bioclin) e as leituras de absorbância a 340 nm foram realizadas em intervalos de 0, 1, 2 e 3 minutos Atividade miotóxica direta As amostras foram preparadas como descrito para a atividade miotóxica indireta, assim como os animais receberam o mesmo tratamento para a injeção da amostra. Após 3 horas, os animais foram anestesiados e seus músculos gastrocnêmio foram retirados e fixados em uma mistura de etanol 95%, formol 30%, ácido acético glacial a água deionizada na proporção de 3:1:1:5 em volume durante 24 horas. 4

5 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Teste turbidimétrico Os testes para determinação da atividade hialuronidásica foi realizado com algumas serpentes botrópicas e crotálicas brasileiras, mencionadas na tabela 1, de modo que evidencou-se a presença mais acentuada da hialuronidase nas peçonhas crotálicas, Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus colillineatus. Tabela 1: Atividade hialuronidásica de diferentes peçonhas. A Atividade hialuronidásica foi determinada para as diferentes peçonhas conforme descrito no item de Materiais e Métodos. Atividade de Redução Turbidimétrica (µg) 1 Atividade Específica (U/mg) 2 Bothrops moojeni 3,72 268,80 Bothrops alternatus 5,27 189,75 Bothrops pauloensis 5,38 185,87 Bothrops jararaca 2,64 378,78 Bothrops jararacussu 19,49 5,13 Crotalus durissus terrificus 5,08 196,85 Crotalus durissus collilineatus 1,50 666,67 1 A atividade de redução turbidimétrica foi expressa como a quantidade de veneno (µg) necessária para hidrolisar 50% do ácido hialurônico. 2 Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para causar uma redução turbidimétrica de 50% do ácido hialurônico no tempo de incubação de 15 minutos a 37 C e a atividade específica são as unidades de redução turbidimétrica por mg de proteínas do veneno Este fato, também foi observado por Kudo e Tu (2001) que realizaram um screening da atividade hialuronidásica em 19 peçonhas de serpentes de diferentes famílias entre elas: Elapidae, Viperidae e Crotalidae, encontradas em diferentes regiões da Ásia, Europa e América Central Teste de zimograma De acordo com Boldrini-França et al. (2007), a peçonha de Crotalus durissus collilineatus possui a maior atividade hialuronidásica dentre as peçonhas botrópicas e crotálicas, como podemos evidenciar na figura 1. Figura 1: Eletroforese em zimograma. Em cada poço foram aplicados 10 µg de proteína. Amostras: (P.M.) Massa molecular em kda dos padrões (VII-L Invitrogem); (Hyase) Padrão de hialuronidase bovino; (B.a.) Bothrops alternatus; (B.j.) Bothrops jararaca; (B.p.) Bothrops pauloensis; (B.m.) Bothrops moojeni; (C.d.t.) Crotalus durissus terrificus; (C.d.c.) Crotalus durissus collilineatus. 5

6 Uma vez que a peçonha de Crotalus durissus collilineatus apresentou maior atividade hialuronidásica, a mesma foi escolhida para o presente trabalho. A figura ainda permite observar que a enzima de estudo possui aproximadamente 70 kda, sendo caracterizada por alta massa molecular. Como já relatado por alguns pesquisadores, peçonhas de serpentes, abelhas e escorpiões possuem hialuronidases de 33 a 110 kda, as quais são ativas in vitro numa faixa de ph de 4,0 a 6,0 (Iwanaga e Suzuki, 1979; Fiszer-Szafarz, 1984; Cevallos et al., Cromatografia em CM-Sepharose C-25 A hialuronidase foi eluída na linha de base, após todos os picos proteícos, evidenciando assim seu caráter básico em ph ácido. A figura 2 demonstra o perfil cromatográfico resultante do fracionamento da peçonha bruta nessa resina: Figura 2: Perfil da cromatográfico da peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus em coluna de troca iônica em CM-Sepharose C-25, eluído em acetato de amônio, num fluxo de 20mL/hora, sendo coletadas 3mL de amostra em cada tubo. Hyase é a fração com atividade hialuronidásica, representada por um círculo. Esta cromatografia resultou em dois picos proteícos eluídos em tampão acetato de amônio 0,05M, ph 5,5. Após a coleta de aproximadamente 350 ml de amostras eluídas nesse tampão, houve a troca do mesmo por step-wise para tampão acetato de amônio 0,5M, ph 4,0 e mais um pequeno pico foi eluído. Em seguida, após coletar aproximadamente 250 ml de amostra no segundo tampão, a hialuronidase foi eluída e as suas frações foram reunidas e liofilizadas. A tabela 2 apresenta a recuperação da hialuroniadase obtida nessa cromatografia. Tabela 2: Recuperação protéica da hialuronidase na cromatografia em CM-Sepharose Fast Flow. Frações Recuperação (mg) Recuperação protéica (%) Amostra 115,2 aplicada Hyase 0, ,21 O PAGE SDS da amostra resultante dessa cromatografia está representado pela figura 3, de forma que pode-se evidenciar a presença de apenas um contaminante na mesma fração em que a hialuronidase encontra-se. Esse contaminante possui baixo peso molecular, diferentemente da nossa enzima de interesse. Portanto, para separá-los uma cromatografia de gel filtração seria ideal. Todavia, devido ao baixo rendimento da hialuronidase, seria necessário utilizar uma quantidade muito grande de peçonha, o que é economicamente inviável. 6

7 1 2 Figura 3: PAGE SDS 12%: Foram aplicados 10µg de proteína correspondentes a fração com atividade hialuronidásica positiva eluídas na cromatografia em CM-Sepharose C-25. O número 1 corresponde à hialuronidase e o 2 corresponde ao contaminante. Apesar do baixo grau de purificação em cromatografias de gel filtração, evidenciado nesse estudo e pela literatura, esse é o primeiro passo cromatográfico realizado pela maioria dos autores que purificaram a hialuronidase de diversas peçonhas (Kudo e Tu, 2001; Morey et al., 2006; Girish et al., 2004, Nagaraju et al., 2007;Tu e Hendon, 1983). Como segundo passo cromatográfico, alguns desses autores realizaram a CM Sepharose C-25 e obtiveram uma melhor separação entre a hialuronidase e as demais enzimas, como foi verificado também na peçonha de Crotalus durissus collilineatus. Entretanto, Pessini e colaboradores (2001) realizaram a purificação da hialuronidase do escorpião Tityus serrulatus por meio de duas cromatografias em CM-Cellulose-52. Ao contrário do resultado aqui verificado, a hialuronidase foi encontrada em um dos picos prótéicos, e não na linha de base. Por outro lado, a enzima também foi eluída no final do fracionamento, após aproximadamente 900 ml de coleta das frações. Similarmente à recuperação protéica de 0,21% que encontramos nesse fracionamento, Girish et al (2004) obtiveram uma recuperação de 0,15% e 0,0135% de duas isoformas da hialuronidase da peçonha de Naja naja. Kudo etu (2001) utilizaram a mesma resina para o fracionamento e encontraram uma recuperação de 0,06%. Esses resultados demonstram que a hialuronidase é uma enzima pouco expressa em venenos, o que dificulta sua identificação por métodos tradicionais de purificação de proteínas. Por isso, nosso grupo de pesquisa já está realizando experimentos de Biologia Molecular que permitem a clonagem e a caracterização de tal enzima Letalidade Para testar a letalidade dasfrações, inicialmente foi determinada a DL 50 da peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus que foi de 0,25µg/g de animal. Apesar de a hialuronidase ter sido parcialmente purificada, testou-se a letalidade das frações com e sem atividade hialuronidásica, obtidas no fracionamento em CM-Sepharose C-25. Até a dose máxima testada que foi de 2,5µg/g de animal (10 DL50 da peçonha bruta), nenhuma das frações foi letal para os camundongos, assim como observamos que a hialuronidase não possui efeito letal. Por isso, podemos considerar ainda que a presença da hialuronidase é de extrema importância para a difusão das toxinas letais. 7

8 3.5. Atividade miotóxica indireta Os valores da atividade de CK obtidos foram de 650 U/L, 325 U/L e 243 U/L para a peçonha bruta, frações sem atividade hialuronidásica e fração com atividade hialuronidásica, respectivamente. A atividade de CK obtida pelo grupo controle foi de 47 U/L. Assim, observou-se uma baixa atividade miotóxica para os dois tipos de frações testadas, podendo-se concluir que a hialuronidase não causa miotoxicidade, mas sua ausência pode provocar uma redução nessa atividade, confirmando sua ação de espalhamento das demais toxinas. Girish et al. (2004), Nagaraju et al. (2007) e Pessini et al. (2001) também observaram que apenas o grupo de animais que recebeu a peçonha bruta apresentou altos níveis séricos de CK 3.6. Atividade miotóxica direta Utilizando-se apenas 10 µl de amostra (peçonha bruta e frações com e sem atividade hialuronidásica), não visualizou-se necrose no músculo gastrocnêmio dos camundongos. 4. CONCLUSÃO A hialuronidase é uma enzima presente tanto em peçonhas crotálicas e botrópicas, sendo mais abundante, dentre as peçonhas testadas, em Crotalus durissus collilineatus. Essa enzima possui massa molecular aparente de 70 kda e corresponde a 0,21% dos componentes totais dessa peçonha. Além disso, a enzima contribui para o espalhamento de toxinas que atuam na letalidade e na miotoxicidade do envenenamento crotálico. Entretanto, apesar de seu efeito potencializado, essa é uma enzima expressa em poucas quantidades em tais peçonhas, de modo que técnicas de Biologia Molecular serão de extrema importância para uma melhor caracterização dessa enzima. 5. AGRADECIMENTOS Nós agradecemos à UFU e ao CNPq pelo apoio financeiro que permitiu a realização desse trabalho. Tembém gostaríamos de agradecer a Renata Rodrigues Santos, Johara Boldrini França e Malson Neilson de Lucena pela valiosa ajuda com os experimentos aqui descritos. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Boldrini-França, J. ; Alves, F. V. ; Castanheira, L. E. ; Santos, H. L. ; Otaviano, A. R. ; Arantes, E. C. ; Hamaguchi, A. ; Rodrigues, V. M. ; Homsi-Brandeburgo, M. I., 2007 Characterization of Hyaluronidase Activity from Several Viperidae Snake Venoms and Parcial Isolation of Hyaluronidase from Crotalus durissus collilineatus Snake Venom. In: XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology, Salvador. Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. v. 7, p ,. Cardoso, J. L. C., 2003 Animais peçonhentos no Brasil: biologia clínica e terapêutica dos acidentes. São Paulo-SP: Sarvier, p Cevallos, M.A. Navarro-Duque, C.; Varela-Julia, M.; Alagon, A.C., Molecular mass determination and assay of venom hyaluronidases by sodium dodecyl sulfate-polycrylamide gel eletrophoresis. Toxicon. v. 30, nº.8, p Duran-Reynals, F., 1933 Studies on a certaisn spreading factor existing in bacteria and its significance for bacterial invasiveness. J. Exp. Med. 58, p Ferrante, N.D., Turbidimetric measurement of acid mucopolysaccharides and hyaluronidase activiy. Journal of Biological Chemistry. v. 220, p

9 Fiszer-Szafarz, B., 1984 Hyaluronidase polymorphism detected by polyacrylamide gel electrophoresis: Application to hyaluronidases from bacteria, slime molds, bee and snake venoms. Analytical Biochemistry v. 143, p , Fundação Nacional de Saúde, Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília: Fundação Nacional de Saúde, p Girish, K. S. ; Jagadeesha, D. K. ; Rajeev, K. B. ; Kemparaju, K, Snake venom hyaluronidase: An evidence for isoforms and extracellular matrix degradation. Molecular and Cellular Biochemistry. v. 240, p Girish, K.S; Shashidharamurthy, S.; Nagaraju, T.V.; Kemparaju, K., Isolation and characterization of hyaluronidase a spreading factor from Indian cobra (Naja naja) venom. Biochimie. v.86, p Girish, K. S.; Kemparaju, K., 2005 Inhibition of Naja naja hyaluronidase: role in the management of poisonous bite. Life Sciences. v. 13, nº 78, p Hawgood, B. J., 1990 Crotoxin, the phospsolipase A 2 neurotoxin from the venom of Crotalus durissus terrificus. Memórias do Instituto Butantan. v. 52, p Iwanaga, S.; Suzuki, T., In: Snake Venom (LEE, C.Y. ed.), p. 99.New York, Springer- Verlag. Kreil, G., 1995 Hyaluronidases a group of neglected enzymes. Protein Science. v. 4, p Kudo, K.; Tu, A.T, Caracterization of hyaluronidase isolated from Agkistrodon contortrix contortrix (Southern copperhead) venom. Archives of Biochemistry and Biophysics. v.386, nº2, p Laemmli, U.K., 1970 Cleavage of structural proteins, during the annembly of the head of bacteriophage T4. Nature. v.227, p Menzel, E.J.; Farr, C., Hyaluronidase and its substrate: biochemistry, biological activities and therapeutic uses. Cancer Letters. v.131, p Ministério da Saúde Acidentes por animais peçonhentos. Disponível em: < Acesso em: 15 mai.2007 Morey, S.S.; Kirian, K.M.; Gadag, J.R., 2006 Purification and properties of hyaluronidase from Palameneus gravimanus (Indian black scorpion) venom. Toxicon. v.47, p Nagaraju, S.; Devaraja, S.; Kemparaju, K., Purification and properties of hyaluroniadase from Hippasa partita (funnel web spider) venom gland extract. Toxicon. v. 50, p Oshima-Franco, Y.; Hysolp, S.; Prado, J. F.; Cruz M. A. H.; Rodriguez, L. S., Neutralizing capacity of antisera raised in horses and rabbits against Crotalus durissus terrificus (South- American rattlesnake) venom and its main toxin, crotoxin. Toxicon. v. 37, p Pessini, A.C.; Takao, T.T.; Cavalheiro, E.C.; Vichinewski, W.; Sampaio, S.V.; Giglio, J.R.; Arantes, E.C., A hyaluronidase from Tityus serrulatus scorpion venom: isolation, characterization and inhibition by flavonoids. Toxicon. v. 39, p Pukrittayakamee, S.; Warrell, D.A.; Desakorn, V.; McMichael, A.J.; White, N.J., Bunnag, D., The hyaluronidase activities of some southeast asian snake venoms. Toxicon. v. 26, nº 7, p Rodrigues, V. M. Isolamento e caracterização química parciais de duas miotoxinas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis (jararaca pintada) Dissertação (Mestrado em Genética e Bioquímica) Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 96 p. Tu, A.T.; Hendon, R.R., Characterization of lizard venom hyaluronidase and evidence for its action as a spreading factor. Comparative Biochemistry and Physiology. 76B, p Vital-Brazil, O., Pharmacology of Crotamine. Memórias do Instituto Butantan. v. 52, p. 23, Weil, C.S.,1952. Tables for convenient calculation of median effective dose (LD50 or ED50) and instructions in their use. Biometrics. v.9, p. 249,

10 PARCIAL PURIFICATION AND ENZIMATIC AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF HYALURONIDASE FROM CROTALUS DURISSUS COLLILINEATUS SNAKE VENOM Letícia Eulálio Castanheira 1, Maria Inês Homsi Brandeburgo 2, Veridiana de Melo Rodrigues Ávila 2, Amélia Hamaguchi 3 Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica. Av. Pará, 1720, B.: Umuarama. Uberlândia, Minas Gerais. C.E.P.: leticia_casth@yahoo.com.br Abstract: Ophidic accidents represent a serious health problem in tropical countries, where south rattlesnakes, determinated by Crotalus genus in Brazil, are responsible for the highest indexes of lethality. This kind of poisoning is characterized mainly by systemic effects, as acute renal and respiratory failures, neurotoxicity, cardiotoxicity, myotoxicity and hemorrhages. Hyaluronidase is a non toxic enzyme known as spreading factor, because it degrades the extra cellular matrix and, at the same time, improve the diffusion of the other toxins during the poisoning. This work shows the parcial purification and characterization of hyaluronidase from Crotalus durissus collilineatus snake venom. This enzyme has apparent molecular mass of 70 kda. In all chromatographic steps done, CM-Sepharose C-25 was the most effective, which few contaminants were found in the same fraction that hyaluronidase, despite a low yield of purification (0.21%). We couldn t find miotoxicity and lethality in the fractions without hyaluronidase activity, unlike the whole venom, confirming the action of hyaluronidase as "spreading factor" of the toxins in the poisoning by Crotalus durissus collilineatus. Keywords: Crotalus durissus collilineatus, hyaluronidase, spreading factor. 10