Kyolab, 01 de junho de 2012.

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Maria de Fátima Veiga de Escobar
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1 1. DADOS CADASTRAIS DO SOLICITANTE NOME: Paulo Antônio Rodrigues Gouveia ENDEREÇO: Rua Goianesia, nº78, Conjunto Urbanístico. CIDADE: Araguaina - TO CEP: CNPJ/CPF: INSCRIÇÃO ESTADUAL: DADOS AMOSTRA IDENTIFICAÇÃO DO PRODUTO: Extrato aquoso de Guazuma ulmifolia. TOTAL AMOSTRA: 5 frascos. LOCAL DE PRODUÇÃO: Fornecido pelo solicitante. LOTE: --- VALIDADE: ENSAIOS ENSAIOS REALIZADOS: Purificação do extrato aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da atividade antiviral (HIV) in vitro. 4. EXECUÇÃO DOS ENSAIOS KYOLAB LABORATÓRIO LTDA. Rua Lauro Vanucci, 1020 Jd. Santa Cândida Campinas-SP CEP: RESPONSÁVEL PELO ENSAIO: Thaís Barbizan Ferreira da Costa e Dr. Amilcar Tanuri DATA DE RECEBIMENTO DA AMOSTRA: Fevereiro/2012 Período de realização do ensaio: Abril/Maio 2012 Data emissão do relatório: 01/06/2012 Kyolab, 01 de junho de 2012.

2 RELATÓRIO TÉCNICO Purificação do extrato aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da atividade antiviral (HIV) in vitro. 1. Identificação da amostra Extrato aquoso de Guazuma ulmifolia fornecido pelo solicitante. 2. Objetivos Purificação do extrato aquoso e avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro. 3. Método 3.1 Purificação do extrato aquoso: Foi realizada uma filtração do extrato fornecido e após uma partição líquido líquido com hexano e butanol, como pode ser observado no fluxograma 1. O hexano extraiu muito pouco, com isso, não se obteve uma massa significativa. Foi realizada uma Cromatografia em Camada Delgada para uma comparação da composição química das diferentes amostras obtidas com a partição. Para avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro, foram enviadas as amostras: Fração butanólica (BuI), Fração aquosa (AQI) e extrato total após a filtração (TI).

3 Extrato aquoso Guazuma V= 200mL - Funil de separação; - 200mL Hexano; - Agitação e separação das fases. Fr. Hexânica Fr. Aquosa - 200mL Butanol; - Agitação; - Separação das fases. FR. BuOH 1 Fr. Aquosa Agrupamento das duas frações mL Butanol; - Agitação; - Separação das fases. FR. BuOH 2 m = 166,7mg Fr. Aquosa M = 1,4662g Fluxograma 1: Partição líquido/líquido extrato aquoso de Guazuma ulmifolia.

4 Cromatografia em Camada Delgada: Pontos: 1) Extrato aquoso após filtração; 2) Fração Aquosa; 3) Fração Butanólica. Eluente: Acetato de etila: Ác. Fórmico: Água ( 90:5:5) Revelador: Solução de Anisaldeído. 3.2 Teste de ação antiviral das frações (BUI e AQI) e extrato (TI), vindos da Guazuma ulmifolia usando células MT Vírus padrão: isolado NL4-3 (subtipo B, padrão) purificado de passagem em cultura de células MT-4. Título: 103 TCID50 / ml Linhagem celular utilizada: MT-4, linhagem linfocitária estabelecida em cultura, CD4+, expressando co-receptores CCR5 e CXCR4 do HIV-1. Célula formadora de sincício (SI) e muito sensível à infecção pelo HIV-1.

5 3.2.3 Desenho do ensaio: Infecção em placa de 96 poços, contendo 104 células/poço, infectadas com MOI (multiplicidade de infecção) de 0,002 (recomendação do NIH= 0,001 a 0,01). As três amostras (BUI, TI, e AQI) vindos da Guazuma ulmifolia, foram diluídos em DMSO a 20mg/ml e posteriormente diluído em meio base RPMI 1640 para 200µg/ml no primeiro poço das células infectadas previamente com o isolado HIV-1 NL4-3 (subtipo B). Depois as células foram expostas a concentrações decrescentes da droga, a partir de fator de 5 de diluição. O meio de cultura utilizado foi o RPMI 1640 adicionado de 10% de soro fetal bovino, antibióticos estreptomicina/penicilina a 1% e L-glutamina a 0,2mgml. O poço mais concentrado possuía concentração final de 200µg/ml, seguindo-se as diluições sucessivas de 5 vezes como indicado: 40µg/ml, 8µg/ml, 1,6 µg/ml, 0,32µg/ml. No último e nono poço, foi mantido como controle da infecção, sem a presença da droga. Cada linha de 10 poços de infecção foi produzida em sextuplicata, para tratamento estatístico posterior. Um quarto array (linha) de 10 poços de células foi exposto à diluição seriada da droga, como descrito, mas sem a presença de vírus, para análise de citotoxidade da droga, nesta faixa de concentração. A infecção, mantida em estufa CO2 5% a 37 C, foi acompanhada diariamente por microscopia óptica de fase, para análise do aparecimento de sincícios, o que acontece geralmente no quarto dia pós-infecção Revelação do ensaio: A técnica utilizada de coloração CellTiter-Blue Assay da Promega para medida da viabilidade celular, foi utilizada no sexto dia p.i., a fim de permitir a diferenciação de viabilidade celular pós formação de sincício. Após coloração, a placa de 96 poços será lida em fluorimetro 560. Ex. /590. Em. Os resultados foram analisados em matriz Microsoft Excel p/ Windows (Office 98), efetuando-se a correção do branco, e a plotagem em gráfico da

6 frequência de emissão do ensaio (em porcentagem, usando como padrão 100% a emissão de poço de células viáveis sem infecção) como medida da viabilidade celular. O valor de 50% da emissão do padrão foi considerado como ponto de cutoff para o cálculo do EC50 (concentração inibitória da droga em 50% da infecção) após obtenção, no gráfico, da equação da curva de regressão logarítmica (ou semi-logarítmica). Um novo experimento com a amostra Bu1 foi realizado para corroborar os dados anteriores e também confirmar efeito anti-hiv desta amostra.

7 4. Resultados Observam-se abaixo os dados brutos do ensaio com as amostras de Guazuma ulmifolia. Experimento 1: ug/ml MOCK AQ T BU

8 Figura 1: Sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1, TN1, e AQ1. Podese verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 20ug/ml. Experimento 2: Seguem abaixo os dados da repetição do experimento com a amostra Bu1. ug/ml MOCK

9 Figura 2: Repetição do experimento anterior com o extrato BU1. O histograma mostra sobrevivência da célula MT4 infectada com vírus HIV-1 pnl43 com um MOI de 0,01 e simultaneamente a citotoxidade com diferentes concentrações da amostra BU1. Podemos verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 24ug/ml. Repare que a citotoxidade do BU1 ainda é muito alta e encobre o efeito antiviral.

10 5. Conclusões Como visto no primeiro experimento, a amostra com atividade antiviral mais marcante foi a BU1. O segundo experimento, validou e pode-se observar a sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1, TN1 e AQ1. Verifica-se uma proteção parcial das células com a amostra BU1 (30%) na concentração de 20ug/ml. Contudo, a amostra não protegeu a totalidade das células porque ainda há muitos compostos tóxicos na mesma. Há necessidade de purificação a partir da planta in natura para realização e repetição dos testes. Luiz Francisco Pianowski Presidente

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Kyolab, 01 st, June 2012 1. CLIENT'S REGISTRATION DATA NAME: Paulo Antônio Rodrigues Gouveia ADDRESS: Rua Goianesia, nº 78, Conjunto Urbanístico. CITY: Araguaina TO Zip Code: 77818-772 CNPJ/CPF NUMBER: 388.684.581-87 STATE REGISTRATION