CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, ENZIMÁTICA e CITOTÓXICA DE UMA FOSFOLIPASE A2 ÁCIDA ISOLADA DA PEÇONHA DE Bothrops paulosensis.

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1 1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, ENZIMÁTICA e CITOTÓXICA DE UMA FOSFOLIPASE A2 ÁCIDA ISOLADA DA PEÇONHA DE Bothrops paulosensis. Francis Barbosa Ferreira 1, Renata Santos Rodrigues 1, Thomas Cardoso 1, Veridiana de Melo Rodrigues Ávila 1 Resumo: As fosfolipases A 2 catalisam a hidrólise de fosfolipídeos, liberando como produtos ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. As fosfolipases das peçonhas de serpentes são amplamente estudadas devido à variedade de seus efeitos farmacológicos como neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativação ou inibição da agregação plaquetária, anticoagulação, edema, convulsão, hipotensão, hemorragia interna, dentre outras. Porém, nem todas as PLA 2 induzem todos esses efeitos. Este trabalho teve como objetivo a purificação e caracterização química e enzimática de uma fosfolipase A 2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis, bem como a avaliação de sua ação bacteriolítica e citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia). A fosfolipase A 2 isolada foi denominada de CM1b-F5. Esta enzima foi purificada por cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose Fast Flow seguido por filtração em Sephadex G-75 e finalizando em Phenyl Sepharose CL-4B. CM1b- F5 apresentou uma massa molecular de 15.8KDa, atividade fosfolipásica de 289 U/mg e atividade hemolítica indireta. Não apresentou ação bactericida e baixa atividade citotóxica, no entanto outras linhagens celulares deverão ser utilizadas para uma análise mais criteriosa dessa ação. Novos estudos deverão ser realizados com a PLA 2 ácida isolada da peçonha de Bothrops pauloensis com intuito de obter novos parâmetros estruturais e funcionais que poderão contribuir para a utilização das mesmas como modelo estrutural para a síntese de novos agentes terapêuticos. Palavras-chave: fosfolipase A 2 ; Bothrops pauloensis; citotoxicidade Abstract: The phospholipases A 2 catalyse the phospholipids hydrolysis, releasing free fat acids and lisophospholipids. The snake venom phospholipases are widely studied due to the variety of their pharmacological effects as neurotoxicity, miotoxicity, cardiotoxicity, activation or inhibition of the platelet aggregation, anti-coagulation, edema, convulsion, hypotension, interns hemorrhage, among other. However, nor all of PLA2 induce all those effects. This work had as objective the purification and chemical and enzymatic characterization of an acid phospholipase A 2 of Bothrops pauloensis snake venom, as well as to evaluate her bacteriolytic and cytotoxic action on K-562 (Leukemic) tumor cells. The isolated phospholipase A 2 was denominated CM1b-F5. This enzyme was purified by CM- 1 - Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia, Av. Pará, 1720, Uberlândia-MG, CEP: , francisbbio@yahoo.com.br

2 2 Sepharose Fast Flow ionic exchange chromatography following for filtration in Sephadex G- 75 and concluding in Phenyl Sepharose CL-4B. CM1b-F5 presented a molecular mass of 15.8KDa, phospholipasic activity of 289 U/mg and indirect hemolytic activity. It didn't present bactericidal action and low cytotoxic activity, however other cellular lineages should be used for a more discerning analysis of that action. New studies should be carried out with isolated acid PLA 2 of the Bothrops pauloensis snake venom with intention of obtaining new structural and functional parameters that will can be able to contribute to the use of the same ones as structural model for the synthesis of new therapeutic agents. Keywords: phospholipase A 2 ; Bothrops pauloensis; citotoxicity INTRODUÇÃO No Brasil, a morbidade (número de envenenamentos) notificada por serpentes do gênero Bothrops é de aproximadamente 15 a cada pessoas (CHIPAUX, 1998). Devido à ação de várias enzimas, especialmente fosfolipases A 2 (PLA 2 ) e metaloproteases, os venenos botrópicos produzem fortes danos em tecidos biológicos, bem como a interferência em quase todas as fases da hemostase humana (HIGUCHI et al., 2007). As enzimas PLA 2 de venenos de serpentes vêm sendo amplamente estudadas devido à variedade de seus efeitos farmacológicos, como neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativação e/ou inibição da agregação plaquetária, anticoagulação, edema, convulsão, hipotensão, hemorragia interna, dentre outras, porém, nem todas as PLA 2 induzem todos esses efeitos (FRANCISCHETTI et al., 1998; KINI, 2003; MASUDA et al., 2005). As PLA 2 catalisam a hidrólise especificamente na ligação 2-acil éster de fosfolipídios, liberando como produtos os lisofosfolipídios e ácidos graxos livres (SIX; DENNIS, 2000). Estas enzimas podem possuir um resíduo de aspartato na posição 49 (D49), ou um resíduo de lisina na mesma posição (K49). As D49 são enzimaticamente ativas e as k49 possuem baixa ou nenhuma atividade enzimática (OWNBY et al., 1999; KETELHUT et al., 2003;). Existem variantes da subclasse Lys49, como Arg 49 e Ser 49 presentes em algumas PLA 2 s de peçonhas ofídicas já isoladas. Chijiwa et al. (2006) isolaram duas PLA 2 s da peçonha de Protobothrops elegans que possuem um resíduo de Arg na posição 49 (Arg49), denominadas PeBP(R)-I e PeBP(R)-II, mas com alto grau de homologia com as K49 já isoladas. A atividade enzimática destas enzimas pode ser influenciada por alguns fatores como a especificidade pelo substrato, a presença de diferentes classes

3 3 de fosfolipídios na região do sítio catalítico e o poder de penetração, em que uma PLA 2 com maior penetração causa um dano mais significativo nos tecidos (KINI, 2003). As fosfolipases A 2 podem ser divididas em cinco grupos principais: PLA 2 secretórias (spla 2 ), citosólicas (cpla 2 ), Ca 2+ independentes, acetilhidrolases fator de agregação plaquetária (PAF-AH) e as lisossômicas, divididas de acordo com o mecanismo catalítico e suas características funcionais e estruturais. As PLA 2 secretórias foram subdivididas em quatorze grupos, de acordo com o número de resíduos de aminoácidos e posição das ligações dissulfeto, sendo que as PLA 2 dos venenos de serpentes estão incluídas nos grupos I e II (SCHALOSKE; DENNIS, 2006). Essas enzimas são pequenas, com o peso molecular variando de 13 a 18 kda, e causam destruição pela interferência nos processos fisiológicos normais da vítima (KINI, 2003). As PLA 2 e suas isoformas oferecem um grande desafio para os pesquisadores, no sentido de desvendar a sua estrutura e função. Pesquisas nesta área auxiliarão a determinar os mecanismos dos efeitos farmacológicos, bem como ampliar nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação destas toxinas, seus efeitos deletérios, ou para efeitos contrários a algumas doenças importantes. Estes estudos são de extrema importância pois podem subsidiar conhecimentos em áreas correlatas como o desenvolvimento de drogas para tratamento de vítimas de acidentes ofídicos, desordens hemostáticas, bem como para o desenvolvimento de novas drogas com ação bactericida e antitumorais. Além disso, estes estudos resultarão em inovadoras oportunidades e caminhos para encontrar respostas para a toxicidade das PLA 2 e também para o desenvolvimento de proteínas com novas funções biológicas (KINI, 2003). Portanto, este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar química e enzimaticamente uma fosfolipase A 2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis, bem como avaliar a sua ação bactericida e citotóxica sobre a linhagem de células tumorais K-562 (leucemia). MATERIAL E MÉTODOS Obtenção da peçonha A peçonha da serpente botrópica foi cedida pela Pentapharm do Brasil Comércio e Exportação Ltda. Após a coleta, a peçonha foi imediatamente dessecada à vácuo em temperatura ambiente e conservado a -20ºC. Quantificação de proteínas As dosagens de proteínas em soluções de 0,1 a 2,0 mg/2,0 ml de

4 4 solução foram realizadas pelo método de microbiureto conforme descrito por Itzhaki e Gill (1964). A reta padrão foi construída utilizando a soroalbumina bovina como proteína padrão, considerando-se o seu coeficiente de extinção em 280 nm 0,666. Purificação da fosfolipase ácida da peçonha de Bothrops pauloensis A purificação da fosfolipase ácida foi realizada de acordo com Rodrigues et al. (2007), com modificações. Cerca de 180 mg da peçonha botrópica foram ressuspendidos em 2,0 ml de tampão bicarbonato de amônio 50 mm, ph 7.8. Em seguida a amostra foi centrifugada a xg por 10 min. a 4 C e o sobrenadante aplicado a uma coluna de troca iônica contendo a resina CM Sepharose Fast Flow (2,0 x 20,0 cm), previamente equilibrada com o mesmo tampão. A amostra foi eluída em temperatura ambiente pelo estabelecimento de um gradiente convexo de concentração usando o tampão bicarbonato de amônio nas concentrações de 0,05 a 0,5 M. Frações de 3 ml/tubo foram coletadas num fluxo de 20mL/hora. A fração com atividade fosfolipásica foi coletada e submetida em Sephadex G-75, equilibrada com um tampão AMBIC 0,05M ph 7.8. A fração ativa foi coletada e aplicada em Phenyl-Sepharose previamente equilibrada com o tampão Tris-HCl 10mM com 2M de NaCl, ph 8.5. A eluição procedeu à temperatura ambiente, seguido por tampão Tris-HCl 10mM, ph 8.5, com concentrações decrescentes de NaCl (1 e 0,5 M) até 10 mm de Tris-HCl ph 8.5, encerrando o processo de eluição com água. Caracterização química Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com agente desnaturante: As eletroforeses com agente desnaturante (SDS) foram realizadas segundo a técnica descrita por Laemmli (1970). Esta técnica foi realizada para a identificação, estimativa da massa molecular e análise do grau de pureza da toxina de interesse. Ensaios Enzimáticos Atividade Fosfolipásica (PLA 2 ) Essa atividade foi determinada por titulação potenciométrica segundo o método descrito por De Haas et al. (1968). Como substrato foi utilizada uma emulsão de gema de ovo em presença de deoxicolato de sódio 0,03 M e CaCl 2 a 0,6 M. Os ácidos graxos liberados enzimaticamente foram titulados com uma solução padrão de NaOH 0,1208N em ph 8,0 e temperatura ambiente. A atividade fosfolipásica foi expressa em

5 5 microequivalentes de base consumida por minuto e a atividade específica pelo número de µequivalentes de base consumida por minuto, por mg de proteína. Para cada ensaio foram utilizados 10 µg de proteínas. Atividade hemolítica indireta A atividade hemolítica indireta foi testada em gel de agarose contendo gema de ovo e eritrócitos como substrato. A dose mínima hemolítica indireta (DMHi) foi calculada segundo Gutíerrez et al. (1988) e determinada como uma medida da atividade fosfolipase A 2, definida como a quantidade de proteínas que produz um halo mínimo de 10 mm. Cada ensaio foi expresso pela média ± D.P. (n = 5) Atividade bactericida Escherichia coli, cepa ATCC 25922, foi adquirida junto ao Laboratório Genética Molecular da UFU, cedidas gentilmente pelo Dr. Luiz Ricardo Goulart, INGEB. As bactérias individuais, E.coli, foram inicialmente inoculadas em meio de cultura estéril BHI (Brain Heart Infusion-Broth infusão desidratada de coração e cérebro 1,75% (m/v), Triptose 0,1% (m/v), glicose 0,2% (m/v), NaCl 0,5% (m/v), Na 2 HPO 4 0,25% (m/v), ph 7,4 ± 0,2 a 25 O C da Diagnolab, Espanha) e ativadas por 16 horas a 37 O C em repouso. As culturas foram diluídas 100 vezes em BHI estéril. Retirou-se 2mL para o plaqueamento em microplaca de 96 poços, na presença ou na ausência da toxina em concentrações de 0,4 e 0,8 µg.ml -1 diluídas em BHI. Inicialmente e após 6 horas de incubação a 37 O C sem agitação, a densidade óptica foi monitorada em espectrofotômetro (Leitor de microplacas Camberra-Packard) utilizando-se o filtro de interferência de 600nm. Ensaios de Citotoxicidade Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em colaboração com a Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Foram utilizadas células tumorais K-562 (leucemia), fornecidas pelo Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico- Farmacológicas, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás UFG e células normais humanas Human foreskin fibroblasts HFF (fibroblasto), fornecidas pelo Laboratório de Imunologia da Universidade Federal de Uberlândia. Meio de cultura celular para células tumorais Para a manutenção da linhagem de células tumorais, a dissolução da toxina testada e a realização dos ensaios de citotoxicidade,

6 6 seguiram-se o protocolo do ATCC (American Type Culture Collection), utilizando meio RPMI 1640 suplementados com 10% de soro fetal bovino (SFB), 20 mm de L-glutamina, 7,5% de bicarbonato de sódio e 10µg/mL de gentamicina (meio completo). Este meio foi preparado na hora do uso e esterilizado por filtração em membranas de 0,22µm. Como controle negativo foi utilizado o meio RMPI 1640 com L-glutamina, suplementado com 10% de soro fetal bovino. Atividade citotóxica Como controle positivo, foi utilizada a droga ciclofosfamida, diluída em meio incompleto em concentração de 5mg/mL. A ciclofosfamida é um fármaco antineoplásico com amplo espectro de ação antitumoral, utilizada também como alternativa na supressão da rejeição imunológica dos órgãos transplantados (CRAIG; STITZEL, 1996). O ensaio foi realizado por meio de diluição seriada da seguinte maneira: Na solução padrão tem-se a PLA 2 onde se acrescentou 1000 µl de meio completo, obtendo uma concentração de 100mg/mL; Retirou-se 10 µl da solução padrão e acrescentou-se 990 µl de meio completo obtendo-se assim a 2º concentração de 10mg/mL; Da 2º concentração retirou-se 10 µl e acrescenta-se 990 µl de meio completo obtendo a terceira concentração de 1 mg/ml; O mesmo processo foi continuado, obtendo-se assim as outras concentrações: 0,1mg/mL, 0,01mg/mL, 0,001mg/mL. Para avaliar a atividade citotóxica da toxina foi utilizado o método colorimétrico com 3-(4,5-Dimetiltiazol-2- il)2,5-difenil Brometo de Tetrazólio), o MTT. O princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Quando as células estão vivas as desidrogenases mitocondriais são capazes de agir sobre substratos como o MTT levando a quebra dessa molécula e a redução desta, formando assim o Azul de Formazan. Portanto, quanto maior a viabilidade celular em uma determinada amostra, mais Azul de Formazan é formado. O Azul de Formazan é solubilizado com Dodecilsulfato de Sódio (SDS) ou Isopropanol em meio ácido. A leitura da quantidade de Azul de Formazan foi medida através de espectofotometria, utilizando-se filtro de interferência de 550 nm.

7 7 Para avaliar a ação da toxina, foram plaqueadas 2x10 5 células em microplacas de 96 poços. Após o plaqueamento, as células foram tratadas com 100 µl de toxinas nas concentrações descritas acima e incubadas por 24h em estufa a 37 C contendo 95% de ar e 5% CO 2. Ao fim da incubação, foram adicionados aos poços de cultivo celular, 10 µl de MTT na concentração de 5mg.mL -1. A placa foi novamente incubada e após 3 horas foram adicionados 50 µl SDS 10% HCL 0,01 N. A atividade citotóxica foi avaliada como a capacidade de inibir a proliferação das células. RESULTADOS Fracionamento e Caracterização Química O fracionamento da peçonha de Bothrops pauloensis por cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose produziu seis picos principais (Figura. 1). Figura 1: Cromatografia em CM- Sepharose de 180 mg da peçonha bruta de Bothrops pauloensis. Coluna de 20 x 2 cm, equilibrada com tampão bicarbonato de amônio 0,05M ph 7,8, com fluxo de 20ml/h, coletadas frações de 3ml/tubo e gradiente convexo de bicarbonato de amônio 0,5M ph 7,8. Para cada pico foi testada a atividade fosfolipásica por titulação potenciométrica e verificado o perfil protéico em PAGE-SDS. A eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% com SDS foi realizada para verificar o grau de pureza das proteínas presentes em cada fração. Como pode ser observada na figura 2, a fração CM1 é constituída pela maioria dos componentes presentes no veneno total, já a fração CM4 e CM5 apresentam um bom grau de pureza, mas necessitam de novas etapas de purificação (Figura. 2).

8 8 Figura 2: Eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em condições desnaturantes. Tampão Tris-Glicina ph 8.3. Tempo de corrida 80 minutos a 20mA constante e voltagem variando de 100 a 200V. Após a corrida o gel foi corado com Coomassie Blue R-250 a 2,5% por 10 minutos e em seguida descorado com ácido acético 10%, etanol 30% e água deionizada. A fração CM1 apresentou alta atividade fosfolipásica (Tabela 1) e foi recromatografada em uma coluna contendo a resina Sephadex G-75, resultando em 3 frações principais, denominadas CM1a, CM1b e CM1c (Figura 3). Figura 3: Cromatografia em Sephadex G- 75 de 40mg da fração CM1. A resina foi equilibrada com o tampão AMBIC 0,05M, ph 7.8 e eluída com o mesmo tampão à temperatura ambiente. Este fracionamento resultou em 3 subfrações: CM1a, CM1b e CM1c. A fração CM1b apresentou atividade PLA 2 (Tabela 1) e foi aplicada em Phenyl-Sepharose CL-4B, resultando em 6 novas subfrações, denominadas CM1b-F1 a F5 (Figura 4). Figura 4: Cromatografia de 16,4 mg da fração CM1b em Phenyl-Sepharose Fast Flow (coluna de 20 x 1.2 cm), equilibrada com tampão Tris-HCl 10mM ph NaCl 2M com fluxo de 20ml/h. Foram coletadas frações de 2,0ml/tubo. A eluição foi realizada com Tris-HCl 10mM com concentrações molares decrescentes de NaCl (1M e 0,5M), finalizando a eluição com água. Na figura 5 observa-se o perfil eletroforético em gel de poliacrilamida PAGE-SDS a 12% da peçonha bruta e das frações com atividade PLA2 obtidas durante o processo de purificação. A homogeneidade da fração CM1b- F5 foi mostrada por PAGE-SDS (Figura 5). A proteína purificada consiste em um

9 9 polipepitídeo de cadeia única, com massa molecular de aproximadamente Da. Figura 5: Eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em condições desnaturantes. Tampão Tris-Glicina ph 8.3 tempo de corrida 80 minutos a 20mA constante e voltagem variando de 100 a 200V. Após a corrida o gel foi corado com Coomassie Blue R-250 a 2,5% por 10 minutos e em seguida descorado com ácido acético 10%, etanol 30% e água desionizada. fração CM1 e uma recuperação da atividade fosfolipásica de 45,15%, para a mesma fração. No segundo passo cromatográfico, Sephadex G-75, a fração com atividade fosfolipásica, CM1b, teve um rendimento protéico e recuperação da atividade fosfolipásica de 41% e 25,62%, respectivamente. No terceiro fracionamento, em Phenyl-Sepharose, o rendimento protéico foi de 1,82% e a recuperação da atividade fosfolipásica de 40,29% para a fração CM1b-F5. Tabela 1: Rendimento protéico do fracionamento da peçonha bruta de Bothrops pauloensis e atividade fosfolipásica. Foi avaliada a recuperação protéica nos diferentes passos cromatográficos em relação à quantidade total de proteína aplicada em cada fracionamento, bem como a atividade fosfolipásica das mesmas (Tabela 1). No primeiro fracionamento, em CM-Sepharose, obteve-se um rendimento protéico de aproximadamente 22% para a

10 10 CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA Comparação da atividade fosfolipásica durante as etapas de purificação A atividade fosfolipásica foi determinada em triplicata por titulação pontenciométrica. Podemos observar que houve uma queda de atividade da fração CM1 para a CM1b, porém, em comparação com a fração CM1b-F5, esta atividade aumentou satisfatoriamente (Figura 6). A atividade da fração CM1b-F5 é quase 5 vezes maior do que a atividade da peçonha bruta. hemólise nos tempos determinados de 3, 6, 12 e 24 horas. Porém, a enzima contida na solução CM1b-F5 foi significativamente mais ativa em todos os intervalos analisados. Figura 7a: Figura 7b: Figura 6: Comparação da atividade fosfolipásica da peçonha bruta e das frações resultantes dos passos cromatográficos. Atividade hemolítica indireta A atividade hemolítica indireta está apresentada nas figuras 7a e 7b. Foram utilizados 5µg da PB de Bothrops pauloensis ou da CM1b-F5 sobre o substrato e ambas foram capazes de induzir

11 11 Inibição de Proliferação (%) C+ PLA2 (mg.ml -1 ) Figura 7: A- Atividade hemolítica indireta com 5 µg de PB ou PLA 2. B-O halo hemolítico foi avaliado em diferentes intervalos de tempo (3, 6, 12 e 24 horas). Atividade Citototóxica A figura 8 apresenta a atividade citotóxica da PLA 2 ácida sobre células tumorais K-562 (leucemia). Como pode ser observado a PLA 2 apresentou baixa citotoxicidade quando comparado com o controle positivo ciclofosfamida. Interessantemente nas concentrações extremas testadas (0,001mg/mL e 100mg/mL) essa inibição foi mais satisfatória, cerca de 20% de inibição da proliferação. Quando testada sobre células normais HLL (fibroblastos) a PLA 2 foi capaz de induzir a proliferação celular de uma forma dose dependente (Figura 9). Figura 8: Inibição da proliferação de células K562 induzida por diferentes concentrações da PLA 2 ácida de B. pauloensis. Inibição de Proliferação (%) C C+ PLA2 (mg;ml -1 ) Figura 9: Inibição da proliferação de fibroblastos (Human foreskin fibroblasts HFF) induzida por diferentes concentrações da PLA 2 ácida de B. pauloensis. DISCUSSÃO As PLA 2 s representam uma classe de enzimas versáteis, considerando sua função,

12 12 localização, regulação, mecanismo de ação, seqüência, estrutura e papel dos íons metálicos bivalentes. Durante os últimos 20 anos houve um grande interesse em se estudar estas toxinas, resultando no isolamento e caracterização estrutural e funcional de várias PLA 2. A grande maioria das PLA 2 s isoladas de peçonhas de serpentes botrópicas, descritas até agora, são proteínas de caráter básico, ponto isoelétrico variando entre 7.0 e 10.0, que possuem atividade catalítica ou não, sobre substratos artificiais. As análises da composição em aminoácidos indicaram que essas toxinas são ricas em aminoácidos básicos e hidrofóbicos (HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; SELISTRE et al., 1990; LOMONTE et al., 1990 ; MANCUSO et al., 1995; ANGULO et al., 1997). Apresentam também um alto número de resíduos de meia-cistina, o que sugere a presença de várias pontes dissulfeto intracadeia. As PLA 2 s tóxicas são muito estáveis, provavelmente como resultado da extensa ligação cruzada, tornando-as ativas em uma ampla faixa de ph e temperatura. Entretanto, várias PLA 2 s ácidas também já foram isoladas das peçonhas botrópicas, como por exemplo: SIIISPIIA, SIIISPIIB, SIIISPIIIA e SIIISPIIIB por Ketelhut et al. (2003); P1, P2 e P3 por Daniele et al. (1995). Da peçonha de B. pauloensis já foram isoladas várias PLA 2 s. Duas fosfolipases A 2 Asp-49 (RODRIGUES et al., 2004), duas miotoxinas Lys-49, BnSP-6 e BnSP-7 (RODRIGUES et al., 1998) e uma fosfolipase A 2 ácida (RODRIGUES et al., 2007). No presente trabalho isolamos a PLA2 ácida de Bothrops pauloensis segundo Rodrigues et al. (2007) com algumas modificações. Introduzimos uma etapa intermediária, onde substituímos a utrafiltração em AMICON YM (30.000) por uma filtração em coluna de Sphadex G-75. Com essa nova metodologia pretendíamos obter a toxina com um maior rendimento e grau de pureza. Com a utilização deste método, que combina cromatografias de troca iônica, gelfiltração e interação hidrofóbica, conseguimos um alto grau de pureza da PLA 2 (CM1b-F5) de interesse (figura 7). No entanto comparando nossos resultados com Rodrigues et al. (2007) concluímos que o rendimento protéico não foi tão satisfatório, mas a recuperação da atividade PLA 2 foi maior (Tabela 1). O primeiro fracionamento, em CM- Sepharose, indica que a PLA 2 é uma proteína ácida, pois estava presente na primeira fração denominada CM1. Esta fração continha as enzimas com carga negativa, ou seja, que não interagiam com a resina. Rodrigues et al. (2007) determinou o pi da PLA 2 ácida de B. pauloensis em torno de 4,34. A massa molecular da PLA 2 estimada por SDS-

13 13 PAGE é aproximadamente Da, valor também encontrado por Rodrigues et al. (2007). Este valor está dentro da faixa de massa molecular ( a ) encontrada para as fosfolipases A 2 já purificadas e caracterizadas, (KINI, 2003). A atividade específica aumentou significativamente da peçonha bruta para a fração CM1b-F5, 63 U/mg e 289 U/mg, respectivamente. Porém, pode-se observar que a atividade caiu, quando comparadas as atividade das frações CM1 e CM1b. Ketelhut et al. (2003) verificou que as fosfolipases A 2, geralmente, possuem atividade hemolítica indireta, pois promovem a hidrólise de lecitinas e lisolecitinas, componentes capazes de lisar a membrana dos eritrócitos. Neste trabalho verificou-se que tanto a peçonha bruta de Bothrops pauloensis quanto a PLA 2 (CM1b-F5) isolada da mesma, foram capazes de induzir a hemólise in vitro. O aumento da atividade foi tempodependente, sendo que a toxina isolada teve uma atividade quase duas vezes maior do que a peçonha para os mesmos intervalos de tempo (Figuras 7a e 7b). De acordo com Villalobos et al. (2007), algumas fosfolipases A 2 são capazes de induzir a citotoxicidade, bem como o rompimento de membranas bacterianas. Neste trabalho foi avaliada a atividade bactericida e citotóxica da PLA 2 em Escherichia coli, células tumorais K- 562 (leucemia) e fibroblastos (Human foreskin fibroblasts - HFF). Esta enzima não foi capaz de induzir atividade bactericida (resultados não apresentados) e induziu uma baixa atividade antitumoral (Figura 8). A ação antitumoral de venenos de serpentes tem sido alvo de várias pesquisas atualmente. Muitos desses efeitos são induzidos por PLA 2 s básicas cuja ação citotóxica independe da atividade catalítica dessas enzimas (STABELI et al., 2006). A ação antitumoral de PLA 2 s ácidas isoladas de venenos de serpentes ainda não foi demonstrado, embora no presente estudo verificamos uma discreta ação citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia). Novos estudos com outras linhagens celulares deverão ser realizados para se verificar o potencial antitumoral dessa toxina. Estudos na área de purificação e caracterização funcional de toxinas animais abrem perspectivas para a utilização das mesmas como modelos moleculares para a síntese de novos agentes terapêuticos que poderão ser utilizados na terapia do câncer. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANGULO, Y.; CHAVES, E.; ALAPE, A.; RUCAVADO, A.; GUTIERREZ, J. M.; LOMONTE, B. Isolation and characterization of a myotoxic

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