Palavras-chave: Crotalus durissus collilineatus, hialuronidase, fator de espalhamento.

Transcrição

1 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA E BIOLÓGICA PARCIAIS DA HIALURONIDASE PRESENTE NA PEÇONHA DE CROTALUS DURISSUS COLLILINEATUS LETÍCIA EULÁLIO CASTANHEIRA 1, MARIA INÊS HOMSI BRANDEBURGO 1 VERIDIANA DE MELO RODRIGUES ÁVILA 1, AMÉLIA HAMAGUCHI 1. Resumo: Acidentes ofídicos constituem um grave problema de saúde pública nos países tropicais, sendo as cascavéis, representadas pelo gênero Crotalus no Brasil, responsáveis pelos maiores índices de letalidade. O envenenamento crotálico caracteriza-se predominantemente por efeitos sistêmicos, como insuficiências agudas renal e respiratória, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, miotoxicidade e hemorragias. A hialuronidase é uma enzima não tóxica conhecida como fator de espalhamento, por facilitar a difusão de toxinas durante o envenenamento, pois degrada a matriz extracelular das vítimas. Este trabalho relata a purificação e a caracterização parciais da hialuronidase da peçonha de Crotalus durissus collilineatus. Observou-se que a enzima possui massa molecular aproximada de 70 kda. Dentre os passos cromatográficos realizados, o fracionamento da peçonha bruta em CM-Sepharose C-25 foi o mais efetivo, verificando-se poucos contaminantes na fração com atividade hialuronidásica positiva, apesar do rendimento de 0,21%. Miotoxicidade e letalidade não foram detectadas em nenhuma das frações obtidas, ao contrário da peçonha bruta, confirmando a ação da hialuronidase como fator de espalhamento das toxinas no envenenamento pela peçonha estudada. Palavras-chave: Crotalus durissus collilineatus, hialuronidase, fator de espalhamento. 1 - Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia - Rua Pará, Uberlândia, Minas Gerais. CEP Correspondência: leticia_casth@yahoo.com.br

2 2 Abstract: Ophidic accidents represent a serious health problem in tropical countries, where south rattlesnakes, determinated by Crotalus genus in Brazil, are responsible for the highest indexes of lethality. This kind of poisoning is characterized mainly by systemic effects, as acute renal and respiratory failures, neurotoxicity, cardiotoxicity, myotoxicity and hemorrhages. Hyaluronidase is a non toxic enzyme known as spreading factor, because it degrades the extra cellular matrix and, at the same time, improve the diffusion of the other toxins during the poisoning. This work shows the parcial purification and characterization of hyaluronidase from Crotalus durissus collilineatus snake venom. This enzyme has apparent molecular mass of 70 kda. In all chromatographic steps done, CM-Sepharose C-25 was the most effective, which few contaminants were found in the same fraction that hyaluronidase, despite a low yield of purification (0.21%). We couldn t find miotoxicity and lethality in the fractions without hyaluronidase activity, unlike the whole venom, confirming the action of hyaluronidase as "spreading factor" of the toxins in the poisoning by Crotalus durissus collilineatus. Keywords: Crotalus durissus collilineatus, hyaluronidase, spreading factor. 1. Introdução: O ofidismo representa um problema de saúde nacional desde o Brasil colônia, sendo considerado como umas das grandes pragas daquela época, em virtude do significativo número de óbitos. Segundo dados do Ministério da Saúde (2001), ocorrem anualmente no Brasil de a acidentes por picadas de serpentes, com índice de letalidade de 0,4%. Apesar de a região Sudeste apresentar o maior número de casos ( sualizar_texto.cfm?idtxt=21924), acredita-se que haja subnotificações nas regiões Norte e Nordeste, devido às dificuldades de acesso ao serviço de saúde. A epidemiologia dos acidentes ofídicos revela um perfil de vítimas preferencialmente do sexo masculino, sendo trabalhadores rurais entre 15 e 49 anos, atingidos, sobretudo nos membros inferiores. Os acidentes também se caracterizam por uma sazonalidade marcante, ocorrendo com maior freqüência no início e no final do ano (Bochner e Struchiner, 2003), durante períodos chuvosos.

3 3 As serpentes do gênero Bothrops, conhecidas popularmente como jararacas, jararacuçu ou urutu são responsáveis por 90,5% dos acidentes no Brasil, seguidas das serpentes do gênero Crotalus (cascavéis), com 7,7% dos casos e das serpentes do gênero Lachesis (surucucus), com 1,4%, e Micrurus ( corais verdadeiras ), com 0,4% dos acidentes relatados (Fundação Nacional da Saúde, 1998). Contudo, o maior número de casos fatais está relacionado com as cascavéis, seguidos das serpentes dos gêneros Lachesis, Micrurus e Bothrops, respectivamente (Cardoso, 2003). As peçonhas ofídicas são ricas em enzimas proteolíticas que atuam sobre uma grande variedade de substratos naturais, tais quais caseína, hemoglobina, colágeno, elastina, fibrinogênio, insulina e glucagon (Iwanaga e Suzuki, 1979). Algumas dessas enzimas são toxinas hemorrágicas que degradam proteínas da matriz extracelular (Matrisian, 1992), outras afetam a coagulação do sangue, agindo como procoagulantes, convertendo o fibrinogênio em fibrina (Markland e Damus, 1971; Stocker e Barlow, 1976; Selistre e Giglio, 1987); enquanto outras agem como anticoagulantes por exercerem atividade fibrinogenolítica e fibrinolítica (Komori et al., 1985; Daoud et al., 1986). Além disso, a ação da peçonha pode também desencadear severas desordens metabólicas, a saber: neurotoxicidade, edematogenicidade, cardiotoxicidade, ações coagulantes, hemostáticas, hemorrágicas, neufrotóxicas e hepatotóxicas (Chippaux, 1991). O gênero Crotalus é representado no Brasil por uma única espécie, Crotalus durissus, e por cinco subespécies com ampla distribuição geográfica. A subespécie aqui estudada, Crotalus durissus collilineatus, é distribuída nas regiões secas do Centro-Oeste e Sudeste (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e norte do Estado de São Paulo), sendo popularmente denominada por cascavel e maracabóia (Hoge e Romano, 1978). A alta letalidade causada por essas serpentes é devida principalmente ao efeito sistêmico da peçonha crotálica, sendo que as toxinas presentes na mesma podem propiciar insuficiências agudas renal e respiratória (Amaral et al., 1986). Os principais efeitos fisiológicos decorrentes dos acidentes crotálicos, assim como a alta toxicidade da peçonha, devem-se à presença de diversas toxinas,

4 4 a saber: crotoxina, crotamina, giroxina, convulxina, serinoproteases e fosfolipases A2 (Oshima-Franco et al., 1999), em que as duas primeiras são as mais extensivamente estudadas. A crotoxina consiste de duas subunidades polipeptídicas que formam um complexo responsável pela paralisia respiratória, seguida de morte da vítima (Hawgood, 1990). Por sua vez, a crotamina é um polipeptídeo básico ativador de canais de sódio no músculo esquelético, resultando em miotonia (Vital Brasil, 1990), ou seja, incapacidade de relaxamento muscular após a contração. Em contrapartida, dentre as enzimas não-tóxicas, destaca-se a hialuronidase, uma enzima presente em quase todas as peçonhas ofídicas, mas seus estudos são muito escassos. Isso ocorre em detrimento da instabilidade da hialuronidase, o que gera dificuldade no isolamento, na purificação e na realização das atividades enzimáticas (Stern et al., 2007). As hialuronidases são enzimas que naturalmente degradam o ácido hialurônico, o maior componente da matriz extracelular dos vertebrados (Kreil, 1995). Em 1971, Meyer classificou tal enzima em três classes, de acordo com análises bioquímicas e dos produtos finais da degradação, de modo que as mesmas se diferem pelo mecanismo de ação e são denominadas como hialuronidases de mamíferos, de sanguessugas e microbianas. Por sua vez, o ácido hialurônico ligase a outras glicosaminoglicanas como heparan sulfato, dermatan sulfato e condroitinas A e C, para formar a substância fundamental do tecido conjuntivo. Esse complexo constitui uma rede que, além de lubrificar tendões e cartilagens, atua como uma barreira para a invasão de patógenos e toxinas. Além do mais, o ácido hialurônico está presente em quase todos os tecidos de vertebrados, porém é mais abundante na matriz extracelular do tecido conjuntivo frouxo (Fraser et al., 1983), sobretudo no cordão umbilical, pele, líquido sinovial e humor vítreo. Em 1933, Duran-Reynalds descobriu que a hialuronidase aumentava a difusão de agentes virais em extratos de testículos e denominou-a de fator de espalhamento. No corpo humano, a hialuronidase é encontrada em testículos, baço, pele, olho, fígado, rim, útero e placenta, e em líquidos corporais como lágrima, sangue e esperma (Menzel e Far,

5 5 1998). Essa enzima ainda está presente em bactérias e em peçonhas de diversos animais, tais quais taturanas, abelhas, lagartos, aranhas, escorpiões, serpentes, dentre outros. Por conseguinte, durante o envenenamento, a atividade da hialuronidase é considerada crucial para a difusão das toxinas e supõe-se que a mesma distorce a integridade da matriz extracelular, por meio da degradação do ácido hialurônico (Girish et al., 2002). Hialuronidases são extensivamente usadas em muitas áreas tais como: ortopedia, cirurgia, oftalmologia, medicina interna, dermatologia, ginecologia, oncologia, etc. (Menzel e Farr, 1998). Estudos clínicos sugeriram, recentemente, que o uso tópico ou sistêmico de hialuronidases como adjuvantes pode aumentar o índice terapêutico de drogas anticâncer, pois aumentariam a difusão local de drogas associadas em tecidos e tumores. Terapeuticamente, as hialuronidases são usadas para acelerar a absorção e diminuir o desconforto causado pela injeção subcutânea ou intramuscular de fluídos, para promover a reabsorção de excessos de fluídos e extravasamento de sangue nos tecidos, e para aumentar a eficiência de anestésicos. O extravasamento de drogas intravenosas e infusões podem causar sérias perdas de tecido frouxo e cicatrização ao redor de nervos, junções e tendões. Nestes casos, costuma-se fazer injeção local de hialuronidases, entre outros procedimentos (Menzel e Farr, 1998; Girish e Kemparaju, 2005). O atual trabalho teve por objetivo fracionar e caracterizar biológica e enzimaticamente a hialuronidase da peçonha de uma cascavel presente na região do Triângulo Mineiro, Crotalus durissus collililneatus, de modo a verificar sua ação como fator de espalhamento das toxinas que caracterizam o envenenamento crotálico. 2. Material e Métodos: 2.1. Animais de experimentação Os camundongos Swiss machos foram fornecidos pelo Biotério da empresa VALEÉ NORDESTE S/A e mantidos no Laboratório de Experimentação Animal da Universidade Federal de Uberlândia (LEA) Obtenção das peçonhas As peçonhas brutas cristalizadas de

6 6 serpentes botrópicas e crotálicas foram fornecidas pela empresa Pentapharm do Brasil Comércio e Exportação Ltda e mantidas a -20 C. A peçonha foi dissolvida e centrifugada a rpm, durante 10 minutos a 4 C, de modo que apenas o sobrenadante foi utilizado para os experimentos posteriores Determinação quantitativa de proteínas Foi realizada a dosagem de proteínas segundo o Bradford (1976), sendo que a cada tubo continha 3 ml do Reagente de Bradford (100 mg de Comassie G, 50 ml de etanol, 100mL de ácido orto-fosfórico e o volume completado para 1L com água destilada). As amostras foram adicionadas à solução até que se obtivesse a coloração azul, de modo que o volume final das amostras, juntamente com a água destilada, deveria ser 100 µl. A cor desenvolvida foi quantificada a 595 nm e a concentração de proteínas foi determinada em µg/µl pela equação da curva padrão, previamente estabelecida Atividade hialuronidásica Teste turbidimétrico (FERRANTE, 1956, modificado por PUKRITTAYAKAMEE et al., 1988) Para determinar a atividade hialuronidásica, a amostra da enzima foi dissolvida em acetato de sódio 0,2 M; ph 6,0, contendo NaCl 0,15 M. A esta solução foram adicionados 25 µl ácido hialurônico 0,5% em um volume final de 250 µl. Essa nova solução foi incubada a 37 ºC por 15 minutos e a reação interrompida pela adição de 500 µl de brometo de cetiltrimetilamônio (BCTA) a 2,5% em solução de NaOH 2%. Posteriormente realizou-se a leitura das amostras a 400 nm por espectrofotometria. A atividade de redução turbidimétrica foi expressa como a quantidade de peçonha necessária para hidrolisar 50% do ácido hialurônico Teste de Zimograma (CEVALLOS et al., 1992) Foi usado o sistema de eletroforese descrito por Laemmli (1970), com uma única modificação: 1,48 ml de ácido hialurônico a uma concentração de 1,08 mg/ml foi acrescentado à matriz do gel para a polimerização. Após a eletroforese, o gel foi lavado duas vezes em 50 ml de uma solução de Triton X-

7 % em tampão fosfato de sódio 0,1 M; ph 5,8; contendo 0,15 M de NaCl por uma hora. Em seguida, o gel foi lavado novamente em 50 ml de Triton X-100 0,05% no mesmo tampão e no mesmo ph por uma hora e, finalmente, no mesmo tampão sem Triton X-100 por 10 minutos. O gel foi incubado a 37 C por 30 minutos, lavado duas vezes por 15 minutos em tampão Tris-HCl 0,015M; ph 7,95 e corado com uma solução de 0,1% de "Stains-All" estoque em formamida pura Padronização do fracionamento da peçonha bruta Preparação da amostra para a cromatografia em HPLC Foram dissolvidos 20 mg de peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus em 600 µl de tampão Tris- HCl 0,1M, ph 8,5. Essa solução foi centrifugada por 10 minutos a 4 C e rpm. O sobrenadante foi dosado pelo método de Bradford, para verificar-se a quantidade de proteína que havia na amostra após a centrifugação. Para garantir que a hialuronidase estava presente no sobrenadante, realizou-se teste turbidimétrico com o mesmo Cromatografia da peçonha bruta em HPLC Inicialmente, a cromatografia foi realizada no aparelho cromatográfico Äkta Prime Plus, da GE Healthcare (com monitor U.V. 280 nm). Utilizou-se a coluna de Q- Sepharose Fast Flow, que é uma resina de troca iônica altamente positiva. O tampão escolhido foi o Tris- HCl 0,1 M ph 8,5 para o eletrodo A e, para o eletrodo B, utilizou-se o Tris HCl 0,1 M, NaCl 1M, ph 8,5. Portanto, as proteínas de carga negativa foram eluídas de acordo com o aumento da concentração do sal Dessalinização das frações Para dessalinização das frações, foram utilizados dois métodos, com o intuito de estabelecer o mais adequado para o seguimento dos experimentos. No primeiro, foi utilizada uma coluna HiTrap dessalting (1 ml). No segundo, utilizou o método da diálise, em que foi utilizada uma membrana de a (MW), contendo a amostra com atividade hialuronidásica em tampão Tris HCl 0,1 M, ph 8,5, de modo que o tampão fosse

8 8 trocado duas vezes em intervalos de duas horas. Após as dessalificações, as amostras foram liofilizadas e mantidas a - 20 C. Fast Flow, foi utilizado o aparelho AMICON Millipore, com membrana de 30 kda, de modo que o filtrado contém o sal e o retido contém as proteínas Preparação da amostra para cromatografia convencional Foram utilizados os mesmos passos para a preparação da amostra aplicada em HPLC, com a diferença de que foram pesados 100 mg de peçonha bruta que, posteriormente foram dissolvidos em 1mL do tampão Tris-HCl 0,1 M, ph 8, Cromatografia em Q-Sepharose Fast Flow Foi utilizado o mesmo procedimento anterior de cromatografia, utilizando-se uma resina de troca iônica, porém essa coluna possui 20 ml, enquanto a outra possui 5 ml, o que permite a aplicação de uma maior quantidade de amostra. Entretanto, essa cromatografia não foi realizada m alta pressão, pois não foi utilizado o aparelho HPLC Dessalinificação em AMICON Para retirar o sal das frações obtidas na cromatografia em Q-Sepharose Cromatografia em Sephadex G- 75 Dissolveu-se 200 mg de peçonha bruta em 1 ml de água e a solução foi centrifugada como descrito anteriormente. Logo, o sobrenadante foi dosado quanto a concentração de proteínas e testado turbidimetricamente. O sobrenadante foi aplicado à coluna (86 x 2,0 cm) e realizou-se a atividade hialuronidásica dos picos protéicos, sendo que aqueles que não possuíam hialuronidase foram separados para os testes de letalidade. As amostras foram eluídas com água em um fluxo de 20 ml/hora, coletando 3,0 ml de amostra por tubo a temperatura ambiente Cromatografia em CM Sepharose C-25 Foram emulsificados 200 mg de peçonha bruta em tampão acetato de amônio 0,05M; ph 5,5 e a solução foi centrifugada como descrito anteriormente. Após a dosagem quantitativa de proteínas, o sobrenadante

9 9 foi aplicado na coluna de 50 ml, num fluxo de 0,3 ml/minuto. A coluna foi equilibrada e eluída com tampão acetato de amônio 0,05M; ph 5,5 e durante a cromatografia estabeleceu-se um gradiente step-wise com tampão acetato de amônio 0,5; ph 4,0; sendo coletados 3 ml por tubo. As amostras de cada tubo foram lidas em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 280 nm e testadas quanto à atividade hialuronidásica pelo método turbidimétrico Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) Foi realizado o método descrito por Laemmli (1970), que consiste em eletroforese em gel de poliacrilamida descontínua na presença de agentes desnaturantes (SDS) para a determinação das massas moleculares das proteínas contidas na peçonha. Esse método (sem agentes desnaturantes) também permite verificar o grau de pureza presente nas frações obtidas pelas cromatografias. O experimento foi realizado de acordo com o sistema de Höefer, com tampão de corrida Tris glicina SDS ph 8,3, gel de separação 12%, 25,0 A, 30 W e 600 V, durante cerca de 45 minutos Revelação das proteínas em gel Após o período de corrida das amostras em gel, o mesmo foi corado por trinta minutos em solução de Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v) dissolvido em solução fixadora [Metanol 50% (v/v) e ácido acético 10% (v/v)]. Posteriormente o gel foi descorado com solução descorante [Etanol 30% (v/v) e ácido acético 10% (v/v)]. Por fim, o gel foi prensado entre duas folhas de papel celofane poroso e deixado secar à temperatura ambiente Atividade de espalhamento da hialuronidase As atividades de espalhamento da hialuronidase foram realizadas utilizando camundongos divididos em três grupos (n=3). O primeiro grupo recebeu injeção subcutânea de salina como controle negativo, o segundo recebeu peçonha bruta, como controle positivo, e o terceiro recebeu a fração de peçonha que não apresentou atividade hialuronidásica Letalidade (WEIL, 1952) Para determinação da letalidade, preparou-se uma solução mãe da peçonha bruta e da fração em que foi extraída a

10 10 hialuronidase, com concentrações determinadas previamente, que foram diluídas em salina 0,9 %. Injetou-se intraperitonealmente 100µL de cada dose em cada camundongo. Os camundongos foram observados durante 24 horas e a DL50 foi determinada, com limites de confiança a 95%, sendo que foram utilizados seis animais para cada tipo de injeção recebida Atividade miotóxica indireta (RODRIGUES, 1996) Amostras contendo 10 µg de proteína foram diluídas em um volume final de 50 µl em salina, e injetadas intramuscularmente no músculo gastrocnêmio direito de camundongos (25g a 30g de peso), sendo que os controles receberam somente salina. Passadas 3 horas, os animais foram anestesiados com éter de petróleo, e o sangue dos camundongos coletado por punção cardíaca na presença de EDTA. Em seguida, o sangue foi centrifugado em baixa rotação (2000 rpm) por 10 minutos a 4 C. A atividade Creatina Quinase foi expressa em unidades/litro e determinada fotometricamente pela velocidade de formação do NADPH. Para tal procedimento foram incubados 20 µl do plasma com 1 ml do reativo dissolvido em tampão imidazol ph 6,7 contendo glicose por 1 min a 37 C (kit CK NAC Cinético da Bioclin) e as leituras de absorbância a 340 nm foram realizadas em intervalos de 0, 1, 2 e 3 minutos Atividade miotóxica direta As amostras foram preparadas como descrito para a atividade miotóxica indireta, assim como os animais receberam o mesmo tratamento para a injeção da amostra. Após 3 horas, os animais foram anestesiados e seus músculos gastrocnêmio foram retirados e fixados em uma mistura de etanol 95%, formol 30%, ácido acético glacial a água deionizada na proporção de 3:1:1:5 em volume durante 24 horas. 3.Resultados e discussão: 3.1. Teste turbidimétrico: Os testes para determinação da atividade hialuronidásica foi realizado com as seguintes peçonhas botrópicas e crotálicas: Bothrops moojeni, Bothrops alternatus, Bothorps jararaca, Bothrops jararacussu, Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus colillineatus. Como

11 11 podemos observar na Tabela 1, a hialuronidase está presente em todas as peçonhas estudadas. No entanto, fica evidente a presença mais acentuada da hialuronidase nas peçonhas crotálicas, Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus colillineatus. Tabela 1: Atividade hialuronidásica de diferentes peçonhas. A Atividade hialuronidásica foi determinada para as diferentes peçonhas conforme descrito no item de Materiais e Métodos. Atividade de Redução Turbidimétrica Atividade Específica (U/mg) 2 (µg) 1 Bothrops moojeni 3,72 268,80 Bothrops alternatus 5,27 189,75 Bothrops pauloensis 5,38 185,87 Bothrops jararaca 2,64 378,78 Bothrops jararacussu 19,49 5,13 Crotalus durissus 5,08 196,85 terrificus Crotalus durissus collilineatus 1,50 666,67 1 A atividade de redução turbidimétrica foi expressa como a quantidade de veneno (µg) necessária para hidrolisar 50% do ácido hialurônico. 2 Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para causar uma redução turbidimétrica de 50% do ácido hialurônico no tempo de incubação de 15 minutos a 37 C e a atividade específica são as unidades de redução turbidimétrica por mg de proteínas do veneno Este fato, também foi observado por Kudo e Tu (2001) que realizaram um screening da atividade hialuronidásica em 19 peçonhas de serpentes de diferentes famílias entre elas: Elipidae, Viperidae e Crotalidae, encontradas em diferentes regiões da Ásia, Europa e América Central. Dentre as serpentes estudadas por esses autores, as crotálicas, tais como Crotalus adamanteus, Crotalus atrox, Crotalus basiliscus e Crotalus horridus horridus, também apresentaram maior atividade hialuronidásica quando comparada às demais serpentes (Xu et al., 1982; Pukrittayamee et al., 1983, 1988; Kudo and Tu, 2001; Girish et al., 2002) Teste de zimograma: De acordo com Boldrini-França et al. (2007), a peçonha de Crotalus durissus collilineatus possui a maior atividade hialuronidásica dentre as peçonhas botrópicas e crotálicas. A figura 1 mostra os dados obtidos no gel de poliacrilamida para atividade hialuronidásica (zimograma), comparando-se essas peçonhas.

12 12 Figura 1: Eletroforese em zimograma. Em cada poço foram aplicados 10 µg de proteína. Amostras: (P.M.) Massa molecular em kda dos padrões (VII-L Invitrogem); (Hyase) Padrão de hialuronidase bovino; (B.a.) Bothrops alternatus; (B.j.) Bothrops jararaca; (B.p.) Bothrops pauloensis; (B.m.) Bothrops moojeni; (C.d.t.) Crotalus durissus terrificus; (C.d.c.) Crotalus durissus A peçonha de Bothrops jararacussu não foi testada no zimograma porque experimentos prévios, por turbidimetria, revelaram que tal peçonha apresenta baixíssima atividade hialuronidásica. Uma vez que a peçonha de Crotalus durissus collilineatus apresentou maior atividade hialuronidásica, a mesma foi escolhida para o presente trabalho. A figura ainda permite observar que a enzima de estudo possui aproximadamente 70 kda, sendo uma enzima de alta massa molecular. Como já relatado por alguns pesquisadores, peçonhas de serpentes, abelhas e escorpiões possuem hialuronidases de 33 a 110 kda, as quais são ativas in vitro numa faixa de ph de 4,0 a 6,0 (Iwanaga e Suzuki, 1979; Fiszer-Szafarz, 1984; Cevallos et al., 1992). Portanto, a massa molecular encontrada para a hialuronidase de Crotalus durissus collilineatus é compatível com as demais hialuronidases de peçonhas descritas pela literatura Cromatografia da peçonha bruta em HPLC: A cromatografia realizada com a peçonha bruta, na coluna Q Sepharose fast flow, resultou em três picos protéicos a 280 nm, as quais não apresentaram atividade hialuronidásica, sendo que o teste turbidimétrico positivo e máximo foi verificado na linha de base. O primeiro pico apareceu logo no início da cromatografia, representando as proteínas de carga positiva que não interagiram com a resina, enquanto que o segundo e o terceiro picos foram obtidos após o gradiente de sal, com 56% e 75% de NaCl, respectivamente.

13 Dessalificação com a dessalting HiTrap: Na dessalting realizada em HPLC, foram obtidos dois picos protéicos sem sal e mais um pico com sal, sendo que o último apresentou atividade hialuronidásica, de modo que esse procedimento não foi eficiente para separar a enzima do sal. 1,2M, depois para 1,5M e para 3,0M. Posteriormente, o ph do tampão foi trocado para 7,0, mas o resultado não se alterou. Como os tubos ainda apresentavam a referida atividade, foi realizado o teste turbidimétrico apenas com o tampão, que também indicou atividade positiva, comprovando um falso positivo Diálise: A amostra submetida à diálise perdeu a atividade hialuronidásica, o que demonstrou que esse método também não é totalmente eficaz para separar a amostra do sal. Além disso, a amostra com hialuronidase pode ter extravasado pela membrana de diálise juntamente com o sal Cromatografia em Q Sepharose Fast Flow: Nessa cromatografia, inicialmente, foi obtido um único pico protéico sem sal que não apresentou atividade turbidimétrica. No início do gradiente com sal, já na linha de base, verificou-se a atividade hialuronidásica. Entretanto, o conteúdo de todos os tubos apresentavam atividade positiva, e, neste caso a concentração do sal foi aumentada para 3.7. Dessalificação em AMICON: O filtrado apresentou atividade hialuronidásica, o que mostrou que esse procedimento não foi eficaz para separar o sal da enzima, pois a enzima e o sal deveriam encontrar-se no líquido retido e no líquido filtrado, respectivamente. Entretanto, ambos apareceram no filtrado. Por isso, determinou-se que os próximos procedimentos cromatográficos a serem testados seriam realizados em tampões sem sal ou em água, de modo que não fosse necessário realizar a dessalinificação das amostras, evitando perda do material Cromatografia em Sephadex G-75 Essa cromatografia resultou em três picos protéicos, como mostra a figura 2, dos quais apenas o terceiro pico apresentou atividade hialuronidásica.

14 14 Absorbâncias a 280 nm Cromatografia da peçonha bruta de C.d.c. em Sephadex G-75 3,5 3 Pico 2 2,5 2 1,5 1 Pico 3 0,5 Pico Tubos P H Figura 2: Perfil da cromatográfico da peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus em coluna de gel filtração em Sephadex G-75, eluído em água, num fluxo de 20mL/hora, sendo coletadas 3mL de amostra em d b Diferentemente do fracionamento obtido nesse trabalho, utilizando a mesma resina para purificar a hialuronidase de Heloderma horridum, Tu e Hendon (1983) obtiveram seis picos, sendo que a referida enzima apareceu no terceiro pico. Já Girish et al. (2004) encontraram um perfil cromatográfico com três picos, porém a hialuronidase apareceu no primeiro pico. A figura 3 mostra um gel de poliacrilamida que permite vizualizar as proteínas fracionadas no pico que apresentou atividade hialuronidásica: Figura 3: PAGE SDS 12%: Em cada poço foram aplicados 10µg de proteína. Amostras: P corresponde ao padrão de peso molecular de proteínas da marca SIGMA e H corresponde à fração obtida na cromatografia da peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus em Sephadex G-75, que apresentou atividade. A banda denominada hyase corresponde à enzima estudada. Com esse gel, foi possível verificar que a resina Sephadex G-75 não separou muitas enzimas, pois se trata de uma cromatografia de gel filtração, de modo que algumas proteínas de baixa massa molecular encontram-se na mesma fração que a hialuronidase. Como já relatado anteriormente, Girish et al. (2004) também utilizaram o mesmo procedimento para purificar a hialuronidase de Naja naja, porém, a enzima foi eluída no início da cromatografia, sendo uma proteína de maior massa molecular. Entretanto, os

15 15 resultados do PAGE SDS apresentados por esses autores também apresentaram uma grande quantidade de proteínas eluídas junto com a hialuronidase em cromatografia Sephadex G-75, o que demonstra que os resultados aqui obtidos não diferem da literatura. Por conseguinte, para realizar um fracionamento mais eficiente dessas proteínas menores, o próximo passo escolhido foi uma cromatografia de troca iônica Cromatografia em CM-Sepharose C-25 A CM-Sepharose C-25 é uma resina catiônica que possui grupamentos fixos carregados negativamente, que são utilizados para separar proteínas básicas. Além disso também é uma resina de gel filtração. A hialuronidase foi eluída na linha de base, após todos os picos proteícos, evidenciando assim seu caráter básico em ph ácido. A figura 4 demonstra o perfil cromatográfico resultante do fracionamento da peçonha bruta nessa resina: Figura 4: Perfil da cromatográfico da peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus em coluna de troca iônica em CM-Sepharose C-25, eluído em acetato de amônio, num fluxo de 20mL/hora, sendo coletadas 3mL de amostra em cada tubo. Hyase é a fração com atividade hialuronidásica, representada por um círculo. Esta cromatografia resultou em dois picos proteícos eluídos em tampão acetato de amônio 0,05M, ph 5,5. Após a coleta de aproximadamente 350 ml de amostras eluídas nesse tampão, houve a troca do mesmo por step-wise para tampão acetato de amônio 0,5M, ph 4,0 e mais um pequeno pico foi eluído. Em seguida, após coletar aproximadamente 250 ml de amostra no segundo tampão, a hialuronidase foi eluída e as suas frações foram reunidas e liofilizadas. A tabela 2 apresenta a recuperação da hialuroniadase obtida nessa cromatografia. TABELA 2: Recuperação protéica da hialuronidase na cromatografia em CM-Sepharose Fast Flow.

16 16 Frações Amostra aplicada Recuperação (mg) Recuperação protéica (%) 115,2 Hyase 0, ,21 O PAGE SDS da amostra resultante dessa cromatografia está representado pela figura 5, de modo que pode-se evidenciar a presença de apenas um contaminante de na mesma fração em que a hialuronidase encontra-se. Esse contaminante possui baixo peso molecular, diferentemente da nossa enzima de interesse. Portanto, para separá-los uma cromatografia de gel filtração seria ideal. Todavia, devido ao baixo rendimento da hialuronidase, seria necessário utilizar uma quantidade muito grande de peçonha, o que é economicamente inviável. 2 1 Figura 3: PAGE SDS 12%: Foram aplicados 10µg de proteína correspondentes a fração com atividade hialuronidásica positiva eluídas na cromatografia em CM-Sepharose C- 25. O número 1 corresponde à hialuronidase e o 2 corresponde ao contaminante. Apesar do baixo grau de purificação em cromatografias de gel filtração, evidenciado nesse estudo e pela literatura, esse é o primeiro passo cromatográfico realizado pela maioria dos autores que purificaram a hialuronidase de diversas peçonhas (Kudo e Tu, 2001; Morey et al., 2006; Girish et al., 2004, Nagaraju et al., 2007;Tu e Hendon, 1983). Como segundo passo cromatográfico, alguns desses autores realizaram a CM Sepharose C-25 e obtiveram uma melhor separação entre a hialuronidase e as demais enzimas, como foi verificado também na peçonha de Crotalus durissus collilineatus. Entretanto, Pessini e colaboradores (2001) realizaram a purificação da hialuronidase do escorpião Tityus serrulatus por meio de duas cromatografias em CM-Cellulose-52. Ao contrário do resultado aqui verificado, a hialuronidase foi encontrada em um dos picos prótéicos, e não na linha de base. Por outro lado, a enzima também foi eluída no final do fracionamento, após aproximadamente 900 ml de coleta das frações. Similarmente à recuperação protéica de 0,21% que encontramos nesse fracionamento, Girish et al (2004)

17 17 obtiveram uma recuperação de 0,15% e 0,0135% de duas isoformas da hialuronidase da peçonha de Naja naja. Kudo etu (2001) utilizaram a mesma resina para o fracionamento e encontraram uma recuperação de 0,06%. Esses resultados demonstram que a hialuronidase é uma enzima pouco expressa em venenos, o que dificulta sua identificação por métodos tradicionais de purificação de proteínas. Por isso, nosso grupo de pesquisa já está realizando experimentos de Biologia Molecular que permitem a clonagem e a caracterização de tal enzima Letalidade Para testar a letalidade dasfrações, inicialmente foi determinada a DL 50 da peçonha bruta de Crotalus durissus collilineatus que foi de 0,25µg/g de animal. Apesar de a hialuronidase ter sido parcialmente purificada, testou-se a letalidade das frações com e sem atividade hialuronidásica, obtidas no fracionamento em CM-Sepharose C-25. Até a dose máxima testada que foi de 2,5µg/g de animal (10 DL50 da peçonha bruta), nenhuma das frações foi letal para os camundongos. Tal fato provavelmente ocorreu devido ao baixo ph utilizado na cromatografia, de modo que algumas toxinas fundamentais para o envenenamento crotálico podem ter degradado ou perdido sua função. Também observou-se que a hialuronidase não possui efeito letal. Podemos considerar ainda que a presença da hialuronidase é de extrema importância para a difusão das toxinas letais, visto que a enzima isolada não foi letal, assim como as frações das quais essa enzima foi separada. Nos últimos 50 anos, muito se pesquisou acerca da patogênese da isquemia e da nefrotoxicidade da falência renal aguda causadas pelos envenenamentos crotálicos, mas pouco se sabe ainda sobre a sua letalidade (Schrier, 2004), o que dificultou a discussão dos resultados analisados nas atividades de espalhamento da hialuronidase Atividade miotóxica indireta A atividade miotóxica foi analisada por dosagem de creatina quinase (CK) no plasma de camundongos 3 horas após a inoculação com peçonha bruta ou com as frações, quando ocorre o pico de liberação da enzima. Os valores da atividade de CK obtidos foram de 650

18 18 U/L, 325 U/L e 243 U/L para a peçonha bruta, frações sem atividade hialuronidásica e fração com atividade hialuronidásica, respectivamente. A atividade de CK obtida pelo grupo controle foi de 47 U/L. Assim, observou-se uma baixa atividade miotóxica para os dois tipos de frações testadas, podendo-se concluir que a hialuronidase não causa miotoxicidade, mas sua ausência pode provocar uma redução nessa atividade. Girish et al. (2004), Nagaraju et al. (2007) e Pessini et al. (2001) também observaram que apenas o grupo de animais que recebeu a peçonha bruta apresentou altos níveis séricos de CK Portanto, esses experimentos confirmaram a função da hialuronidase como fator de espalhamento de toxinas fundamentais no envenenamento Atividade miotóxica direta Utilizando-se apenas 10 µl de amostra (peçonha bruta e frações com e sem atividade hialuronidásica), não vizualizou-se necrose no músculo gastrocnêmio dos camundongos. 4. Conclusão A hialuronidase é uma enzima presente tanto em peçonhas crotálicas e botrópicas, sendo mais abundante, dentre as peçonhas testadas, em Crotalus durissus collilineatus. Essa enzima possui massa molecular aparente de 70 kda e corresponde a 0,21% dos componentes totais dessa peçonha. Além disso, a enzima contribui para o espalhamento de toxinas que atuam na letalidade e na miotoxicidade do envenenamento crotálico. Entretanto, apesar de seu efeito potencializado, essa é uma enzima expressa em poucas quantidades em tais peçonhas, de modo que técnicas de Biologia Molecular serão de extrema importância para uma melhor caracterização dessa enzima. 5.Referências Bibliográficas AMARAL, C.F.S.; REZENDE, N. A.; SILVA, O. A.; RIBEIRO, M. M. F.; MAGALHÄES, R. A.; REIS, R. J.; C., J. G.; C., J. R. S. Insuficiência renal aguda secundária a acidentes ofídicos botrópico e crotálico: Análise de 63 casos. Revista do Instituto Médico Tropical de São Paulo. v. 28, n 4, p ,1986. BOCHNER, R.; STRUCHINER, C. J. Epidemiologia dos acidentes ofídicos nos últimos 100 anos no Brasil: uma revisão. Caderno de Saúde Pública, v.19, n.1, p.7-16, 2003.

19 19 BOLDRINI-FRANÇA, J. ; ALVES, F. V. ; CASTANHEIRA, L. E. ; SANTOS, H. L. ; OTAVIANO, A. R. ; ARANTES, E. C. ; HAMAGUCHI, A. ; RODRIGUES, V. M. ; HOMSI-BRANDEBURGO, M. I. Characterization of Hyaluronidase Activity from Several Viperidae Snake Venoms and Parcial Isolation of Hyaluronidase from Crotalus durissus collilineatus Snake Venom. In: XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2007, Salvador. BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. v. 7, p , F. Isolation and characterization of an anticoagulant proteinase cerastase F-4, from Cerastes cerastes (Egyptian Sand Viper) venom. Thrombosis Research. Res. v.42, p , FERRANTE, N.D. Turbidimetric measurement of acid mucopolysaccharides and hyaluronidase activiy. Journal of Biological Chemistry. v. 220, p. 303, FISZER-SZAFARZ, B. Hyaluronidase polymorphism detected by polyacrylamide gel electrophoresis: Application to hyaluronidases from bacteria, slime molds, bee and snake venoms. Analytical Biochemistry v. 143, p , CARDOSO, J. L. C. Animais peçonhentos no Brasil: biologia clínica e terapêutica dos acidentes. São Paulo- SP: Sarvier, p. 468, CEVALLOS, M.A. NAVARRO-DUQUE C.; VARELA-JULIA, M.; ALAGON, A,C. Molecular mass determination and assay of venom hyaluronidases by sodium dodecyl sulfate-polycrylamide gel eletrophoresis. Toxicon. v. 30, nº.8, p , CHIPPAUX, J. P.; WILLINS, V.; WHITE, J. Snake venom variability: methods of study, results and interpretation. Toxicon. v.39, nº11, p FRASER, J.R.E.; APPELGREN, L.E.; LAURENT, T.C. Tissue uptake of circulanting hyaluronic acid. A whole body autoradiographic study. Cell and Tissue Research. v. 233, p , FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE. Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília: Fundação Nacional de Saúde, p. 131, GIRISH,K. S. ; JAGADEESHA, D. K. ; RAJEEV, K. B. ; KEMPARAJU, K. Snake venom hialuronidase: An evidence for isoforms and extracellular matrix degradation. Molecular and Cellular Biochemistry. v. 240, p , DAOUD, E.; TU,A. T.; EL-ASMAR, M.

20 20 GIRISH, K.S; SHASHIDHARAMURTHY, S.; NAGARAJU, T.V.; KEMPARAJU, K. Isolation and characterization of hyaluronidase a spreading factor from Indian cobra (Naja naja) venom. Biochimie. v.86, p GIRISH, K. S.; KEMPARAJU, K. Inhibition of Naja naja hyaluronidase: role in the management of poisonous bite. Life Sciences. v. 13, nº 78, p , HAWGOOD, B. J. Crotoxin, the phospsolipase A 2 neurotoxin from the venom of Crotalus durissus terrificus. Memórias do Instituto Butantan. v. 52, p , HOGE, A.R.; ROMANO, H.S. Sinopse das serpentes peçonhentas. Memórias do Instituto Butantan. v. 43, p , IWANAGA, S.; SUZUKI, T. In: Snake Venom (LEE, C.Y. ed.), p. 99.New York, Springer-Verlag KOMORI, Y.; HAGIHARA, S.; TU, A. T. Specificity of hemorrhagic proteinase from Crotalus atrox (Western diamondback rattlesnake) venom. Biochemisthy and Biophysics Acta, v.820, p KREIL, G. Hyaluronidases a group of neglected enzymes. Protein Science. v. 4, p , KUDO, K.; TU, A.T. Caracterization of hyaluronidase isolated from Agkistrodon contortrix contortrix (Southern copperhead) venom. Archives of Biochemistry and Biophysics. v.386, nº2, p LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins, during the annembly of the head of bacteriophage T4. Nature. v.227, p , MARKLAND, F. S.; DAMUS, P. S. Purification and properties of a enzyme from the venom of Crotalus adamanteus. Journal of Biological Chemistry, v.246, p MATRISIAN, L. M. The matrixdegrading metalloproteinases. BioEssays. V.14, p MENZEL, E.J.; FARR, C. Hyaluronidase and its substrate: biochemistry, biological activities and therapeutic uses. Cancer Letters. v.131, p. 3-11, MEYER, K. Hyaluronidases. In: The enzymes (BOYER P.D. ed.). p , 3ª edição, vol.v. New York: Academic Press., Ministério da Saúde Acidentes por animais peçonhentos. Disponível em: < sualizar_texto.cfm?idtxt=21924>. Acesso em: 15 mai.2007 MOREY, S.S.; KIRIAN, K.M.; GADAG, J.R. Purification and properties of hyaluronidase from Palameneus

21 21 gravimanus (Indian black scorpion) venom. Toxicon. v.47, p , NAGARAJU, S.; DEVARAJA, S.; KEMPARAJU, K. Purification and properties of hyaluroniadase from Hippasa partita (funnel web spider) venom gland extract. Toxicon. v. 50, p , OSHIMA-FRANCO, Y.; HYSLOP, S.; PRADO, J. F.; CRUZ M. A. H.; RODRIGUEZ L. S. Neutralizing capacity of antisera raised in horses and rabbits against Crotalus durissus terrificus (South-American rattlesnake) venom and its main toxin, crotoxin. Toxicon. v. 37, p , PESSINI, A.C.; TAKAO, T.T.; CAVALHEIRO, E.C.; VICHNEWSKI, W.; SAMPAIO, S.V.; GIGLIO, J.R.; ARANTES, E.C. A hyaluronidase from Tityus serrulatus scorpion venom: isolation, characterization and inhibition by flavonoids. Toxicon. v. 39, p , PINHO, F. M. O.and PEREIRA, I. D.(2001) Ofidismo. Revista da Associação Médica Brasileira. v. 47 nº 1, p PUKRITTAYAKAMEE, S.; WARRELL, D.A.; DESAKORN, V.; MCMICHAEL, A.J.; WHITE, N.J., BUNNAG, D. The hyaluronidase activities of some southeast asian snake venoms. Toxicon. v. 26, nº 7, p , RODRIGUES, V. M. Isolamento e caracterização química parciais de duas miotoxinas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis (jararaca pintada) Dissertação (Mestrado em Genética e Bioquímica) Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 96 p. SCHRIER, R.W. Acute renal failure: definitions, pathogenesis and therapy. Journal of Clinical Investigation. v. 114, p. 5-14, SELISTRE, H. S., GIGLIO, J. R. Isolation and characterization of a thrombin-like enzyme from the venom of the snake Bothrops insulares (jararaca ilhoa). Toxicon. 25, p v. 25, nº 11, p , STERN, R.; KOGAN, G; JEDRZEJAS, M.J.; SOLT, L. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnology Advances. v. 25, p , STOCKER, K.; BARLOW, G. H. The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom (bathroxobin). In: Methods in Enzymology 45 B: p. 214 (Lorand, L., Ed.) New York, Academic Press TU, A.T.; HENDON, R.R. Characterization of lizard venom hyaluronidase and evidence for its action as a spreading factor. Comparative Biochemistry and Physiology. 76B, p VITAL BRAZIL, O. Pharmacology of Crotamine. Memórias do Instituto

22 22 Butantan. v. 52, p. 23, WEIL, C.S. Tables for convenient calculation of median effective dose (LD50 or ED50) and instructions in their use. Biometrics. v.9, p. 249, 1952.