Los mecanismos moleculares responsables de la expresión de los antígenos de los grupos sanguíneos. Lima, 26/02/2016.

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1 Los mecanismos moleculares responsables de la expresión de los antígenos de los grupos sanguíneos Lima, 26/02/2016 Lilian Castilho

2 Mecanismos moleculares associados à expressão dos Antígenos de grupos sanguíneos Um antígeno de grupo sanguíneo é um carboidrato ou uma proteína que induz uma resposta imune e, o anticorpo produzido reage com o antígeno de alguma forma observável Diferenças em carboidratos e proteínas na superfície externa da membrana eritrocitária formam a base dos o principal aspecto da Imunohematologia O conhecimento sobre as principais variações na membrana eritrocitária é utilizado para detectar e identificar anticorpos, o que assegura que o sangue correto será transfundido ao paciente correto

3 Inserção dos na membrana P1PK GPA/GPB (MNS) GPC/GPD (GE) CD239 (LU) ICAM-4 (LW) ERMAP (SC) CD44 (IN) CD99 (XG) CD147 (OK) CD35 (KN) SIMP1(VEL) ABO H LE I GLOB FORS CD238 (KEL) NH 2 NH 2 COOH AQP-1 (CO) NH 2 DARC (FY) Banda 3 (DI) RhD/RhCE (RH) RhAG (RHAG) Kx (XK) UT-B (JK) AQP-3 (GIL) CD151 (RAPH) ABCG2 (JR) ABCB6 (LAN) Augustine (AUG) AChE (YT) ART4 (DO) CD55 (CR)) CD108 (JMH) MIRL (CD59) Outside COOH NH 2 COOH NH 2 Passagem Passagem Passagens Carboidrato única única múltiplas Reid, 2012 Tipo I Tipo II COOH Ligados à GPI

4 Sistemas de grupos sanguíneos e seus cromossomos

5 Mecanismos moleculares associados à expressão dos Sistemas de grupos sanguíneos

6 Mecanismos moleculares associados à expressão dos Biologia molecular de grupos sanguíneos O conhecimento sobre as principais alterações dos genes que codificam os e que mudam sua composição de aminoácidos está sendo atualmente utilizado para identificar antígenos, o que também pode assegurar que o sangue correto será transfundido ao paciente correto Métodos moleculares têm se mostrado ferramentas úteis Esta prática pode gerar um sistema eficiente que minimizará os riscos imunes associados à transfusão sanguínea É importante conhecer os mecanismos moleculares associados à expressão dos

7 Relação entre o genoma humano e a expressão dos o numero de nucleotídeos que compõem o genoma humano o número de genes representado no genoma humano 346 número de 308 = número de antígenos nos 36 sistemas de grupos sanguíneos 3 = número de nucleotídeos que compõem um códon 1= numero mínimo de alteração de nucleotídeos necessário para expressão de um antígeno de grupo sanguíneo (mais comum) O sistema imune está preparado para reconhecer pequenas variações nas estruturas de proteína ou carboidrato na distinção entre self e não self"

8 Mecanismos moleculares que dão origem aos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Inserções e deleções de nucleotídeos (Indels) Deleções de genes Duplicação de genes Conversão gênica Genes reguladores e modificadores

10 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões codificadoras (exons) SNPs missenses: troca de um nucleotídeo que resulta na troca de um aminoácido SNPs nonsenses: troca de um nucleotídeo que resulta em um stop codon (TAA,TAG,TGA) SNPs silenciosos: não alteram a sequência de aminoácidos mas podem ativar sítios de splice críticos

11 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões codificadoras (exons) SNPs missenses: maioria dos antígenos comuns K/k 578T>C KEL 8 Intramembrane domain NH 2 Met193Thr Met193 = K Thr193k COOH H E L L H Reid & Lomas-Francis The blood group antigen factsbook, 2 o ed. Slide modified from ES Wester et al. Transfusion 2005,45:545

12 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões codificadoras (exons) SNPs missenses: afetam a quantidade de proteína incorporada na membrana eritrocitária -67T GATA FY*B 125A FY*X 265T Fy b Fy x R89C

13 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Regiões codificadoras (exons) SNPs missenses: expressão de novos antígenos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões codificadoras (exons) SNPs missenses: expressão de novos antígenos C733G RHCE*ce Antígeno VS L245V. Rhce

14 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões codificadoras (exons) SNPs nonsenses: troca de um nucleotídeo que resulta em um stop codon (TAA,TAG,TGA) Gln474Stop C>T Stop! No protein synthesis T A C KEL Intramembran e domain NH 2 H E L L H COOH Do null DO

15 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões codificadoras (exons) SNPs silenciosos: não alteram a sequência de aminoácidos mas podem afetar sítios de splice críticos. Ex: RHD*DEL1227G>A (K409K) A T G Lys409Lys

16 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões não codificadoras SNPs em sequências conservadas de sítios de splice (gt, ag): causam splicing alterados com remoção de exons SNPs em regiões regulatórias: podem afetar a transcrição do gene SNPs em íntrons

17 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões não codificadoras SNPs em sequências conservadas de sítios de splice (gt, ag): causam splicing alterados com remoção de exons. Ex: S-s-U var g>t GYPB normal (S+/s+) GYPB variante (S s ) Remoção completa do exon 5 do gene GYPB : Nenhum antigeno presente na superfície da hemácia

18 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões não codificadoras SNPs em regiões regulatórias: podem afetar a transcrição do gene. Ex: Fy(a-b-) em Africanos Complexo de transcrição reconhece o motivo GATA Transcrição segue -67 tatc GATA-1 Sinal de transcrição eritróide específico 125G>A (Fy a / Fy b )

19 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões não codificadoras SNPs em regiões regulatórias: podem afetar a transcrição do gene. Ex: (Fy(a-b-) em Africanos Complexo de transcrição Não reconhece o motivo GATA Transcrição Fy b Fy(a-b-) -67 tacc GATA-1 Sinal de transcrição eritróide específico 125G>A (Fy a / Fy b ) Genótipo:FY*B/FY*B Fenótipo: Fy(a-b-) Não fazem anti-fy b

20 Eventos moleculares que dão origem aos antígenos de grupos sanguíneos Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) Regiões não codificadoras SNP em intron levando a perda do reconhecimento de um sítio de splice GT.GA Alelo 1 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 mrna Proteina Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 JK intron 5 JK*A Jk a Alelo 2 Exon 5 GT AA Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 mrna Exon 5 Intron 5 Exon 6 Proteina DNA: JK*A/JK*B Hemácias: Jk(a+b-) Proteina truncada Podem fazer anti-jk b JK*B

22 Mecanismos moleculares que dão origem aos Inserções e deleções de nucleotídeos (Indels) Inserção de nucleotídeos RHD Inserção de 37 pb na junçãointron 3/exon 4 3 mutações missenses no exon 5 M218I, F223V, S225F Stop codon prematuro no nt 269. Quadro de leitura Nenhum transcrito detectado Nenhum RhD na superfície das hemácias Podem fazer anti-d

23 Mecanismos moleculares que dão origem aos Inserções e deleções de nucleotídeos (Indels) Deleção de nucleotídeos DNA ATG TAA mrna c.64_80del p.ser22fs Vel neg Alelo A Fenótipo A 1 NH aa COOH 261ΔG Alelo O 1 Fenótipo O 1 NH aa COOH

25 Mecanismos moleculares que dão origem aos Deleção de genes RHD TMEM50A RHCE b RHD TMEM50A RHCE Deleção de RHD: D TMEM50A RHCE + b RHD RHD TMEM50A RHCE

27 Mecanismos moleculares que dão origem aos Duplicação de genes Nova proteína - Dantu M/N S/s GYPA GYPB GYPA GYPB GYPA GYPB GYPA GYPB GYPAB híbrida

29 Mecanismos moleculares que dão origem aos Conversão gênica Rhesus box Rhesus box RHD SMP RHCE 5' 3' 3' 5' 5' RHCE RHD 3' SMP Genes híbridos: proteínas híbridas D parcial (D IVb, D VI, DBT) Fenótipos D, Dc, r s Antígenos de baixa incidência 5' 3' Direção do gene

31 Mecanismos moleculares que dão origem aos Genes reguladores Ex: Rh null tipo regulador LW CD47 GYPA/B RhCE RhAG RhD Band 3 LW CD47 GYPA/B RhCE RhAG RhD Band 3 D+, C+, c+, E+, e+ D-, C-, c-, E-, e- Produto do gene RHAG é necessário para expressão das proteínas Rh

32 Mecanismos moleculares que dão origem aos Ex: Fenótipo McLeod Genes reguladores Interação entre as proteínas Kell e Kx na membrana eritrocitária Produto do gene XK é necessário para expressão das proteínas Kell

33 Mecanismos moleculares que dão origem aos Genes modificadores Lu(a-b-) do tipo dominante = In(Lu) Gene KLF1 codidifica o fator eritroide Kruppel like (EKLF). Localizado no cromossomo 19p13, constituído por 3 éxons. KLF Alterações de nucleotídeos no gene KLF1 em heterozigoze inibem a expressão dos ags Lu: fenótipo Lu(a-b-) ou In(Lu), genótipo: LU*B/LU*B Ags P1, In b, AnWJ: expressão diminuida LU LU*B/LU*B Genótipo: LU*B/LU*B Fenótipo: Lu(a-b-) Podem fazer anti-lu b

34 Mecanismos moleculares que dão origem aos Sumário SNPs são as alterações de nucleotídeos mais comuns que levam à expressão dos Erros na replicação do DNA podem gerar novos antígenos de grupos sanguíneos Alterações de nucleotídeos são herdadas e responsáveis pela expressão dos antígenos Este conhecimento facilita o desenvolvimento de ensaios para genotipagem de grupos sanguíneos

35 Mecanismos moleculares que dão origem aos Conclusões A utilização de métodos moleculares em Imunohematologia necessita do conhecimento das bases moleculares dos antígenos de grupos sanguíneos, de treinamento apropriado do pessoal técnico e de programas de proficiência para garantir resultados confiáveis e assegurar que o sangue correto será transfundido ao paciente correto As plataformas de genotipagem são uma grande conquista atual Uma das grandes promessas para o futuro é a técnica de next generation sequencing que tem a capacidade de sequenciar muitas regiões do genoma em um único ensaio para vários indíviduos

36 Mecanismos moleculares que dão origem aos