determinação do Rh fetal

Transcrição

1 Aplicações da genotipagem para determinação do Rh fetal Dr. José Eduardo Levi

2 HISTÓRICO EXISTEM CÉLULAS C FETAIS CIRCULANTES NO SANGUE MATERNO EM TODAS AS FASES DA GRAVIDEZ (taxas de 1:5.000/ ) TIPOS CELULARES : TROFOBLASTOS, ERITROBLASTOS, LEUCÓCITOS CITOS E STEM CELLS CD34+

3 HISTÓRICO Detection of single-copy fetal DNA sequence from maternal blood. Lo Y-M M et al, Lancet 1990, 33: Prenatal determination of fetal RhD status by analysis of peripheral blood of rhesus negative mothers. Lo Y-M et al, Lancet 1993, 341: Cancer and mutant DNA in blood plasma. Mulcahy HE et al, Lancet 1996, 348: 628. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients. Nawroz H et al, Nature Medicine 1996, 2:

4 HISTÓRICO Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lo Y-M M et al, Lancet 1997, 350: Detection of RhD-specific sequences in maternal plasma. Faas BHW et al, Lancet 1998, 352: Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. Lo Y-M et al., New Engl J Med 1998, 339:

5 EXISTE DNA FETAL LIVRE NO PLASMA MATERNO EM PROPORÇÕES BEM MAIORES QUE A DE CÉLULAS C MATERNAS/FETAIS NO SANGUE PERIFÉRICO. RICO. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Lo Y-M et al, Am J Hum Genet,, 1998, 62: Resultados de 30 grávidas com fetos masculinos 24 plasma, 21 soro, 5 buffy-coat 25.4 genome equivalents/ml (early pregnancy) - 3,4% do total genome equivalents/ml (late pregnancy) - 6,2% do total

6 ESTE DNA FETAL LIVRE PODE SER DETECTADO JÁ NO PRIMEIRO MÊS DE GRAVIDEZ Kinetics of SRY gene appearance in maternal serum: detection by real time PCR in early pregnancy after assisted reproductive technique. Guilbert J et al Human Reproduction,, 18: , 1736, Todas grávidas de meninos. 1 paciente 18 dias 9 pacientes em até 37 dias após s a transferência de embrião.

7 ESTE DNA FETAL LIVRE NO PLASMA MATERNO É RAPIDAMENTE ELIMINADO NA URINA EM ATÉ 48 HORAS APÓS S O PARTO Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Lo Y-M M et al, Am J Hum Genet 1999, 64: grávidas pré-parto parto até 1-42h pós-parto. p parto. Vida média m do DNA fetal circulante = 16 minutos

8 MÉTODO DE PCR O sangue total é centrifugado e o plasma separado em até 2 horas da coleta. O DNA é isolado em duplicatas de 140 μl L de plasma por um método m comercial de extração baseado em microcolunas de sílica. s Uma fração do DNA isolado, correspondendo á 30 μl de plasma é submetido a reação de PCR com primers do gene DYS14, amplificando um fragmento de 198 pares de bases.

9 M 1 a b c d 2 a b c d 3 a b c d 4 a b c d M 5 a b c d 6 a b c d 7 a b c d 8 a b c d

10 Determinação do Rh fetal através de análise do sangue materno OBJETIVOS : 1- Evitar a triagem sistemática tica de mães RhD-negativas para a presença a de anticorpos anti-d. 2- Evitar procedimentos invasivos de monitoração de DHPN. 3- Evitar o uso da vacina anti-d D (imunoprofilaxia( imunoprofilaxia) ) para : - Grávidas submetidas á procedimentos invasivos como amniocentes e biópsia de vilosidade coriônica,, além m de hemorragias. - Grávidas RhD-negativas negativas.

11 OBJETIVOS : IMUNOPROFILAXIA ANTI-D D : Imunobiológico de origem humana. Normalmente administrado em 2 doses, uma na 28 a -30 a semana de gestação, outra logo após s o parto. INCONVENIENTES: - Transmissão de agentes infecciosos - Custo de cada dose é de aproximadamente R$ 210,00 - Baixa oferta

12 Existem 3 mecanismos genéticos levando ao fenótipo D-negativo: Deleção completa do gene RhD Gene RhD-CE-D s antígeno C anormal e ausência do antígeno D um gene híbrido composto pelos exons 1,2,e parte do 3 do gene HD e exons 4-7 do gene RHCE e exons 9 e 10 do RHD. Pseudogene (RhDΨ) Gene RhD inativo que contém 37pb inseridos o exon 4, diversas mutações pontuais no exon 5 e um stop codon na osição 210 (mutação nonsense) do exon 6.

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14 RHDΨ D-negative 37 bp duplication nonsense TAT TAG Tyr stop 66% D-negative Black Africans 24% D-negative African Americans In exon 5, 3 missense mutations (G654C, T667G, C674T) were detected, encoding Met218Ile, Phe223Val, and Ser225Phe substitutions

15 Pseudogene (RhDRhD Ψ ) Pessoas RhDΨ são verdadeiramente D negativos. mrna RHD não é detectado nos eritroblastos destes indivíduos Hemácias desses indivíduos foram testadas por adsorção e eluição e nenhum anti-d foi detectado no eluato.

16 Prevalência do RhDΨ 82 Negros Africanos D-D 66% são RhDΨ, 15% são híbrido h RhD-CE CE-D s associado com VS+V- e 18% apresentam deleção total de D Em Afro-Americanos Americanos D-D 24% tem RhDΨ, 22% tem híbrido h RhD-CE CE-D s associado com VS+V- e 54% apresentam deleção total de D No Brasil Afrodescendentes 14% tem RhDΨ, 3% tem híbrido h RhD-CE CE-D s associado com VS+V- e 83% apresentam deleção total de D. (Castilho et al Braz J Med Biol Res 2002 Jul 35: ). 773). Caucasianos 100% apresentam deleção total de D

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18 Genótipo RHDΨ RhD-CE CE- Ds D- D+ Teste PCR Real-Time Exon 5 NEG NEG NEG POS Exon 7 POS NEG NEG POS

19 Base Molecular dos alelos RH D que codificam o fenótipo D fraco D fraco Tipo Troca Nucleotídeo Nucleotídeo Substituição Amino ácido Posição Exon Posição Membrana Tipo 1 T/G 809 Val /Gly TM Tipo 2 G/C 1154 Gly /Ala TM Tipo 3 C/G C/G Ser /Cys Thr /Arg IC IC Tipo 4 T/G G/A Phe /Val TM - Tipo 5 C/A 446 Ala /Asp TM Tipo 6 G/A 29 Arg /Gln 10 1 IC Tipo 7 G/A 1016 Gly /Glu TM Tipo 8 G/A 919 Gly /Arg IC Tipo 9 G/C 880 Ala /Pro TM Tipo 10 T/C 1177 Trp /Arg IC Tipo 11 G/T 885 Met /Ile TM Tipo 12 G/A 830 Gly /Glu TM Tipo 13 G/C T/A Ala /Pro Ser /Thr TM TM Tipo 14 A/T C/G Lys /Asn Thr /Arg IC IC Tipo 15 G/A 845 Gly /Asp TM Tipo 16 T/C 658 Trp /Arg TM TM:Transmembrana; IC: Intracelular

20 D FRACO E D PARCIAL D FRACO Causado por mutações pontuais no domínio intracelular ou transmembrana que levam à baixa expressão de alguns ou todos epítopos da proteína RhD. D PARCIAL Causado por genes híbridos h RHD/RHCE ou por mutações pontuais no domínio extracelular, levando à ausência de alguns epítopos da proteína RhD.. Pode gerar anti-d, normalmente contra os epítopos non-self.

21 MECANISMO MOLECULAR - RHD MUTAÇÃO PONTUAL DMH: L54P D VII (Tar): L110P D+G- : S103P DFW: H166P DHR: R229K DHMi: T283I DNB: G355S D II : A354D DNU: G353R D IIIa D IIIb D IIIc D IVa tipo I D IVb tipo II D IVb tipo III D IVb tipo IV D Va tipo I D Va tipo II D V tipo III D Va tipo IV D V tipo V REARRANJO GÊNICO N152T T201R F223V L62F N152T D350H D350H G353W A354N F223V E233Q F223V 229P E233Q V238M E233Q E233K ASSOCIAÇÃO G- Go a (Evans) D w D w E parcial D w

22 POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA TÉCNICA QUANTITATIVA?

23 POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA TÉCNICA QUANTITATIVA?

24 DNA leucócitos Ct = 23.2 DNA plasmático indivíduo Rh+ Ct = 27.1 DNA plasmático grávida RhD-/Feto RhD+ Ct = 31.2

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27 A clinical service in the UK to predict fetal Rh (Rhesus( Rhesus) ) D blood group using free fetal DNA in maternal plasma. Finning K, Martin P and Daniels G. Annals of the New York Academy of Sciences June 2004, 1022: Conclusões : A determinação do Rh fetal pelo plasma materno foi introduzida no Reino Unido em 2001 como rotina, em substituição a realizada a partir de líquido amniótico ou vilosidade coriônica, levando em 3 anos a uma queda acentuada nos procedimentos invasivos para esta finalidade.

28 Controle da presença de cffdna

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30 Método: : Extração automatizada (tubo primário) rio) no MDx Bio Robot (Qiagen) Amplificação ão: : Triplicata da reação éxon5/ xon5/éxon7xon7 e simplicata do Gene CCR5 (DNA total), em PCR em Tempo Real (ABI Prism 7900HT)

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33 TRANSFUSION NOV (11)

34 Método: : Extração manual com kit Viral (Qiagen) Amplificação ão: : Duplicata da reação éxon5/ xon5/éxon7xon7 e simplicata do Gene Beta-globina (DNA total), em PCR em Tempo Real (ABI 7300) TRANSFUSION NOV (11)

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37 RESULTADOS: 1022 grávidas RhD- com resultados de sangue de cordão. 662 D+(64.8%) e 360 D-(35.2%) D 12 discrepâncias (1.2%). 6 falso-negativos do PCR 3 falso-positivos do PCR 3 falso-positivos da sorologia (2 D fraco tipo 2 um D+ normal) Sensibilidade = 99.7% Especificidade = 99.2% VPP = 99.5% VPN = 99.4% TRANSFUSION NOV (11)