UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA

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1 UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA ADRIANO SILVIO DOS SANTOS EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS MUSCULARES C2C12 SUBMETIDAS À LESÃO POR MIOTOXINAS BTHTX - I E BTHTX - II ISOLADAS DO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu SÃO PAULO - SP 2015

2 II UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTU SENSU ADRIANO SILVIO DOS SANTOS EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS MUSCULARES C2C12 SUBMETIDAS À LESÃO POR MIOTOXINAS BTHTX - I E BTHTX - II ISOLADAS DO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu DISSERTAÇÃO APRESENTADA À UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO, PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM MEDICINA. PÓS-GRADUANDO: ADRIANO S. SANTOS ORIENTADORA: DRA. STELLA REGINA ZAMUNER SÃO PAULO - SP 2015

3 III FICHA CATALOGRÁFICA Santos, Adriano Silvio dos. Efeito do laser de baixa potência sobre células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu. / Adriano Silvio dos Santos f. Dissertação (mestrado) Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo, Orientador (a): Profa. Dra. Stella Regina Zamuner. 1. Células musculares. 2. Fosfolipase A2. 3. Laser. 4. Mionecrose. I. Zamuner, Stella Regina. II. Titulo CDU 616

4 IV

5 V Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes. (Isaac Newton). A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê. (Arthur Schopenhauer)

6 VI DEDICATÓRIA Dedico este estudo aos meus pais e minha família que sempre me apoiaram e me incentivaram para a realização deste trabalho.

7 VII AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela força e coragem que precisei para percorrer esta caminhada. Aos meus amados pais Maria Cleonice Ramos da Silva Santos e Joaquim Pereira dos Santos (in memórian) e toda a minha família que sempre estiveram ao meu lado, me apoiaram com palavras de incentivo e acreditaram no meu crescimento. Ao meu namorado Jhonny, pela paciência, compreensão, carinho e por toda a ajuda durante este tempo. À minha orientadora Profª Drª Stella Zamuner que acreditou no meu trabalho, me acolheu com muito carinho e respeito, sendo sempre paciente dedicada e disposta a me ensinar cada vez mais, se tornando um exemplo de profissional. À aluna de iniciação científica Aline, agradeço pela amizade, carinho e disponibilidade em ajudar para concretização deste trabalho.

8 VIII A meu professor de graduação Joelmir Lucena Veiga, que participou do meu crescimento acadêmico. A todos meus colegas de laboratório em especial Adilson, Gabriela, Lucas, Regiane, Mozânia, Otávio, Fábio, Zé, Marcelo, que sempre estiveram ao meu lado. À técnica de laboratório Ângela, que sempre esteve disposta a me ouvir nas horas difíceis, à Luciana e Samara que somaram para a concretização desse trabalho. À Profª Silvia Zamuner que esteve sempre disposta a colaborar para a realização deste trabalho e ao Prof Sthepen Hyslop pela doação das toxinas e Prof Ernesto Belizário pela doação das células C2C12. Aos professores do Programa de Mestrado em Medicina. À PROSUP/CAPES, pela bolsa de estudos.

9 IX À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro Processo: 2013/

10 X LISTA DE FIGURAS Figura 1: Distribuição dos acidentes ofídicos Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil Figura 2: Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil Figura 3: Serpente Bothrops jararacussu... 6 Figura 4: Irradiação das culturas de células Figura 5: Aparelho Laser de baixa potência Figura 6: Curva dose resposta Efeito da Bothropstoxina I sobre a viabilidade das células C2C Figura 7: Curva dose resposta Efeito da Bothropstoxina I sobre a integridade das células C2C Figura 8: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com Bothropstoxina I Figura 9: Efeito do Laser de baixa potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com Bothropstoxina I Figura 10: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com Bothropstoxina II Figura 11: Efeito do Laser de baixa potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com Bothropstoxina II... 37

11 XI Figura 12: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na liberação da enzima lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por Bothropstoxina I Figura 13: Efeito do Laser de baixa potência 830 nm na liberação da enzima lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por Bothropstoxina I Figura 14: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na liberação da enzima lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por Bothropstoxina II Figura 15: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na liberação da enzima lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por Bothropstoxina II LISTA DE TABELAS Tabela 1: Grupos experimentais e aplicabilidade Tabela 2: Parâmetros do Laser 685 nm Tabela 3: Parâmetros do Laser 830 nm

12 XII LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AsGa Arseneto de Gálio ATP Adenosina trifosfato BthTX - I Bothropstoxina I BthTX - II Bothropstoxina II DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco DNA Ácido desoxirribonucleico InGaAlP Índio Gálio Alumínio Fósforo J/cm 2 Joules por centímetro ao quadrado LBP Laser de baixa potência ml mililitros MTT - (Brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol 2il 2,5- difenil tetrazol) nm nanômetros PBS NaCl 140mM; KCL 2,5mM; Na 2 HPO 4 8mM; KH 2 PO 1,4mM; ph 7,4 FLA 2 Fosfolipases A 2 rpm Rotações por minuto SFB Soro fetal bovino

13 XIII TLBP Terapia Laser de Baixa Potência VBj Veneno da serpente B. jararacussu µl microlitros λ Comprimento de onda

14 Índice 1. INTRODUÇÃO Serpentes da fauna brasileira Epidemiologia Bothrops jararacussu Considerações gerais sobre fosfolipase A 2 (FLA 2 ) Soroterapia Terapia com laser de baixa potência Laser e ofidismo Laser e cultura de células OBJETIVO Geral Específicos MATERIAL E MÉTODOS Miotoxinas Células C2C12 musculares Cultivo Celular Condições de tratamento Preparação de monocamadas de células musculares para ensaios com as toxinas Ensaio para a avaliação da viabilidade da monocamada de células musculares Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células musculares Irradiação laser de baixa intensidade Análise do LBP sobre a integridade da monocamada de células musculares após incubação com a BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de B. jararacussu Análise do LBP sobre a citotoxicidade induzida pela BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de B. jararacussu em células musculares Ensaio da viabilidade celular MTT (brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol 2il 2,5- difenil tetrazol) Ensaio da atividade enzimática da lactato desidrogenase (LDH) Análise Estatística RESULTADOS Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a viabilidade das células C2C Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a integridade das células C2C Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - I Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - I Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - II Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - II

15 4.7 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE... 69

16 RESUMO O veneno das serpentes do gênero Bothrops induz uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por dor, formação de edema, migração leucocitária, podendo ser acompanhada por necrose tecidual. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende às manifestações locais, sendo assim necessário o uso de outro recurso terapêutico para o controle dessa manifestação. A laserterapia de baixa potência (LBP) é uma alternativa de tratamento em situações de lesão muscular, devido a seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antinflamatórios e cicatrizantes. Em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, verificou-se que o LBP foi capaz de aumentar a viabilidade de células musculares C2C12, após a adição do veneno de B. jararacussu e que esse efeito do LBP é relacionado a uma proteção da membrana celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBP em células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas (BthTX - I e BthTX - II) isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu quanto a: viabilidade, descolamento celular e liberação da enzima LDH. As células receberam a BthTX I e BthTX II na dose 75 μg/ml e foram imediatamente irradiadas com LBP Índio Gálio Alumínio Fósforo e Arseneto de Gálio Alumínio, nos comprimentos de onda (λ) 685 nm vermelho e 830 nm infra-vermelho, de forma pontual, tempo de aplicação de 13 s e 35 s respectivamente e as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Os resultados demonstraram que a BthTX - I e BthTX - II afetou a viabilidade celular de forma dose-dependente, sendo escolhida a dose 75 μg/ml para a realização dos experimentos com o LBP, porém não foi capaz de causar alterações na integridade. O LBP causou aumento significativo na viabilidade celular, em todos os tempos analisados no λ 685 nm e 830 nm frente à BthTX - I, entretanto o LBP no λ 685 nm e λ 830 frente a BthTX - II foi efetivo somente no tempo de 15 e 60. O LBP não foi capaz de diminuir a liberação de LDH em todos os tempos analisados e com os dois λ utilizados. Desta forma, verificou-se que o LBP foi capaz de proteger as células musculares C2C12 contra o efeito miotóxico das miotoxinas isoladas do veneno B. jararacussu e que esta proteção está relacionada ao efeito protetor a nível mitocondrial. Ainda, os resultados obtidos sugerem que o LBP pode ser considerado uma ferramenta terapêutica eficaz em pacientes picados por serpentes. Palavras chave: células musculares, fosfolipase A 2, laser, mionecrose, miotoxina.

17 ABSTRACT Snakes venom of the Bothrops species induces a local inflammatory reaction, characterized by pain, edema, leukocyte migration and can be accompanied by tissue necrosis. The use of antivenom performs the function of neutralizing the greatest possible amount of circulating venom, thus minimizing its systemic effects, but its action does not extend to local manifestations, and thus require the use of another therapeutic option to control this reaction. The low level laser therapy (LLLT) is used as an alternative treatment in cases of muscle injury due to its biological effects, such as analgesics, anitinflamatory and healing. In a previous study of our lab it was found that LBP can enhance the viability of C2C12 muscle cells after the addition of B. jararacussu venom in the medium and that this effect of LBP is related to protection of the cell membrane. In the present study we analyzed the effect of LBP in the cell monolayer integrity, viability of muscle cells, exposed to injury by myotoxins BthTX - I - and BthTX - II isolated from Bothrops jararacussu venom. Cells received BthTX I (75 μg / ml) and were immediately irradiated with LLLT Aluminum Indium Gallium Phosphate and Aluminium Gallium Arsenide, the wavelengths (λ) 685nm and 830 nm, power density 4 J/cm2, 100mW of power, total energy 1,3 J, application time of 13 and 35 seconds per point and the cells were incubated for 15, 30 and 60 minutes. The results demonstrated that BthTX I affect cell viability in a dose dependent manner, but did not change cell integrity. The concentration of 75 μg/ml was chosen for the experiments with LBP. LLLT caused an significant increase in cell viability in all the analyzed period of time and in the λ 685 nm and 830 nm against Bothrops I toxin, however in the LBP λ 685 nm against Bothrops toxin II was effective only at 15 min, while the LBP at λ 830 was effective at 15 and 60 min. The LLLT was not able to change the LDH release at all times and wavelength used. Thus, LBP was able to protect C2C12 muscle cells against the miotoxic effect of isolated myotoxins isolated from B. jararacussu venom. Therefore, the results suggest that LLLT can be considered an effective therapeutic tool in patients bitten by snakes. Keys Word: laser muscle cells, phospholipase A 2, myonecrosis, myotoxin.

18 1 Introdução

19 2 1. INTRODUÇÃO Os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem, ainda, um problema de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo e fazem parte da lista de doenças negligenciadas, da Organização Mundial de Saúde (OMS) (GUITIÉRREZ et al., 2010; WHO WORLD, HEALTH ORGANIZATION, 2013). De acordo com a OMS (2010), ocorreram cerca de acidentes ofídicos no mundo, com número de mortes/ano entre e No entanto, o número de indivíduos com sequelas permanentes, decorrentes desses acidentes, foi mais elevado que o número de mortes (GRACIANO et al., 2013). Esses acidentes acontecem, geralmente, com trabalhadores rurais, em locais de difícil acesso e frequentemente distantes de centros de saúde capacitados a realizar o atendimento necessário. A demora no atendimento resulta em agravamento do quadro, que pode levar à amputação do membro afetado e, consequentemente, à incapacitação do indivíduo (KASTURIRATNE et al., 2008; WARREL, 2010; STONE et al., 2013). 1.1 Serpentes da fauna brasileira As serpentes pertencem à classe Reptilia, Ordem Squamata e Subordem Ophidia. Estão distribuídas em 23 famílias, 511 gêneros e espécies. No Brasil, temos representantes de 9 famílias, 72 gêneros e 321 espécies, ou seja, cerca de 10% do total das espécies (FRANCO, 2009). Dentre as espécies encontradas no Brasil destacam-se, pela importância médica, as pertencentes às famílias: Elapidae que tem como único gênero desta família no Brasil o Micrurus, cujas espécies são conhecidas como corais; a família Viperidae que engloba a subfamília Crotalinae (pitvipers), que agrupa os gêneros Lachesis, Crotalus, Bothriopsis, Bothrocophias e Bothrops (MELGAREJO, 2009). No gênero Crotalus as espécies são conhecidas popularmente por cascavel, cascavel-quatro-ventas, boicininga, maracambóia, maracá e outras denominações populares; gênero Lachesis (surucucu, surucucupico-de-jaca, surucutinga, malha-de-fogo) e gênero Bothrops, Bothriopsis e Bothrocophias (jararaca, ouricana, jararacuçu, urutu-cruzeira, jararaca-do-rabo-

20 3 branco, malha-de-sapo, patrona, surucucurana, comboia, caiçara, e outras denominações), sendo que esse gênero compreende cerca de 30 espécies, distribuídas por todo o território nacional (Ministério da Saúde, 2001). 1.2 Epidemiologia O número exato de mortes e a incidência por picadas de serpentes, ao redor do mundo, são desconhecidos. Dados da literatura demonstram que as serpentes responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos, na América Latina, pertencem a família Viperidae e aos gêneros Bothrops, Bothriopsis, Bothrocophias e Rhinocerophis, assim denominados de acordo com a proposta taxonômica de FENWICK et al., (2009). No Brasil, aproximadamente 90% dos acidentes ofídicos são provocados por serpentes desses gêneros (fig. 1), sendo também consideradas as mais agressivas (BARREIRA, 1993). Os acidentes causados pelas serpentes do gênero Bothrops não apresentam alta letalidade (0,31%), porém devido à alta incidência, são consideradas de grande importância epidemiológica no país (Manual de diagnóstico e tratamentos de acidentes por animais peçonhentos, 1999) (fig. 2). A epidemiologia dos acidentes ofídicos revela um perfil de vítimas do sexo masculino (70%), atingidos, sobretudo, nos membros inferiores. Estes acidentes, em geral, estão relacionados a fatores climáticos e aumento da atividade humana no campo (Ministério da Saúde, 2001).

21 4 Figura 1: Fonte: Manual de Diagnóstico e Tratamento de Acidentes por Animais Peçonhetos Ministério da Saúde Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) Outubro/2001. Figura 2 Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil.

22 5 Os efeitos causados pelo envenenamento das serpentes do complexo Bothrops, ao serem injetados no organismo das vítimas, induzem um quadro fisiopatológico comum, que podem ser classificados clinicamente de acordo com a presença de manifestações sistêmicas e locais. As manifestações sistêmicas são caracterizadas por náuseas, vômitos, sudorese, hemorragia, hipotensão arterial, insuficiência renal e ocasionamalmente choque, além de manifestações locais como dor, edema de instalação precoce e caráter progressivo, equimoses, hemorragia, hipóxia, podendo ser acompanhada por necrose tecidual (DOIN-SILVA et al., 2009; MILANI JUNIOR et al., 1997; CARNEIRO et al., 2002; LU et al., 2005; YAMASHITA et al., 2011). A mionecrose local é uma consequência comum nos envenenamentos causados pelas serpentes do complexo Bothrops. A literatura indica que a mionecrose é causada por uma família de proteínas denominadas miotoxinas, componentes dos venenos botrópicos, as quais possuem características de fosfolipases A2 (PLA2) e atuam diretamente sobre a membrana da célula muscular, por se ligarem e alterarem a membrana plasmática (GUTIÉRREZ et al., 1984). Essas miotoxinas induzem dano tecidual proeminente, de forma que, as alterações morfológicas são observadas a partir de 15 minutos de sua injeção (GUTIÉRREZ, J. M., LOMONTE, B. 1995). A miotoxicidade pode, ainda, ser consequência da isquemia causada por obstrução dos vasos da microcirculação e de artérias intramusculares (GUTIÉRREZ et al., 1984). 1.3 Bothrops jararacussu A Bothrops jararacussu (fig. 3) é uma serpente de grande porte, podendo atingir até 2,20 m de comprimento. Diferencia-se das jararacas comuns pelo porte padrão de desenho em seu corpo e por possuir uma cabeça negra, Há um acentuado dimorfismo sexual entre fêmeas e machos, sendo que as fêmeas são marcadamente amarelas e pretas, enquanto que os machos são marrons e pretos, além de serem menores e mais delgados. Estas serpentes apresentam hábito noturno ou crepuscular. Geralmente são encontradas em florestas tropicais, bancos de rios e pântanos (MILANI JUNIOR et al., 1997).

23 6 Figura 3: Bothrops jararacussu Fonte: As serpentes Bothrops jararacussu causam 0,8 a 10% dos acidentes ofídicos registrados no Brasil (MILANI JUNIOR et al., 1997). Os estudos experimentais mostram que esse veneno causa necrose muscular seguido de alterações vasculares e trombose. Além disso, a recuperação da fibra muscular se dá de forma deficiente, resultando em sequela (SANCHEZ et al., 1992). Ainda, o envenenamento causado por esta serpente tem grande mortalidade quando comparada com outras serpentes do mesmo gênero (HOMSI-BRANDERBURGO et al., 1988), sendo que o grande nível de letalidade atribuída aos 25% de miotoxinas e fosfolipase A 2 encontradas neste veneno (GUTIÉRREZ, LOMONTE, 1995). 1.4 Considerações gerais sobre fosfolipase A 2 (FLA 2 ) As FLA 2 pertencem a uma superfamília de enzimas lipolíticas, que possuem baixo peso molecular (13-18 KDa), e catalisam a ligação sn-2 de fosfolipídeos de membrana celulares, gerando ácidos graxos livres, tais como o ácido araquidônico (AA), o ácido oleico (AO) e lisofosfolipídeos, como o liso-paf (DENNIS, 1994; VALENTIN; LAMBEAU, 2000). Esta reação, de modo geral, depende de Ca ++, para ativação do sítio catalítico. As fosfolipases secretadas (FLA 2 s) são enzimas abundantes na natureza e estão presentes tanto em fluidos e tecidos de mamíferos

24 7 quanto em venenos de serpentes, abelhas e vespas (MURAKAMI; KUDO, 2002). As FLA 2 s de mamíferos desempenham importantes funções em vários processos biológicos, como a remodelagem de membranas biológicas e a síntese de segundos mensageiros lipídicos, que exercem importantes ações biológicas e participam da transdução de sinais intracelulares. Em condições patológicas, estas enzimas contribuem para o processo mionecrótico (VALENTIN; LAMBEAU, 2000, MURAKAMI et al., 2011). Venenos viperídicos e crotalídicos contém FLA 2 s com a habilidade de causar rápida necrose das fibras do músculo esquelético (FLA 2 s miotóxicas) (HARRIS; CULLEN, 1990). Em adição ao seu papel catalítico primário, as PLA 2 s dos venenos de serpentes mostram ainda outros importantes efeitos toxicos/farmacológicos, incluindo mionecrose, neurotoxicidade, cardiotoxicidade e hemolítico, hemorrágico, hipotensivo, anticoagulante, inibição da agregação plaquetária e indução da atividade edematogênica (HARRIS; CULLEN, 1990; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1997; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000). Algumas destas atividades são correlacionadas com a atividade enzimática, mas outras são completamente independentes (KINI, R. M.; EVANS, H. J., 1989; SOARES, A. M.; GIGLIO, J. R. 2004a). Devido à capacidade dessas FLA 2 promoverem a liberação do ácido araquidônico, que é o substrato para a biossíntese de vários mediadores lipídicos da inflamação, como prostaglandinas e leucotrienos, muito interesse se tem demonstrado, no estudo dessa família de enzimas, pois, os derivados do ácido araquidônico e o fator ativador de plaquetas (PAF), além de mediadores de fenômenos fisiológicos estão envolvidos em vários processos inflamatórios (FLAMAND et al., 2006; REID, 2005). Em venenos de serpentes do complexo Bothrops, as ações preponderantes das PLA 2 s estão relacionados às atividades miotóxicas (GUTIÉRREZ, J.M.; E. CERDAS, 1984). É interessante notar que as miotoxinas isoladas de venenos botrópicos, à semelhança da grande maioria das PLA 2 de venenos, apresentam uma grande homologia sequencial e estrutural entre si. Essa característica, no entanto, não é suficiente para determinar atividades catalíticas e biológicas semelhantes. Assim, um importante grupo de FLA 2 miotóxicas, contendo aspartato na posição 49 (Asp 49), apresenta alta atividade catalítica, como as miotoxinas de Bothrops atrox, Bothrops godmani e a MT-III de Bothrops asper. No entanto, outras FLA 2 homólogas, com baixa ou nenhuma atividade catalítica, mantêm potente

25 8 atividade miotóxica. Como exemplo, cita-se a MT-II do veneno de Bothrops asper, a BthTX - I de Bothrops jararacussu, a PrTX-I de Bothrops pirajai, a MjTX-I da Bothrops moojeni e a BnSP-7 da Bothrops neuwiedi pauloensis, que contêm uma molécula de lisina na posição 49 (Lys 49) (HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; para revisão vide GUTIÉRREZ, J. M., LOMONTE, B. 1995; CANDURI et al., 1998; SOARES et al., 2000a; 2000b). A substituição do resíduo Asp por Lys, na posição 49, afeta drasticamente a capacidade de ligação destas proteínas ao íon cálcio, cofator essencial para a estabilização do intermediário tetraédrico, no mecanismo catalítico (VAN DEN BERGH et al., 1988; SCOTT et al., 1990). A despeito da baixa atividade enzimática, as FLA 2 -Lys 49 homólogas mantêm a habilidade de lesar membranas biológicas e sintéticas por um mecanismo pouco conhecido e independente de cálcio (GUTIÉRREZ et al., 1989). Foram purificadas, do veneno de B. jararacussu, as miotoxinas BthTX - I e BthTX - II (HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). A BthTX - I é uma PLA 2 Lys49, uma proteína dimérica miotóxica, e pode ser considerada um modelo molecular que apresenta desafios, porque possui miotoxicidade elevada e, no entanto, apresenta pouca ou nenhuma atividade FLA 2 (GUTIÉRREZ; OWNBY, 2003). Danifica a membrana através de um mecanismo cálcio-independente, capaz de induzir uma severa mionecrose (FLETCHER et al., 1996; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). Além da mionecrose, a BthTX - I causa diversos efeitos farmacológicos que incluem o edema, degranulação do mastócito, o bloqueio irreversível da contração do músculo (in vitro), interrupção de lipossoma e citotoxidade em células endoteliais (ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000; HOMSI- BRANDEBURGO et al., 1988; LANDUCCI et al., 1998). A BthTX - II é uma Asp49 com estrutura homóloga ao da Lys49. Segundo CORRÊA et al., (2008), a BthTX - II tem ação de uma Asp49 (desempenhando sua atividade catalítica) e de uma Lys49 (sendo miotóxica e citotóxica) e ainda, mostra efeitos edematogênico e hemolítico (GUTIÉRREZ et al., 1991; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). Foi demonstrado também que a BthTX - II induz agregação plaquetária (GUTIÉRREZ et al., 1991).

26 9 1.5 Soroterapia A soroterapia é, ainda, o único método de eficácia comprovada no tratamento dos acidentados por picadas de serpentes venenosas, desde que administrada em tempo, dose e via adequados (RUCAVANO; LOMONTE, 1996). Porém, apesar da eficácia da neutralização dos efeitos sistêmicos, este tratamento contribui pouco para a melhoria do quadro local, resultando em aparecimento de sequelas graves e perda tecidual. Neste sentido, a efetividade da soroterapia em prevenir o dano tecidual local é limitada, pela rápida ação das miotoxinas comparada com a distribuição lenta de anticorpos (RUCAVANO; LOMONTE, 1996). A patogênese da mionecrose é complexa e envolve as ações combinadas de uma variedade de componentes, tais como miotoxinas e metaloproteinases (QUEIROZ; PETTA 1984; SANCHEZ et al., 1992; HOMSI et al., 1988; CINTRA et al., 1993; RODRIGUES et al., 2004; VAN DEN BERGH et al., 1988). A administração de antivenenos (AV) que consistem em moléculas inteiras de IgG (~150 kda), ou fragmentos fab F(ab ) 2 (LALOO; THEAKSTON, 2003; THEAKSTON; GUTIÉRREZ et al., 2009.), constitui o tratamento específico para picada de serpente Os estudos experimentais têm sugerido que existe uma significante, embora parcial, neutralização da hemorragia, edema e mionecrose apenas quando o AV é administrado rapidamente após o envenenamento (CAMEY et al., 2002). Neste sentido, CAMEY et al., 2002, estudaram o efeito farmacológico do veneno de cinco espécies botrópicas brasileiras em relação à sua letalidade, atividade hemorrágica, necrosante, proteolítica da fosfolipase, coagulante e fibrinolítica. Os resultados indicaram que o antiveneno foi efetivo na neutralização sistêmica da atividade tóxica de todos os venenos testados. Porém, os efeitos locais não são neutralizados pelo uso de antiveneno e os mecanismos envolvidos nesta falta de proteção, até o momento, não foram esclarecidos. Várias substâncias alternativas têm sido pesquisadas com a finalidade de diminuir a miotoxicidade de venenos botrópicos (MELO et al., 1993; MELO; OWNBY, 1999; MELO; KURTZ, 1988), em razão da baixa eficácia da soroterapia contra a manifestação miotóxica no local da picada. Entretanto, qualquer que seja a abordagem terapêutica até hoje disponível, esta tem se mostrado ineficaz na neutralização dos efeitos locais produzidos pelo veneno botrópico, os quais são de

27 10 evolução rápida e intensa. Por esses motivos a procura por abordagens alternativas às usualmente empregadas tem sido motivo de interesse e se constituem em medidas extremamente relevantes para neutralização e/ou diminuição dos efeitos degenerativos, bem como a aceleração do processo regenerativo. Portanto, avanços no tratamento desta patologia localizada devem ser alcançados para elucidar os componentes de veneno envolvidos em sua gênese e a base molecular do seu mecanismo de ação. Pelo exposto acima, no Brasil, tem sido crescente o interesse em investigar terapias coadjuvantes à soroterapia já existente. Uma possibilidade que poderá ser empregada é a laserterapia. 1.6 Terapia com laser de baixa potência A palavra laser é uma sigla que corresponde Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, a qual significa Amplificação da Luz por Emissão Estimulada por Radiação. A ação do laser consiste na absorção da luz pelos tecidos, resultando em modificações no metabolismo celular. Quando o laser é aplicado nos tecidos, a luz é absorvida por fotorreceptores localizados nas células, sendo capaz de modular as reações bioquímicas específicas dentro da célula e estimular uma série de reações em cadeia na mitocondria, resultando em síntese de ATP (RENNÓ et al., 2011; STEIN et al., 2005; NAKANO et al., 2009). A laserterapia tem sido muito utilizada nas últimas décadas, inclusive nas áreas médicas e paramédicas, iniciando a ação ou a estimulação bioquímica, fisiológica ou atividade proliferativa das células e tecidos. Assim, a aplicação do laser de baixa potência (LBP) tem como finalidade restabelecer o equilíbrio biológico celular melhorando as condições de vitalidade tecidual (DORTBUDAK, 2000). A irradiação do LBP estimula a proliferação de células satélites musculares, a angiogênese e a expressão de fatores de crescimento, desempenhando, assim, uma função importante na regeneração muscular (PETRI et al., 2010).

28 Laser e ofidismo Existem alguns estudos sobre o LBP na avaliação do efeito local causado por veneno ofídico. DOURADO et al., 2003, demonstraram que o LBP aplicado no músculo gastrocnêmio de camundongos, após injeção do veneno de B. Moojeni, diminuiu consideravelmente a mionecrose, inibindo a habilidade do veneno de desfazer a integridade da membrana plasmática. Estudos realizados por nosso grupo demonstram que o tratamento com o LBP e Light emmition Diode (LED) aplicados 30 min e 3 h após a injeção em pata de camundongos de veneno de B. jararacussu e por duas miotoxinas isolada deste veneno foram efetivos na redução do edema, influxo leucocitáio, hemorragia e hiperalgesia (GUIMARÃES-SOUZA et al., 2011; BARBOSA et al., 2010). Em outros estudos in vivo, demonstrou-se a eficácia do laser na resposta inflamatória (BARBOSA et al., 2009) e mionecrose (DOIN-SILVA et al., 2009) local, induzida por venenos botrópicos. Ainda, estudos do nosso grupo demonstraram uma diminuição na mionecrose local em pata de camundongos induzida pelo veneno de B. jararacussu e duas miotoxinas isoladas deste veneno a BthTX - I e BthTX - II, sugerindo que o uso do LBP seja uma abordagem terapêutica local eficaz em casos de envenenamento botrópico (BARBOSA et al., 2010; ALGHAMDI et al.; 2012). No entanto, não existem estudos adicionais na literatura mostrando o efeito do LBP em células isoladas após lesão com venenos botrópicos, bem como o mecanismo de ação do LBP na redução dos efeitos locais. 1.8 Laser e cultura de células A literatura demonstra que o LBP em cultura de células causa um aumento no número de células, síntese de DNA e RNA e aumento na taxa de ATP em célulastronco e em outras linhagens celulares (PETRI et al., 2010). A aplicação do LBP Arseneto de Gálio Alumínio em osteoblastos cultivados em disco de titânio, utilizando o comprimento de onda de 780 nm e dose de 3 J/cm 2, demonstrou estimular a diferenciação osteoblástica (EDUARDO et al., 2007). O uso desta técnica terapêutica demonstrou ser também eficaz no crescimento de células

29 12 epiteliais de rim de macaco cultivado em situação de carência nutricional (2% de SFB), quando aplicadas irradiações repetidas de LBP (HAWKINS; ABRAHAMSE, 2006). No entanto, determinar parâmetros como comprimento de onda, densidade de energia, potência e tempo de aplicação do laser é importante para se obter uma resposta celular adequada ao tratamento. Hawkins & Abrahamse (2006), relataram que a aplicação do LBP utilizando baixas densidade de energia, como dose única de 5,0 J/cm 2 ou duas exposições de 2,5 J/cm 2 apresentou um efeito estimulante na resposta celular de fibroblastos feridos, resultando no aumento de migração celular, viabilidade e proliferação celular e atividade de ATP. Apesar do efeito do LBP ser estudado em vários tipos celulares e em várias patologias, não existem estudos na literatura mostrando o efeito do laser de baixa potência em células isoladas após lesão com venenos botrópicos. Dados do nosso laboratório mostraram que o LBP é capaz de proteger a membrana de células musculares C2C12 após incubação com o veneno bruto de B. jararacussu (dados enviados a publicação). Assim sendo, este estudo pretende avaliar a ação do LBP sobre células C2C12 após incubação com as miotoxinas BthTX - I e BthTX - II, isoladas do veneno de B. jararacussu.

30 13 Objetivo

31 14 2 OBJETIVO 2.1 Geral Analisar as ações do LBP 685 nm e 830 nm sobre células musculares C2C12 submetidas à lesão pelas miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. 2.2 Específicos Através de ensaios in vitro, foram avaliados os efeitos da irradiação LBP 685 nm e 830 nm sobre células musculares C2C12, após lesão com as miotoxinas BthTX - I e BthTX - II, quanto: I II III à viabilidade das células à integridade das monocamadas aos marcadores de lesão celular (LDH)

32 15 MATERIAL E MÉTODOS

33 16 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Miotoxinas Foram utilizadas as miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Sthepen Hyslop, do Departamento de Farmacologia, FCM, UNICAMP, Campinas-SP. As miotoxinas foram mantidas a - 20 o C até o momento de sua utilização. 3.2 Células C2C12 musculares As células, provenientes da linhagem de mioblastos C2C12, foram gentilmente doadas pelo professor José Ernesto Belizário, do Instituto de Ciências Biomédicas - USP/SP. As células foram cultivadas no meio de cultura de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 1% de solução antibióticaantimicótica (Cultilab). 3.3 Cultivo Celular Os mioblastos foram mantidos em estufa (HEPA class 3110, Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, EUA) a 37 C, numa atmosfera úmida contendo 5% de CO 2. O monitoramento do crescimento celular foi realizado a cada 24 horas, utilizando-se microscópio invertido de fase (Eclipse TE 2000U, Nikon, Melville, NY, EUA). O subcultivo foi realizado quando a monocamada celular se torna subconfluente para a perpetuação da linhagem celular, sempre em fluxo laminar (Linha 400, Pachane, Piracicaba, SP, Brasil). Para tanto, o sobrenadante foi removido, as células lavadas 1X com tampão PBS (NaCl 140mM; KCl 2,5mM; Na 2 HPO 4 8mM; KH 2 PO 4 1,4mM; ph 7,4) e tratadas com solução de tripsina 0,25% durante 3 minutos a 37 C. Após a incubação, foi realizada nova lavagem com meio, centrifugação a 1200 rpm a 20 C por 5 minutos (Centrífuga Excelsa 4-280R, Fanem,

34 17 São Paulo, SP, Brasil) e posteriormente a ressuspensão em 1mL de meio DMEM. A viabilidade das células foi avaliada por contagem com corante vital azul de Trypan (0,4%) e foram utilizadas nos ensaios as culturas com viabilidade maior que 95%. 3.4 Condições de tratamento Os experimentos foram realizados em um ambiente com obscuridade parcial para não sofrer interferência da luz externa. A cultura de células musculares C2C12 foi dividida em dez grupos, conforme tabela abaixo: Tabela 01- Grupos experimentais e aplicabilidade NOME GRUPOS CELULARES TRATAMENTO Grupo 1 Controle Células + meio de cultura DMEM Grupo 2 Células + LBP Células + 685nm Grupo 3 Células + LBP Células + 830nm Grupo 4 Veneno Células + Veneno VBj Grupo 5 Toxina Células + BthTX I Grupo 6 Toxina Células + BthTX - II Grupo 7 Grupo 8 Grupo 9 Grupo 10 Células + BthTX I + Laser Células + BthTX - I + Laser Células + BthTX II + Laser Células + BthTX - II + Laser Células + BthTX - I - tratadas com laser 685nm Células + BthTX - I - tratadas com laser 830nm Células + BthTX II - tratadas com laser 685nm Células + BthTX - II - tratadas com laser 830nm A cultura foi irradiada imediatamente após a adição das toxinas e foi aplicada, em cada poço, de forma pontual inferior, de modo a atingir a monocamada de células musculares, conforme a figura 4:

35 18 Figura 4: Irradiação das culturas de células 3.5 Preparação de monocamadas de células musculares para ensaios com as toxinas A partir das culturas celulares obtidas como descrito no item 3.3, foram feitas as diluições necessárias para a semeadura das células em placas de 96 poços ou lamínulas de vidro. Assim, 1x10 4 células/poço foram semeadas em placas de 96 poços e colocadas em estufa numa atmosfera úmida contendo 5% de CO 2, a 37ºC, por 24 horas. Após esse período as células foram incubadas com BthTX I e BthTX - II, diluídas em meio DMEM, nas concentrações de 10, 25, 50 ou 75 μg/ml, ou meio de cultura (controle negativo) ou veneno de B. jararacussu na concentração de 25 μg/ml (controle positivo) e incubadas por 15, 30 e 60 minutos. 3.6 Ensaio para a avaliação da viabilidade da monocamada de células musculares O ensaio de viabilidade celular foi realizado pelo método MTT. Após cada período de incubação, como descrito no item 3.4 o sobrenadante das culturas foi

36 19 removido e as células foram lavadas 1X com 100 μl de PBS. Em seguida, adicionado 50 μl de MTT (brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol 2il 2,5- difenil tetrazol) e incubadas por 3 horas a 37ºC. Terminado o tempo de incubação foi adicionado 100 μl de isopropanol para ressuspender e solubilizar o precipitado. Por fim, foi realizada a leitura da absorbância a 620 nm com auxílio de um leitor de Elisa (2020, Anthos, Eugendorf, Áustria). 3.7 Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células musculares Após cada período de incubação, como descrito no item 3.4, os sobrenadantes das culturas foram removidos e as células foram lavadas 1X com 100 μl PBS. Em seguida, foram adicionados 40 μl de cristal violeta (0,5%) em ácido acético (30%) por poço. Decorridos 15 minutos, as placas foram lavadas e colocadas para secar. A seguir, 100 μl de metanol absoluto (MERCK) foram adicionados em cada poço e a leitura da densidade óptica (D.O.) realizada em leitor de ELISA a 620 nm. A lesão causada foi definida como a porcentagem de diminuição da D.O, observada na monocamada submetida à ação do veneno em estudo, em relação à monocamada controle.

37 Irradiação laser de baixa intensidade parametros: Foi utilizado o Laser da marca DMC modelo Thera Lase, com os seguintes Tabela 2: Parametros do Laser da marca DMC modelo Thera Lase Aparelho Comprimento de onda Laser DMC Lase 685 nm modelo Thera Densidade de energia 4.0 J/cm 2 Energia total Potência Densidade de potência Área irradiada 1.3 J 35 mw 1.4 W/cm² 0,3 cm² Área do feixe com espaçador 0,28 cm 2 Modo de aplicação Tempo de aplicação Pontual 35 s Tabela 3: Parametros do Laser da marca DMC modelo Thera Lase Aparelho Comprimento de onda Laser DMC Lase 830 nm modelo Thera Densidade de energia 4.0 J/cm 2 Energia total Potência Densidade de potência Área irradiada 1.3 J 100 mw 0.33 W/cm² 0.3 cm² Área do feixe com espaçador 0,28 cm 2 Modo de aplicação Tempo de aplicação Pontual 13 s

38 21 Figura 5: Aparelho Laser da marca DMC modelo Thera Lase 3.9 Análise do LBP sobre a integridade da monocamada de células musculares após incubação com a BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de B. jararacussu. As células C2C12 foram plaqueadas 1x10 4 células por poço em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período as células receberam as toxinas na concentração de 75 μg/ml, ou meio de cultura (controle) e imediatamente foram irradiadas com laser, em seguida as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos e o ensaio para a avaliação da integridade da monocamada foi realizado conforme descrito no item 3.6.

39 Análise do LBP sobre a citotoxicidade induzida pela BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de B. jararacussu em células musculares Ensaio da viabilidade celular MTT (brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol 2il 2,5- difenil tetrazol). A viabilidade das células musculares C2C12 foi avaliada pelo método MTT. Esse método mede a viabilidade celular com base no dano induzido nas mitocôndrias. O princípio do método é a avaliação da atividade de desidrogenases mitocondriais, quantificadas pela redução do MTT (um sal de coloração amarela solúvel em água) a formazan (cristais de coloração púrpura, insolúveis em água). As células C2C12 foram plaqueadas 1x10 4 célula/poço em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período as células receberam as toxinas na concentração de 75 μg/ml, ou meio de cultura (controle negativo) ou veneno de B. jararacussu na concentração de 25 μg/ml (controle positivo) e imediatamente foram irradiadas com laser, em seguida as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. A seguir, o ensaio da atividade mitocondrial foi realizado conforme descrito no item Ensaio da atividade enzimática da lactato desidrogenase (LDH) A atividade enzimática da LDH, presente no sobrenadante das culturas, foi considerada como parâmetro da lesão celular. As células C2C12 foram plaqueadas 1x10 4 célula/poço em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período as células receberam as miotoxinas, serão incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Em seguida os sobrenadantes das culturas de cada grupo foram removidos e armazenados em freezer 80ºC, a dosagem de LDH foi realizada por meio do kit LDH Liquiform (Labtest, Minas Gerais,Brasil), usando método cinético, espectrofotômetro 340 nm a 37ºC. Cada amostra foi analisada em triplicata, e três experimentos independentes serão realizados. Os resultados foram

40 23 expressos pelo decréscimo da D.O., resultante da oxidação do NADH, na presença de piruvato, em relação ao tempo zero Análise Estatística Os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média e analisados estatisticamente pelo teste t de Student ou Análise de Variância (ANOVA), complementado por testes de significância apropriados. Em todos os cálculos foram fixado o nível crítico menor que 0,05. Todas as amostras foram feitas em triplicatas e três experimentos independentes foram realizados.

41 24 RESULTADOS

42 25 4 RESULTADOS 4.1 Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a viabilidade das células C2C12. A viabilidade celular foi avaliada nos tempos de 15, 30 e 60 minutos após a incubação das células C12C12 com a toxina, em diferentes concentrações (10, 25, 50 e 75 µg/ml) ou meio de cultura (controle). Os resultados demonstraram a diminuição estatisticamente significativa na viabilidade celular nas concentrações 25, 50 e 75 µg/ml em todos os tempos analisados, quando comparado com o grupo controle, esse efeito foi mais pronunciado na concentração de 50 e 75 µg/ml, nos períodos de 30 e 60 min, após a incubação com o veneno (Fig. 6). No tempo de 60 minutos não houve alteração na viabilidade das células quando incubadas com a toxina na concentração de 25 µg/ml. A concentração de 10 µg/ml não apresentou efeito sobre a viabilidade celular (Fig. 6). Com base nesses resultados, a dose de 75 µg/ml foi a dose de escolha avaliar os efeito do LBP no presente trabalho.

43 Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) 26 A B Control * BthTx I ( g/ml) 15 min * # * Control BthTx I ( g/ml) 30 min * () * * C * () * Control BthTx I ( g/ml) 60 min Figura 6: Efeito da BthTX - I na viabilidade de células musculares C2C12. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período, a BthTX - I foi adicionada e foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de três experimentos independentes, ANOVA de Tukey; * p<0,05 comparado ao controle, # p<0,05 comparado as concentrações 10, 25 e 50 µg/ml ; () p<0,05 comparado as concentrações 10 e 25 µg/ml.

44 Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a integridade das células C2C12 A capacidade da toxina em afetar a integridade das monocamadas das células musculares C2C12 em cultura foi avaliada pelo descolamento das monocamadas, após sua incubação com a toxina, por 15, 30 e 60 minutos, em diferentes concentrações (10, 25, 50 e 75 µg/ml) em comparação às monocamadas contendo apenas meio de cultura (controle). Nas concentrações e tempos analisados, a BthTX - I não foi capaz de causar descolamentos da integridade das monocamadas de forma estatisticamente significante (Fig. 7).

45 Descolamento Celular ( DO ) Descolamento Celular (DO) Descolamento Celular ( DO ) 28 A B Controle BthTX I ( g/ml) 15 min 0.00 Controle BthTX I ( g/ml) 30 min C Controle BthTX I ( g/ml) 60 min Figura 7: Efeito da BthTX - I no descolamento de células muscular C2C12. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - I foi adicionada e foram incubadas em concentrações de 10, 25, 50 e 75 µg/ml durante 15, 30 e 60 minutos ou meio sozinho (controle). O descolamento celular foi determinado pelo ensaio de cristal violeta.

46 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - I. Para a avaliação do efeito de LBP 685 nm na viabilidade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente após a adição da toxina. O veneno bruto de B. jararacussu na concentração de 25 µg/ml foi utilizado como controle positivo. Nossos resultados demonstraram um aumento da viabilidade em células C2C12 irradiadas com o laser nos tempos de 15 e 30 min. Quando as células foram incubadas com a miotoxina e irradiadas, demonstraram um aumento de 31%, 57% e 60% na viabilidade celular, no tempo de 15, 30 e 60 minutos, respectivamente, após a aplicação do LBP, com o comprimento de onda de 685 nm (fig. 8).

47 Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) 30 A B 150 * 150 * * * * # $ * * # $ 0 Controle Cél. 685 nm Vbjs 25 g/ml Laser 685 nm 0 Controle Cél. 685 nm Vbjs 25 g/ml Laser 685 nm 15 min BthTX I (75 g/ml) 30 min BthTX I (75 g/ml) C * * * # $ 0 Controle Cél. 685 nm Vbjs 25 g/ml 60 min Laser 685 nm BthTX I (75 g/ml) Figura 8: Efeito do LBP 685 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação com BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - I foi adicionada (75 µg/ml) e as células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de energia (4J/cm 2 ) em comprimentos de onda de 685 nm, logo após foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; * p <0,05 vs controle; # p <0,05 vs Vjbs; $ p <0,05 vs BthTX I.

48 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - I. Para a avaliação do efeito de LBP 830 nm na viabilidade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente após a adição da toxina. Nossos resultados demonstraram um aumento de 27%, 49% e 60% na viabilidade celular no tempo de 15, 30 e 60 minutos respectivamente após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de 830 nm (fig. 9).

49 Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) 32 A B * * * #$ * * #$ 0 Controle Cél. 830 nm VBjs 25 g/ml Laser 830 nm 0 Controle Cél. 830 nm VBjs 25 g/ml Laser 830 nm 15 min BthTX I (75 g/ml) 30 min BthTX I (75 g/ml) C #$ 50 * * 0 Controle Cél. 830 nm VBjs 25 g/ml 60 min Laser 830 nm BthTX I (75 g/ml) Figura 9: Efeito do LBP 830 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação com BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - I foi adicionada (75 ug/ml) e as células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de energia (4J / cm2) em comprimentos de onda de 830 nm, logo após foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; *p<0,05 vs controle; # p<0,05 vs VBjs; $ p<0,05 vs BthTX - I.

50 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - II. Para a avaliação do efeito de LBP 685 nm na viabilidade das monocamadas de células incubadas com a BthTX - II, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente após a adição da toxina. Nossos resultados demonstraram um aumento de 23% e 22 % na viabilidade celular no período de 15 e 60 minutos após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de 685 nm. O mesmo efeito não foi observado no tempo de 30 min (fig. 10). Ainda, observamos um aumento da viabilidade celular das células irradiadas com o laser e incubadas com o meio de cultura em 27% e 50% respectivamente, nos tempos de 15 e 30 min (fig. 10).

51 Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) 34 A B 150 * 150 * 100 # # $ 100 * # # 50 * 50 * 0 Controle Cél. 685 nm VBjs 25 g/ml Laser 685 nm 0 Controle Cél. 685 nm VBjs 25 g/ml Laser 685 nm BthTX II (75 g/ml) BthTX II (75 g/ml) 15 min 30 min C * * # # 0 Controle Cél. 685 nm VBjs 25 g/ml 60 min Laser 685 nm BthTX II (75 g/ml) Figura 10: Efeito do LBP 685 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação com a BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - II foi adicionada (75 µg/ml) e as células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de energia (4J/cm2) em comprimentos de onda de 685nm, logo após foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; *p<0,05 vs controle; # p<0,05 vs VBjs; $ p<0,05 vs BthTX - II.

52 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - II. Para a avaliação do efeito de LBP 830 nm na viabilidade das monocamadas de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente após a adição da toxina. Nossos resultados demonstraram um aumento de 11% e 35% na viabilidade celular no período de 15 e 60 minutos após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de 830 nm. O mesmo efeito não foi observado no tempo de 30 min (fig. 11).

53 Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) Viabilidade Celular (%) 36 A B * # # $ 100 * # * # 50 * 50 * 0 Controle Cél. 830 nm VBjs 25 g/ml Laser 830 nm 0 Controle Cél. 830 nm VBjs 25 g/ml Laser 830 nm BthTX II (75 g/ml) BthTX II (75 g/ml) 15 min 30 min C # $ 50 * * # 0 Controle Cél. 830 nm VBjs 25 g/ml Laser 830 nm 60 min BthTX II (75 g/ml) Figura 11: Efeito do LBP 830 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação com BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - II foi adicionada (75 ug/ml) e as células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de energia (4J/cm2) em comprimentos de onda de 830, logo após foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; *p<0,05 vs controle; # p<0,05 vs VBjs; $ p<0,05 vs BthTX - II.

54 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I. A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, na concentração e tempos analisados (fig. 12).

55 LDH (D.O.) LDH (D.O.) LDH (D.O.) 38 A B Controle Cél. 685 nm Laser 685 nm 0.00 Controle Cél. 685 nm Laser 685 nm BthTX I (75 g/ml) BthTX I (75 g/ml) 15 min 30 min C Controle Cél. 685 nm Laser 685 nm BthTX I (75 g/ml) 60 min Figura 12: Efeito do laser de baixa potência (LBP) 685 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/ml) ou somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de 685 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes.

56 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I. A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, na concentração e tempos analisados (fig. 13).

57 LDH (D.O.) LDH (D.O.) LDH (D.O.) 40 A B Controle Cél. 830 nm Laser 830 nm 0.00 Controle Cél. 830 nm Laser 830 nm BthTX I (75 g/ml) BthTX I (75 g/ml) 15 min 30 min C Controle Cél. 830 nm Laser 830 nm BthTX I (75 g/ml) 60 min Figura 13: Efeito do laser de baixa potência 830 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas a lesão por BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/ml) ou somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de 830 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes.

58 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II. A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, na concentração e tempos analisados (fig. 14).

59 LDH (D.O.) LDH (D.O.) LDH (D.O.) 42 A B Controle Cél. 685 nm Laser 685 nm 0.00 Controle Cél. 685 nm Laser 685 nm BthTX II (75 g/ml) BthTX II (75 g/ml) 15 min 30 min C Controle Cél. 685 nm Laser 685 nm BthTX II (75 g/ml) 60 min Figura 14: Efeito do laser de baixa potência 685 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas a lesão por BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/ml) ou somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de 685 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes.

60 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II. A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, na concentração e tempos analisados (fig. 15).

61 LDH (D.O.) LDH (D.O.) LDH (D.O.) 44 A B Controle Cél. 685 nm Laser 830 nm 0.00 Controle Cél. 685 nm Laser 830 nm BthTX II (75 g/ml) BthTX II (75 g/ml) 15 min 30 min C Controle Cél. 685 nm Laser 830 nm BthTX II (75 g/ml) 60 min Figura 15: Efeito do laser de baixa potência 830 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/ml) ou somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de 830 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes.

62 45 Discussão

63 46 5 DISCUSSÃO Acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem, ainda, um problema de saúde pública em regiões tropicais do mundo (GUTIERRES et al., 2010; RAHMAN et al., 2010; WHO WORLD, HEALTH ORGANIZATION, 2013). A reação local ao envenenamento por serpentes do gênero Bothrops é caracterizada por uma resposta inflamatória grave, com formação de edema, sendo a mionecrose local o mais acentuado dano observado em acidentes por picada de serpentes (Ministério da Saúde 2001; BARRAVIERA, 1993; Ministério da Saúde 1999; DOIN- SILVA et al.; MILANI JUNIOR et al.; 1997; CARNEIRO et al., 2012). A mionecrose local é uma consequência comum nos envenenamentos causados por serpentes do gênero Bothrops. Segundo dados da literatura, a mionecrose é causada por miotóxinas com características de fosfolipase A2 (FLA2) (GUTIÉRREZ et al., 1984; BRENES et al., 1987). As fosfolipases são largamente presentes nos venenos de serpentes. Estas enzimas tem habilidade de causar rápida necrose das fibras do músculo esquelético, sendo, portanto, classificadas como FLA2 miotóxica (HARRIS; CULLEN, 1990). A soroterapia é o tratamento que se mostra mais eficaz em neutralizar os efeitos sistêmicos causados pelo envenenamento bothrópico, porem esse se mostra ineficaz em reverter os danos locais (ROSENFELD, 1971; ZAMUNER et al., 2004). Neste sentido, a laserterapia de baixa potência tem se mostrado eficaz na redução dos efeitos locais induzidos por serpentes botrópicas (DOIN-SILVA et al., 2009; GUIMARÃES et al., 2011; BARBOSA et al., 2009, 2011; NADUR-ANDRADE et al., 2014). Assim, o presente trabalho visou avaliar os efeitos de miotoxinas isoladas do veneno de B. jararacussu em células musculares, e no melhor entendimento da aplicabilidade do laser de baixa potência nessas células após lesão por miotoxinas botrópicas. Para a obtenção dos resultados demonstrados nesse estudo, foram utilizados mioblastos de linhagem C2C12, para avaliar os efeitos de miotoxinas isoladas em célula muscular. A utilização de músculos esqueléticos mioblastos/miotubos como alvos para o veneno bruto de serpente, bem como suas substâncias isoladas como metaloproteinase e miotoxinas tem sido sugerida como uma alternativa viável no modelo in vitro para estudar mecanismos miotóxicos, uma vez que se correlaciona com miotoxicidade in vivo (LOMONTE et al., 1999).

64 47 Neste trabalhou, investigou-se a capacidade da BthTX - I em alterar a viabilidade celular. Inicialmente, a viabilidade celular, na presença da miotoxina, foi avaliada pela atividade metabólica mitocondrial, que consiste na capacidade das células C2C12 em reduzir o composto formazan, produto cromogênico. Apenas células vivas, viáveis, são capazes de reduzir o MTT em formazan por desidrogenases mitocondriais, sendo a produção de formazan diretamente proporcional a viabilidade celular. Os resultados obtidos mostraram que a BthTX - I, foi capaz de diminuir a viabilidade das células musculares, este efeito foi dosedependente, sendo a concentração de 75 µg/ml que causou uma diminuição da viabilidade em torno de 50%, em todos os períodos de tempo analisados. Estes resultados estão de acordo com literatura que mostra a capacidade citotóxica do veneno bruto e de miotoxinas isoladas de venenos botrópicos sobre cultura de mioblastos de linhagem C2C12 (LOMONTE, et al., 1999; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000; SILVA et al., 2012; HAMZA et al., 2010). Da mesma maneira, a BthTX - II causou uma diminuição da viabilidade nas células C2C12 na concentração de 75 µg/ml, no entanto, a redução da viabilidade ficou em torno de 25%, para todos os tempos estudados. Dos Santos et al. (2011) demonstraram uma diminuição da viabilidade de células C2C12 com a BthTX - II em torno de 50% em células C2C12, no entanto, o método utilizado para avaliar a citotoxicidade foi a dosagem de lactato desidrogenase. Adicionalmente, investigamos a capacidade da BthTX - I em afetar o descolamento celular, para termos uma melhor compreensão da ação da miotoxina sobre a integridade da célula muscular. Os resultados demonstraram que a BthTX - I não afetou o descolamento das células C2C12 em nenhuma das concentrações ou tempo estudado. Esse resultado era esperado, uma vez que a literatura demonstra que os principais componentes do veneno responsáveis pelo descolamento das células de seu substrato são as metaloproteinases (BRENES et al., 2010). A terapia com o LBP é uma alternativa eficaz para o tratamento dos efeitos locais causados por serpentes botrópicas devido a sua capacidade de diminuir a inflamação, hemorragia e mionecrose após envenenamento botrópico experimental, in vivo, tanto com veneno bruto quanto com miotoxinas isoladas (DOURADO et al., 2003; BARBOSA et al., 2009; NADUR-ANDRADE et al., 2012; 2014). No entanto, os

65 48 mecanismos envolvidos na proteção local pela irradiação laser contra a ação local do veneno botrópico ainda não são compreendidos. Neste estudo, investigamos a capacidade da terapia LBP em proteger as células musculares contra ação de miotoxinas isoladas do veneno da serpente B. jararacussu. O efeito da terapia com LBP na citotoxicidade causada pelo veneno foi avaliada usando o laser na densidade de energia de 4 J/cm 2 em dois comprimentos de onda, vermelho no comprimento de onda 685 nm e infravermelho no comprimento 830 nm, após a adição das miotoxinas nas células musculares C2C12. Os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a concentração usada de 4 J/cm 2 reduziu a citotoxicidade, avaliada pelo método MTT, em células musculares em todos os períodos de tempo analisados após a adição das miotoxinas. Em apoio a este resultado, há relatos sobre a habilidade do laser em estimular processos celulares em vários tipos celulares, humanas e animais, in vitro (para revisão ver PEOPLOW et al., 2010). No entanto, não esta claro o mecanismo pelo qual o laser protege a célula muscular da ação das miotoxinas, esse efeito pode ser resultante tanto de uma parcial ou mesmo total proteção da célula, ou por estimulação da proliferação de células sobreviventes. Quando analisamos a efetividade do laser vermelho em comparação com o laser infravermelho, observamos que o laser vermelho se mostrou mais efetivo, em comparação com o laser infravermelho. Essa diferença encontrada entre o laser vermelho e o infravermelho pode estar relacionada com a penetração da luz no tecido (EL SAYED et al., 1990; TACON et al., 2011) uma vez que já foi demonstrado que o laser vermelho penetra mais no tecido que o laser infravermelho. Além disso, é descrito na literatura que a luz laser que emite no espectro vermelho visível estimula a cadeia respiratória em células sob estresse, levando a alterações no transporte de elétrons pela mitocôndria, como a formação de ATP (KARU, 1989; OLSON et al., 1981; MOORE et al., 2005). Então, além do aumento da síntese de ATP, há uma sinalização para o núcleo para estimular a produção de enzimas antioxidantes, proteínas que estabilizam a função celular e proliferação (POLO et al., 1999). Além disso, observamos um aumento da viabilidade celular em células que somente foram irradiadas com o laser vermelho, o que não aconteceu com as células irradias com o laser infravermelho. É possível que no nosso modelo

66 49 experimental o laser vermelho tenha produzido mais ATP e com isso tenha sido mais efetivo, a hipótese que vamos esclarecer em estudo futuro. Para melhor entender a capacidade do laser em proteger a célula muscular contra a ação das miotoxinas, investigamos a capacidade das miotoxinas em afetar a viabilidade celular, pela liberação da lactato desidrogenase (LDH) uma enzima intracelular que após rompimento da membrana celular é liberada, podendo ser dosada no sobrenadante de cultura celular. A LDH converte piruvato a lactato, gerando NAD, que é importante para sustentação do fluxo glicolítico. A LDH converte o piruvato, que é o produto final da glicólise em lactato na ausência ou em pequenas quantidades de oxigênio, realiza também reação reversa via glicolítica anaeróbica no fígado. Na presença de grandes concentrações de lactato, a enzima exibe inibição por feedback e a taxa de lactato a piruvato é reduzida. Em nosso modelo experimental, não encontramos diferença na liberação de LDH em nenhum dos tempos analisados por nenhuma das miotoxinas estudadas. Nossos resultados mostraram contrários aos mostrados por outros autores que demonstram que as miotoxinas de B. apser e B. jararacussu aumentam a liberação de LDH em diferentes tempos e concentrações quando comparados com esse estudo. (ANGULO et al. 2005; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000; LOMONTE et al., 1999). Esses achados sugerem que novas concentrações e tempos devem ser avaliados para o melhor entendimento dos possíveis mecanismos de ação das toxinas. É possível considerar que a fototerapia com laser de baixa potência utilizando parâmetros específicos descritos neste estudo foi capaz de compensar os efeitos citotóxicos causados pelas miotoxinas. É bastante provável que dois ou mais mecanismos de ação da fototerapia tenha ocorrido simultaneamente nas culturas irradiadas e foram responsáveis pela resposta biológica observada. O aumento da atividade celular por aumento do metabolismo (atividade mitocondrial) decorrente da irradiação laser, com as duas miotoxinas estudadas, pode ser considerado como um efeito benéfico da terapia. A partir dos parâmetros utilizados neste trabalho, que demonstraram eficácia na compensação da citotoxicidade das miotoxinas, podemos sugerir que o laser de baixa potência seja uma ferramenta eficaz com efeitos importantes na diminuição dos efeitos locais causados por envenenamento botrópico.

67 50 Conclusões

68 51 6 CONCLUSÕES Os dados do presente estudo permitiu concluir que: As miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno da serpente B. jararacussu apresentam efeito miotóxico de maneira dose-dependente, nos períodos analisados, para a linhagem celular utilizada nesse estudo. O laser de baixa potência 685 nm e 830 nm foi capaz de proteger a célula muscular contra a ação da miotoxinas BthTX - I e BthTX - II, pelo método de MTT, mas não pelo método de liberação de LDH.

69 52 Referências Bibliográficas

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