ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE FOLHAS DE LOURO Laurus nobilis L. FRENTE ÀS BACTÉRIAS Escherichia coli E Salmonella enteritidis.

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1 CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES CURSO DE GRADUAÇÃO EM QUÍMICA INDUSTRIAL ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE FOLHAS DE LOURO Laurus nobilis L. FRENTE ÀS BACTÉRIAS Escherichia coli E Salmonella enteritidis. João Carlos Luzzi Lajeado, dezembro de 2010.

2 João Carlos Luzzi ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE FOLHAS DE LOURO Laurus nobilis L. FRENTE ÀS BACTÉRIAS Escherichia coli E Salmonella enteritidis. Monografia apresentada na disciplina de Tabalho de Conclusão, do Curso de Química Industrial, como parte da exigência para obtenção do título de Bacharel em Química Industrial. Orientador: Eduardo Miranda Ethur Lajeado, dezembro de 2010.

3 AGRADECIMENTOS Meus sinceros agradecimentos a todos que fizeram parte de mais esta etapa de minha vida. A meus pais, Félix e Nercy, pelo apoio e confiança que nunca deixaram de dar em todos os momentos. A minha esposa, Fabiane, que nunca deixou de acreditar e confiar em min sempre me apoiando e entendendo. A minha filha, Michele, que nesta última etapa veio trazer mais felicidade e ânimo para concluir o curso. A empresa Fontana S.A. que muito me ajudou propiciando apoio técnico em muitos momentos e possibilitando aplicabilidade de muitos conhecimentos adquiridos ao longo do curso. Ao Sr. Rogério Dorigon representante da empresa R.R. Indústria e Comércio de Alimentos Ltda que nesta última etapa (TCC) foi fundamental para que o estágio fosse concluído. Desde o início e em nenhum momento o Sr. Rogério deixou de me dar condições para que o trabalho fosse feito adequadamente. análises. A Natália (laboratório Univates) que me deu apoio durante a realização das A todos os professores que fizeram parte desta caminhada. Em especial a meu orientador, professor Eduardo Miranda Ethur pelo apoio, paciência, dedicação e confiança que foram fundamentais para que este trabalho fosse realizado. A todos, muiiiiiito obrigado!!!!!

4 RESUMO Apesar da variedade de especiarias e condimentos que possuem atividade antimicrobiana (pimenta, alho, cravo, canela, orégano e louro entre outros) ser grande, suas atividades não se dão de forma irrestrita e linear. Fatores ligados as características do alimento e do microrganismo atuante interferem diretamente na atuação desta substância antimicrobiana. Desta forma, neste trabalho, foram realizados testes para a verificação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico de folhas de louro (Laurus nobilis L.) frente às bactérias Escherichia coli e Salmonella enteritidis. Realizados os testes de CIM (concentração inibitória mínima) verificou-se que o extrato não possui atividade antimicrobiana nas concentrações testadas frente a estas bactérias. Conforme verificado em outros trabalhos e pesquisas, estas bactérias Gram-negativas também apresentaram baixa (ou nenhuma) sensibilidade as substâncias antimicrobianas do louro ou de outros condimentos. O forte odor, cheiro e coloração verde escura intensa da folha natural foi verificada no extrato. PALAVRAS-CHAVE: Atividade antimicrobiana, extrato etanólico de folhas de louro (Laurus nobilis L.), bactérias Gram-negativas.

5 LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE FIGURAS Figura 1 Extrato etanólico amostra íntegra...44 Figura 2 Extrato etanólico amostra desidratada...44 Figura 3 Placas de CIM da primeira etapa após aplicação TTC...47 Figura 4 Placas de CIM da segunda etapa após aplicação TTC...48 Figura 5 Placa de confirmação de crescimento...51 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Surtos de DTA por sorovar de Salmonella...26 Gráfico 2 Surtos de DTA por microrganismo causador...30

6 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Principais parâmetros intrínsecos e extrínsecos que afetam o crescimento microbiano...15 Tabela 2 Valores mínimos aproximados de a w para o crescimento microbiano...16 Tabela 3 Microrganismos mais freqüentes causadores de DTA Tabela 4 - Alimentos causadores de DTA mais freqüentes Tabela 5 Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo Escherichia coli Tabela 6 Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo Samonella enteritidis....46

7 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS Microrganismos deteriorantes Fatores intrínsecos e extrínsecos Fatores intrínsecos Atividade de água (a w ) ph Potencial de oxi-redução Composição química Fatores antimicrobianos naturais Interações entre microrganismos Fatores extrínsecos Temperatura ambiente Umidade relativa do ambiente Composição gasosa do meio Conceito de obstáculos de barreiras DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS Salmonella enteritidis Escherichia coli...27

8 3.3 Avaliação da atividade antimicrobiana A INDÚSTRIA DE PRODUTOS CÁRNEOS Condimentos e especiarias Louro uma erva condimentar MATERIAIS E MÉTODOS Material vegetal Extração do extrato etanólico Avaliação da atividade antimicrobiana Procedimentos RESULTADOS E DISCUSSÕES CONCLUSÃO...53 REFERÊNCIAS...54

9 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS Nas últimas décadas, o homem tem passado por mudanças e transformações profundas em seu estilo de vida. Até poucos anos atrás os consumidores, de modo geral, não observavam conceitos ecológicos ou naturais nos produtos muito menos características ou composição química dos alimentos. Atualmente, estes conceitos já deixaram de ser um simples modismo e estão totalmente absorvidos na cultura do consumidor de modo que estes fatores podem ser perfeitamente os responsáveis pelo sucesso ou fracasso de um produto junto ao consumidor. Esta realidade na qual o consumidor exige cada vez mais alimentos nutricionalmente balanceados e sobretudo com elevado grau de segurança tem feito com que cada vez mais busquem-se novas tecnologias de processamento e sobretudo substâncias naturais que possibilitem diminuir ou minimizar a utilização de substâncias sintéticas utilizadas principalmente para a conservação dos alimentos. É neste contexto que a utilização de compostos ou substâncias naturais provenientes de condimentos ou especiarias vem despertando cada vez mais interesse. Apesar deste interesse recente, vários relatos históricos confirmam a utilização de condimentos desde a Idade Média quando eram utilizados principalmente para realçar e potencializar sabores e aromas nos alimentos (BAKKALI et al., 2008). Atualmente sabe-se que além destas qualidades, alguns destes condimentos possuem atividade antimicrobiana que atuam evitando possíveis degradações devido às contaminações microbianas nos alimentos possibilitando assim prolongar a validade do alimento e tornando-o mais seguro. (SHAN et al., 2007).

10 9 A segurança alimentar, além do fator relacionado a utilização de substâncias naturais, é observada e questionada pelo consumidor no dia-a-dia quando observase cada vez mais casos e surtos de intoxicações alimentares causadas por microrganismos patogênicos devido a deterioração dos alimentos (MARINO et al., 2001). No Brasil, conforme dados da Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde (SVS/MS), de 1999 à 2009 foram registrados surtos de doenças transmitidas por alimentos (DTA) envolvendo a contaminação de aproximadamente pessoas. Estes dados somente reforçam a necessidade da utilização de substâncias naturais ou sintéticas a fim de conservar-se o alimento da melhor forma possível. Neste contexto, a seleção e aplicação da melhor substância de origem natural torna-se um desafio pois a complexidade do alimento, suas propriedades químicas e físicas e os microrganismos que possam estar presentes naturalmente (ou não) no alimento podem influenciar diretamente nas propriedades antimicrobianas destas substâncias. Assim, pesquisas e testes envolvendo estes compostos naturais mostram-se de extrema importância. 1.1 Objetivo geral Fazer a verificação da eficiência antimicrobiana do extrato etanólico de folhas de louro (Laurus nobilis L.) frente aos microrganismos Escherichia coli e Salmonella enteritidis. 1.2 Objetivos específicos - Verificar se ocorrem diferenças de atuação entre uma amostra de folhas de louro colhida recentemente e outra de amostra comercial de folhas desidratadas; - Realizar os testes de concentração inibitória mínima (CIM) e verificar a eficiência do extrato frente as bactérias;

11 MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS Desde o início da civilização humana, o homem conviveu com os microrganismos presentes naturalmente nos alimentos apesar de em grande parte de sua história desconhecer ou ignorar estes microrganismos. A partir do momento em que o homem deixou de ser nômade e que a necessidade de plantar, produzir, conservar e armazenar seu próprio alimento tornou-se indispensável, os problemas decorrentes destas necessidades também surgiram. Acredita-se que as doenças transmitidas por alimentos, principalmente devido à conservação tenham iniciado juntamente neste período (JAY, 2005). A partir destas necessidades antigas, o homem passou a preparar e manipular o alimento buscando uma melhor conservação deste. Atualmente sabe-se de evidências sobre a existência de ordenha de vacas datadas de a.c., de relatos que indicam que na Babilônia antiga (7.000 a.c.) o homem já fabricava a cerveja e que os sumérios (3.000 a.c.) foram os primeiros criadores de gado de corte e leite tendo sido os primeiros a fabricar a manteiga. Nesta época também, judeus, chineses e gregos, utilizavam o sal para conservação dos alimentos e os romanos (1.000 a.c.) utilizavam a neve para conservação da carne e frutos do mar (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Apesar destas técnicas e métodos inovadores, o conhecimento a respeito dos mecanismos e agentes causadores das doenças alimentares não evoluiu tão rapidamente. Durante a Idade Média, milhares de pessoas morreram de ergotismo devido não saber-se que o fungo que produz esta toxina cresce em cereais. Apesar disto, procedimentos de limpeza e higiene no preparo e manipulação de alimentos

12 11 demoraram muito para serem implantados e exigidos (por volta do século XIII). A partir disto, em A. Kircher teria sido a primeira pessoa a sugerir a deterioração dos alimentos por microrganismos; em L. Spallanzani através de experimentos (caldo de carne fervido em recipiente fechado) desmentiu a teoria da geração espontânea mantendo o alimento em condições de consumo por muito mais tempo, mas, somente em o confeiteiro François Nicolas Appert aprimorou e comprovou esta técnica conservando carne em recipientes de vidro que foram fervidos em água por longos períodos. Este processo, com muitos aprimoramentos nas técnicas é à base dos processos atuais de enlatamento de alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Apesar de todos os experimentos atuarem diretamente sobre os microrganismos (inativando-os), foi o médico francês L. Pasteur o primeiro cientista a analisar e descrever a importância dos microrganismos nos alimentos quando em este observou e demonstrou que o azedamento do leite era causado por microrganismos. Após isto, em o mesmo L. Pasteur utilizou calor para inativar microrganismos indesejáveis no vinho e cerveja, processo que, mais tarde foi denominado de pasteurização (JAY, 2005). A partir destes eventos, a ciência e o homem passaram a avaliar e estudar os mais diversos microrganismos e as implicações positivas ou negativas que estes possuíam na conservação dos alimentos. Desta forma, novas técnicas e processos foram criados e aprimorados, indústrias de processamento e matérias primas surgiram além de indústrias químicas e de aditivos (naturais ou sintéticos) que vem desenvolvendo-se de forma extremamente rápida (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Da mesma forma que a população mundial cresce, o interesse pelos microrganismos ligados aos alimentos também cresce. Pode-se dizer que os microrganismos estão diretamente ligados à disponibilidade, quantidade e qualidade dos alimentos disponíveis ao homem (PELCZAR et al., 1997). Atualmente, sabe-se que a interação que ocorre entre os microrganismos e o alimento pode ser benéfica ou maléfica podendo desta forma, ser divididos em três grandes grupos:

13 12 - Microrganismos causadores de modificações químicas prejudiciais que resultam em deteriorações microbianas podendo causar alterações de cor, odor, sabor, textura e aspecto do alimento. Estes tipos de alterações ocorrem naturalmente devido ao metabolismo dos microrganismos que utilizam o substrato do alimento como fonte de energia; - Microrganismos patogênicos que podem causar doenças tanto no homem quanto em animais. Em geral, estes microrganismos chegam ao alimento devido a condições precárias de produção, armazenamento, distribuição ou manipulação; - Microrganismos que causam modificações positivas no alimento alterando características originais. Estes tipos de microrganismos estão presentes naturalmente ou são adicionados propositalmente ao substrato para que uma série de reações ocorram. Muitas vezes é necessário apenas estimular seletivamente (temperatura, ph, tempo) para que estas reações ocorram (FRANCO; LANDGRAF, 2008). 2.1 Microrganismos deteriorantes A contaminação microbiana dos alimentos, quando ocorre, apresenta diferencialmente uma característica: o alimento (ou substrato) serve como meio de cultura para o microrganismo desenvolver-se e multiplicar-se. Isto pode ser comparado com a inoculação de um determinado microrganismo em um meio de cultura com caldo nutriente ou um ágar (PELCZAR et al., 1997). Ocorrida a contaminação, os microrganismos atuam de duas formas distintas: multiplicam-se no alimento obtendo deste os nutrientes essenciais para a sua proliferação ou utilizam o alimento apenas como um veículo para a sua disseminação para outros indivíduos. As contaminações alimentares podem ocorrer de duas maneiras distintas: direta quando a contaminação ocorre nos tecidos animais ou vegetais ainda vivos (antes do abate ou colheita) ou indireta quando a contaminação ocorre após o abate ou colheita do alimento (EVANGELISTA, 2002). Em geral, os alimentos na sua forma natural, possuem pouca ou nenhuma carga microbiana prejudicial a estes de modo que, em sua grande maioria, carregam

14 13 em seu interior ou na sua superfície floras normais e específicas que não lhes causam prejuízos. Porém, a partir do momento do abate ou colheita, o alimento perde suas defesas naturais permitindo que microrganismos estranhos e oportunistas passem a se utilizar deste substrato para desenvolver-se ou promover a sua destruição. Em geral, a contaminação microbiana do alimento não ocorre por uma condição específica mas, por uma série de condições e fatores que possibilitam que este contaminante predomine ou cresça. Condições como a composição química (lipídios, carboidratos, proteínas, água), processos de moagem ou trituração, condições de temperatura, umidade e ph, carga microbiana pré-existente, manipulações inadequadas e condições inadequadas de conservação, armazenagem ou de transporte são fatores que influenciam diretamente na contaminação do alimento (EVANGELISTA, 2002; EVANGELISTA, 2008). Apesar deste conjunto de fatores preponderantes, os microrganismos apresentam como principais fontes de contaminação e disseminação: - Solo e água: os microrganismos presentes nestes meios apresentam características em comum. Através de um ciclo contínuo (solo água solo) faz com que os microrganismos sejam quase sempre os mesmos com algumas poucas exceções como as Alteromonas spp. que necessitam da salinidade do mar para sobreviverem, - Plantas: alguns microrganismos possuem formas de fixação às planta possibilitando que obtenham nutrientes necessários para sua sobrevivência. São denominados fitopatogênicos isto é, causadores de doenças as plantas, - Utensílios: a contaminação cruzada (de um alimento para outro) por falta ou higienização inadequada representa uma das principais fontes de contaminação. Utensílios como bandejas, recipientes, facas, tábuas, espátulas, mesas e moedores entre outros são os principais causadores de contaminações, - Manipuladores de alimentos: a flora microbiana de mãos e roupas (principalmente) pode ser bastante vasta em quantidade e variedade. Microrganismos presentes na água, solo, poeira ou ar além das fossas nasais, boca e trato gastrintestinal em condições de falta de higiene podem facilmente contaminar as mãos dos manipuladores;

15 14 - Rações animal: representa um importante ponto de controle uma vez que é uma das principais fontes de contaminação nos animais. A Salmonella, principalmente em aves e a Listeria monocytogenes em silagens são exemplos; - Pele dos animais: principal fonte de contaminação do leite. Em condições precárias de higiene, os microrganismos presentes naturalmente na pele e úbere do animal podem facilmente contaminar produto, manipuladores e ambiente; - Ar e pó: bactérias Gram-positivas e fungos são as principais fontes de contaminação (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Ocorrida a contaminação e degradação do alimento, estes geralmente passam a apresentar sabores e odores desagradáveis devido a substâncias voláteis produzidas pelos microrganismos e que podem ser facilmente detectadas pelo olfato e paladar humano. A degradação do alimento está relacionada com qualquer modificação de suas características que torne este inaceitável para o consumo humano. Estas modificações não estão relacionadas somente com os microrganismos, mas também com danos causados por insetos, danos físicos devido a batidas, congelamento, secagem, atividade de enzimas dos próprios tecidos animais e vegetais ou mesmo alterações químicas que não são induzidas por microrganismos. Além do aspecto visual, outra conseqüência da deterioração é a diminuição da vida de prateleira do alimento (FORSYTHE, 2002). 2.2 Fatores intrínsecos e extrínsecos Seja desde a colheita, o abate, o processamento ou manipulação do alimento, estes além de uma carga microbiana inicial presente naturalmente, são expostos a uma série de etapas e processos (processamento, embalagem, estocagem, distribuição) que se não bem controlados podem facilmente desencadear os mecanismos deteriorantes. Devido a tudo isto, quais os microrganismos que irão predominar ou quais reações químicas ou bioquímicas irão acontecer depende de uma série de fatores intrínsecos e extrínsecos (TABELA 1) próprios de cada alimento (FORSYTHE, 2002). Os fatores extrínsecos estão relacionados com as interações entre o alimento e o meio ambiente e os fatores

16 15 intrínsecos representam as características próprias de cada alimento (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Tabela 1 Principais parâmetros intrínsecos e extrínsecos que afetam o crescimento microbiano. Parâmetros intrínsecos Atividade de água ph potencial de oxi-redução composição química fatores antimicrobianos naturais interações entre microrganismos Fonte: Adaptado de Franco, (2008) Fatores intrínsecos Parâmetros extrínsecos temperatura ambiente umidade relativa do ambiente composição gasosa do meio conceito de obstáculos de barreiras Estes fatores estão relacionados com as características do próprio alimento e as interações que estas sofrem Atividade de água (a w ) A atividade de água representa um fator essencial para os microrganismos pois estes necessitam de água não só para a sua sobrevivência mas também para o seu metabolismo e multiplicação. Para que a água possa ser utilizada pelo microrganismo esta não pode estar ligada a outras moléculas por forcas físicas (água ligada) ficando assim disponível para atuar como solvente e participar de reações químicas e conseqüentemente ser utilizada pelos microrganismos (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Os valores de a w variam de 0 a 1 (água pura é 1,0) sendo que os microrganismos possuem valores máximos, mínimos e valores ótimos para a sua multiplicação (TABELA 2). A adição de quaisquer sais, açúcares ou outros solutos ou processos como desidratação, secagem e congelamento reduzem a a w do alimento (FORSYTHE, 2002; FRANCO; LANDGRAF, 2008).

17 16 Tabela 2 Valores mínimos aproximados de a w para o crescimento microbiano. Microrganismos atividade de água Clostridium botulinum, tipo E 0,97 Pseudomonas spp. 0,97 Acinetobacter spp. 0,97 Echerichia coli 0,96 Enterobacter aerogenes 0,95 Bacillus subtilis 0,95 Clostridium botulinum, tipos A e B 0,94 Candida utilis 0,94 Salmonella spp. 0,94 Vibrio parahaemolyticus 0,94 Rhizopus stolonifer 0,93 Mucor spinosus 0,93 Fonte: Adaptado de Jay, (2008 p.58). Geralmente, um valor mínimo de a w não é indicação de que o microrganismo morrerá (mesmo que ocorra com algumas colônias). Nestes casos o que ocorre é uma diminuição da fase de multiplicação, aumento da fase de crescimento e consequentemente uma queda na população final (FORSYTHE, 2002) ph Valores de ph perto da neutralidade (6,5 a 7,5) são os mais favoráveis a maioria dos microrganismos para a sua multiplicação. Porém, microrganismos como bactérias lácticas são favorecidas pelo meio ácido (inibição de microrganismos competidores), bolores e leveduras são mais tolerantes ao ph enquanto que os microrganismos patogênicos são os menos tolerantes a variação de ph. Assim como na a w, o ph adverso provoca um aumento na fase lag de multiplicação. A capacidade de multiplicação destes microrganismos irá depender da sua habilidade em adaptar-se e modificar o ph desfavorável. Em ph ácidos, mecanismos internos produzem substâncias que aumentam o ph externo, em ph básico são produzidas substâncias que diminuem o ph (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Geralmente na deterioração de alimentos, devido a formação de diversos compostos e substâncias, o meio que antes era totalmente favorável ao

18 17 desenvolvimento do microrganismo torna-se desfavorável diminuindo seu ritmo de crescimento (EVANGELISTA, 2008) Potencial de oxi-redução O potencial de oxi-redução (Eh) está relacionado com a capacidade que determinado substrato possui em ganhar ou perder elétrons. A perda de elétrons indica uma oxidação (valores de Eh positivo) e o ganho indica uma redução (valor de Eh negativo). Em geral, os microrganismos aeróbios (bolores, leveduras, Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, entre outras) necessitam de valores positivos de Eh para desenvolver-se, microrganismos anaeróbios como Clostridium botulinum e Desulfotomaculum nitrificans necessitam de valores baixos de Eh, bactérias como lactobacilos e estreptococos desenvolvem-se em situações levemente reduzidas (microaerófilas) e bactérias denominadas anaeróbias facultativas desenvolvem-se em condições de anaerobiose quanto aerobiose (família Enterobacteriaceae) (FRANCO; LANDGRAF, 2008; JAY, 2005) Composição química Basicamente, para o microrganismo desenvolver-se satisfatoriamente o substrato deve possuir: água, fonte de energia, fonte de nitrogênio, vitaminas e sais minerais. Em sua grande maioria, açúcares, álcoois e aminoácidos fornecem a energia, o nitrogênio também é fornecido por aminoácidos e outras substâncias nitrogenadas (nucleotídeos, peptídeos e proteínas complexas), as vitaminas (as mais importantes são as do complexo B, a biotina e o ácido pantotênico) são sintetizadas pela maioria dos microrganismos e os minerais (Na, K, Ca e Mg) apesar de serem necessários em quantidades muito pequenas são indispensáveis uma vez que são necessários em reações enzimáticas (FRANCO; LANDGRAF, 2008) Fatores antimicrobianos naturais Na constituição química dos alimentos, em alguns casos estes possuem substâncias naturais capazes de inibir o crescimento de alguns microrganismos. Algumas espécies (especialmente vegetais) possuem óleos essenciais que agem

19 18 também como agentes antimicrobianos. Pode-se citar o eugenol (no cravo), alicina (no alho), aldeído cinâmico e eugenol (na canela), o acil-isotiocianato (na mostarda) e timol e isotimol (no orégano). Além destes, a clara do ovo é rica e lisozima (enzima) que é muito ativa contra bactérias Gram-positivas e no leite temos a lactoferrina que também possui atividade antimicrobiana. Além de substâncias presentes na constituição química dos alimentos, existem as estruturas que pode-se denominar de barreiras mecânicas que fornecem uma excelente proteção contra o ataque de microrganismos. Pode-se citar as cascas de nozes, de frutas diversas, de ovos e a pele de animais (JAY, 2005) Interações entre microrganismos A produção de metabólicos por certos microrganismos muitas vezes é capaz de afetar a sobrevivência e a multiplicação de outros microrganismos presentes no mesmo ambiente. Como exemplo, pode-se citar as bactérias lácticas que alteram o ph do meio tornando-o ácido demais e impróprio para o crescimento de uma série de outras bactérias mas por outro lado algumas bactérias também são capazes de produzir enzimas que propiciam o aumento do ph do meio e da mesma forma inibem o desenvolvimento de outros microrganismos (JAY, 2005). Assim como estas substâncias produzidas são capazes de inibir o crescimento e desenvolvimento de certos microrganismos, algumas destas substâncias são essenciais para outras. Pode-se citar a tiamina e o triptofano produzidas pela Pseudomonas aeroginosa que são essenciais para o Staphylococcus aureus (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Além destes compostos, alguns microrganismos específicos produzem substâncias denominadas de bacteriocinas que também possuem atividade bactericida. As bactérias de maior interesse nesta área são as lácticas que produzem uma série de bacteriocinas porém, uma das poucas com uso aprovado em alimentos pelo FDA (Food and Drug Administration - USA) é a nisina que é produzida por Lactobacillus lactis spp. lactis. Esta substância é ativa contra o desenvolvimento de microrganismos Gram-positivos (sobretudo esporulados) mas é ineficaz contra fungos e bactérias Gram-negativas (JAY, 2005).

20 19 Outra maneira de interação de microrganismos visando a proteção do alimento é promover a competição entre a flora bacteriana presente. Pode-se adicionar ao produto algum microrganismo inócuo, mas que de alguma forma irá competir com os microrganismos patogênicos ou deteriorantes reduzindo a sua população ou até mesmo eliminando-os. Este mecanismo é muito utilizado para evitar-se a contaminação de aves por Salmonella e Campylobacter (FRANCO; LANDGRAF, 2008) Fatores extrínsecos Estes fatores estão relacionados com as interações entre o alimento e o meio ambiente onde este se encontra Temperatura ambiente A temperatura ambiente é o fator extrínseco que mais afeta a propagação dos microrganismos. Assim como para a maioria dos fatores, para a temperatura os microrganismos possuem um valor mínimo, máximo e ideal para o seu desenvolvimento. Apesar disto, a faixa de desenvolvimento de alguns gêneros é bastante ampla havendo casos em que ocorre o desenvolvimento a temperaturas mínimas de 35 C e máximas de 90 C. Esta ampla faixa de desenvolvimento fez com que os microrganismos fossem divididos em grupos de acordo com sua temperatura ideal de desenvolvimento: - Psicrófilos: apresentam temperatura de crescimento de 0 C a 20 C com ótima entre 10 C a 15 C. - Psicrotrófilos: desenvolvem-se em temperaturas de 0 C a 7 C. - Mesófilos: apresentam temperatura máxima entre 40 C e 50 C e mínima de 5 C e 25 C com ótima entre 25 C e 40 C. - Termófilos: desenvolvem-se a temperaturas máximas entre 60 C e 90 C e mínimas de 35 C e 45 C com ótimas entre 45 C e 65 C (FORSYTHE, 2002; FRANCO; LANDGRAF, 2008).

21 20 As temperaturas de refrigeração são as mais ideais para os microrganismos psicrófilos e psicrotrófilos sendo que as bactérias do gênero Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium e Micrococus são os principais responsáveis pela deterioração de carnes, pescados, ovos e frangos entre outros alimentos. Os fungos crescem em uma faixa de temperatura bem mais ampla que as bactérias apresentando a capacidade de desenvolverem-se em ambientes de refrigeração, porém as leveduras não adaptam-se bem a altas temperaturas (FRANCO; LANDGRAF, 2008). No momento da armazenagem, a qualidade do produto deve ser observada pois apesar de microbiologicamente ser muito mais vantajoso as temperaturas de refrigeração, certos produtos acabam tendo suas características organolépticas deterioradas ou alteradas devido as baixas temperaturas (JAY, 2005) Umidade relativa do ambiente Este fator está relacionado com a a w do alimento. Alimentos com baixa a w e armazenados em locais com alta umidade relativa tendem a absorver umidade e vice-versa. Estas interações podem provocar alterações na capacidade de desenvolvimento de microrganismos e ao mesmo tempo podendo alterar a qualidade do produto (EVANGELISTA, 2008) Composição gasosa do meio Este fator irá determinar quais os tipos de microrganismos que irão desenvolver-se no alimento. Microrganismos aeróbios irão desenvolver-se na presença de oxigênio enquanto que na ausência do oxigênio os microrganismos anaeróbios irão predominar (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Através de processos tecnológicos adequados é possível alterar-se a composição gasosa do meio na qual o alimento encontra-se. O oxigênio pode ser parcial ou totalmente substituído por outros gases (ou diferentes composições) como nitrogênio, gás carbônico, monóxido de carbono, óxido nitroso e dióxido de enxofre

22 21 que possibilitam tempos de estocagem dos produtos maiores (EVANGELISTA, 2008; FRANCO; LANDGRAF, 2008) Conceito de obstáculos de barreiras Através da determinação dos fatores extrínsecos e intrínsecos que atuam sobre determinado alimento seria possível determinar-se facilmente quais tipos de microrganismos estariam presentes e quais prevaleceriam além de determinar-se prazos de validade muito mais seguros porém, deve-se considerar que estes fatores não atuam de maneira isolada mas as diversas situações fazem com que atuem sinergicamente ou antagonicamente (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A técnica das barreiras se refere a utilização conjunta de diversos fatores para o controle dos microrganismos. Desta forma, processos de secagem, acidificação, salga, conservantes químicos entre outros são aplicados em um mesmo produto buscando obter um alimento mais seguro, estável e de maior vida de prateleira (JAY, 2005).

23 DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS As doenças transmitidas por alimentos (DTA) são relatadas na história humana há milhares de anos porém, estas inicialmente sempre eram relacionadas a intoxicações por produtos químicos ou venenos. Somente a partir do século XIX tomou-se conhecimento e iniciaram-se estudos relacionados a doenças alimentares causadas por microrganismos (BRASIL, 2005). Embora os microrganismos estejam intimamente ligados as doenças alimentares, vários outros fatores podem ser relacionados nestes tipos de doenças: - Produtos químicos como metais pesados, pesticidas, herbicidas entre outros; - Toxinas naturais de plantas e animais como alcalóides e histamina; - Vírus como hepatite; - Parasitas como amebas e helmintos, e - Bactérias patogênicas e fungos toxigênicos. Além destes fatores já citados (extrínsecos e intrínsecos) para o desenvolvimento e predominância de um determinado microrganismo patogênico no alimento, a contaminação deste não implica obrigatoriamente na ocorrência de uma doença. Esta somente será deflagrada se o microrganismo patogênico ultrapassar todos os mecanismos de defesa naturais que os indivíduos normais possuem (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Em geral, crianças, idosos e imunodeprimidos apresentam maior suscetibilidade as DTA (BRASIL, 2005).

24 23 Em geral, os sintomas mais comuns das DTA são a diarréia e vômitos porém, sintomas como falta de apetite, náuseas e febre também podem acontecer. Apesar disto, o estado físico da pessoa infectada e principalmente a patogenicidade do microrganismo envolvido podem fazer com que os sintomas digestivos evoluam para intoxicações extra-intestinais atingindo outros sistemas e órgãos como meninges, rins, fígado, sistema nervoso central ou terminações nervosas periféricas. Estes casos mais graves podem apresentar desidratação grave, diarréia sanguinolenta, insuficiência renal aguda (síndrome hemolítica urêmica SHU) e insuficiência respiratória (no caso de botulismo) (BRASIL, 2005). As DTA, devido aos diversos mecanismos de contaminação envolvidos, podem ser divididas em: - Intoxicação alimentar: a doença é causada pela ingestão do alimento já contaminado por toxinas produzidas pelos microrganismos durante sua proliferação. Estes contaminantes em sua grande maioria não apresentam cheiro ou sabor e desencadeiam a doença mesmo após o microrganismo fonte ter sido eliminado. Bactérias como Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e fungos produtores de micotoxinas são exemplos de microrganismos que produzem toxinas. - Infecção alimentar: alimentos contaminados com microrganismos patogênicos vivos causam esta infecção. Nesta forma, após a ingestão, os microrganismos proliferam-se e se aderem à mucosa do intestino. Bactérias como a Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae e Campylobacter jejuni destacam-se nesta forma de infecção (FRANCO; LANDGRAF, 2008; BRASIL, 2005). Mesmo quando o alimento já está pronto e fica disponível para o consumidor final, este ainda fica suscetível a uma série de fatores que podem propiciar contaminações indesejadas. Situações como temperaturas inadequadas de cozimento, resfriamento e estocagem, higiene pessoal precária ou contaminações cruzadas entre produtos crus e cozidos ou processados são os principais fatores que podem contribuir para as contaminações (PELCZAR et al., 1997).

25 Salmonella enteritidis Este microrganismo pertence a família Enterobacteriaceae. A bactéria hoje denominada pelo nome Salmonella em homenagem ao Dr. E. Salmon (microbiologista americano) foi primeiramente chamada de Bacterium e, posteriormente, Eberthela em honra a Heberth. Os primeiros relatos de salmoneloses datam de na Alemanha, por Gurtener que relatou a contaminação de 59 pessoas com óbito de 1 jovem (EVANGELISTA, 2002). As Salmonellas apresentam-se na forma de pequenos bastonetes curtos (1 a 2 µm), são Gram-negativas, anaeróbias facultativas e não formadoras de esporos. Além disto, a Salmonella fermenta a glicose produzindo ácidos e gás sendo incapazes de metabolizar a lactose e sacarose e a maioria das espécies é móvel (S. galinarum e S. pullorum não são móveis). Pelo fato de não produzirem esporos, são termosensíveis podendo ser destruídas a 60 C por 15 a 20 minutos (FORSYTHE, 2002). Como características gerais, necessitam de ph próximo de 7,0 (valor ótimo) para desenvolver-se (acima de 9,0 e abaixo de 4,0 são bactericidas) mas conforme o tipo de ácido empregado estes valores podem mudar, não desenvolvem-se bem em concentrações salinas superiores a 9%, nitrito possui efeito bactericida que pode ser acentuado em ph ácido e apresentam temperatura ótima de crescimento de 35 C a 37 C (mínima em 5 C e máxima de 47 C) porém estudos indicam que estes valores mínimos e máximos dependem do sorotipo da bactéria (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Atualmente, as Salmonellas estão divididas em duas espécies: Salmonella enterica e Salmonella bongori. São conhecidos mais de sorovares que foram divididas em subespécies (ou grupos) e classificadas nestas duas espécies (JAY, 2005). A Salmonella é um microrganismo que é facilmente disseminado no meio ambiente. Esta bactéria é encontrada preferencialmente no trato intestinal de animais como pássaros em geral, galinhas, porcos, gatos, cachorros e no homem e esporadicamente em insetos. A sua presença no trato intestinal possibilita a sua excreção pelas fezes tornando sua disseminação muito fácil (através de insetos por

26 25 exemplo) no ambiente inclusive em águas poluídas. Assim ao ingerir-se alimentos contaminados por estas águas poluídas, acaba formando-se um ciclo permanente (JAY, 2005). Devido a isto e a sua facilidade de disseminação, Jay (2005) cita vários estudos realizados onde foram detectadas contaminações de Salmonellas em rações de animais, manipuladores de rações e criadores de frangos por diversos sorotipos, vários tipos de alimentos como misturas de bolos e biscoitos, molhos de salada, maionese e leite entre outros alimentos. Apesar de serem divididas em grandes grupos, as doenças causadas pela Salmonella podem ser divididas em 3 grupos: a febre tifóide causada pela S. typhy, as febres entéricas causadas pela S. parathypy e as gastroenterites (salmoneloses) causadas pelas demais salmonelas (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A febre tifóide ocorre somente no homem e é causada pela Salmonella typhy e caracteriza-se pela transmissão por alimentos ou águas contaminadas com material fecal humano. Essa doença apresenta sintomas graves como septicemia (multiplicação do microrganismo no sangue), febre alta, diarréia e vômitos. Devido a essas características infecciosas, os pacientes recuperados da febre tifóide podem continuar excretando bacilos nas fezes por muitas semanas (meses ou anos até) tornando-se portadores crônicos. Trabalhadores da indústria de alimentação e profissionais da área de saúde que sejam portadores podem representar um grave problema de saúde pública. As febres entéricas (Salmonella thypy) apresentam características semelhantes porém, seus sintomas clínicos são mais brandos. Estas febres são geralmente tratadas com cloranfenicol ou ampicilina (FRANCO; LANDGRAF, 2008; PELCZAR et al., 1997). As salmoneloses (gastroenterites) são caracterizadas por sintomas como diarréia, febre, dores abdominais e vômitos. Em geral, 36 a 48 horas após a ingestão do alimento contaminado (ou contato direto com o microrganismo) os sintomas aparecem. Os sintomas desaparecem de 2 a 5 dias e geralmente estas enterocolites não requerem tratamento com antibióticos (PELCZAR et al., 1997). Devido as características próprias do microrganismo e, atualmente a facilidade de trânsito de pessoas e de produtos industrializados ou não (apesar dos

27 26 controles sanitários), a Salmonella representa uma grande fonte de contaminações e causadora de DTA. No Brasil, conforme dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS/MS) (TABELA 3), de 1999 a 2009, de um total de surtos comunicados e que tiveram sua causa identificada, a Salmonella spp. foi a responsável por surtos o que representa 42,5% do total (BRASIL, 2009). Tabela 3 Microrganismos mais freqüentes causadores de DTA. Agente Número de etiológico surtos % Salmonella spp ,5 Staphylococcus spp ,5 Bacillus cereus 219 7,0 Clostridium perfringens 154 4,9 Salmonella enteritidis 129 4,1 Shigella spp. 85 2,7 Outros ,0 Fonte: Brasil, (2009). Também conforme dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS/MS), entre as várias espécies de Salmonella, a S. enteritidis foi a que apresentou um maior número de casos (GRÁFICO 1). Frequência S. Enteritidis S. Infantis S. London S. Typhimurium S. Typhi S. Corvallis Sorovar de Salmonella Gráfico 1 Surtos de DTA por sorovar de Salmonella. Fonte: Brasil, (2009). S. Sainttpaul S. Panama S. Pomona S. Dublin S. Heidelberg S. Anatum S. Derby S. Johannesburg S. Bredeney S. Newport S. San Diego S. Senftenberg S. Javiana A S. enteritidis coloniza normalmente o canal ovopositor das galinhas que causa a contaminação da gema durante a formação do ovo. Desta forma alimentos envolvendo em sua composição ovos são os maiores responsáveis por este tipo de

28 27 contaminação (TABELA 4) (FRANCO; LANDGRAF, 2008). No Brasil, estes tipos de alimentos são os mais relacionados com as DTA. Tabela 4 - Alimentos causadores de DTA mais freqüentes. Número de Alimentos surtos % Ovos e produtos a base ,8 Alimentos mistos ,3 Carne vermelha e derivados ,7 Sobremesas ,7 Água 355 8,7 Leite e derivados 293 7,2 Outros ,3 Fonte: Brasil, (2009). Uma vez que a grande parte das salmoneloses são transmitidas por alimentos contaminados, muitas vezes, medidas simples de controle ajudam a prevenir: - Preparo dos alimentos adequadamente: conservar os alimentos em locais adequados (e sob refrigeração) que evita a proliferação dos microrganismos e observar as temperaturas e o tempo de cozimento que elimina as possíveis salmonelas presentes; - Evitar o contato do alimento com roedores, insetos e outros animais que possam ser fonte do microrganismo; - Realizar exames periódicos em manipuladores de alimentos (principalmente) buscando detectar portadores crônicos; - Observar as boas práticas pessoais sanitárias e higiênicas tanto em residências quanto em locais públicos (lanchonetes, bares, restaurantes) (PELCZAR et al., 1997). 3.2 Escherichia coli A Escherichia coli pertence a família Enterobacteriaceae. Este microrganismo foi primeiramente denominado por Theodor von Escherich (em 1885) sendo chamado inicialmente de Bacterium coli commune devido ter sido detectado

29 28 em todos os pacientes doentes (EVANGELISTA, 2002; JAY, 2005). A E. coli juntamente com os gêneros Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella pertencem ao grupo de microrganismos denominados de coliformes totais. Dentre estes, somente a E. coli possui como hábitat principal o trato intestinal do homem e de animais e os demais além de serem encontrados nas fezes podem ser encontrados em locais como solo e vegetais onde podem resistir por tempos maiores do que bactérias patogênicas de origem intestinal como a Salmonella e Shigella (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Pelo fato do microrganismo E. coli ser de origem do trato intestinal tanto de homens quanto de animais, a sua presença em contaminações alimentares indica contaminação de origem fecal e desta forma indicando que o alimento foi manipulado, produzido ou armazenado em condições higiênicas insatisfatórias e além disto, sua presença pode indicar a possibilidade da ocorrência de infecções alimentares pois este microrganismo é patogênico. A E. coli possui como características principais: são bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos e capazes de fermentar a lactose produzindo ácidos e gás (em 24 horas a 44,5 C a 45,5 C) (FRANCO; LANDGRAF, 2008; SILVA et al., 1997). Assim como em um grande número de microrganismos, a presença de coliformes ou E. coli no alimento pode não ser o problema principal, porém a quantidade destes presentes sim. Sabe-se que métodos higiênicos de manipulação e produção eliminam uma grande parte destes microrganismos e desta forma a sua presença deixa de ter significado. A eliminação total destes nos alimentos (tanto de frescos quanto processados) é muito difícil de forma que a sua quantificação em muitos casos perde significado perante fato da presença destes. Desta forma Jay (2008), cita como exemplos a presença destes nos produtos lácteos que indicam as condições higiênico sanitárias das indústrias lácteas e dos produtores em geral e a presença em vegetais (branqueados e congelados) que indicam problemas no processo. Devido suas características de virulência e aos efeitos destas, a E. coli está dividida em cinco grupos (todos patogênicos):

30 29 - E. coli enteropatogênica (EPEC): microrganismo causador de diarréias principalmente em recém nascidos e lactantes que são mais suscetíveis. Este sorotipo é o causador dos casos mais graves de doenças. - E. coli enteroinvasiva (EIEC): este sorotipo causa sintomas clínicos como cólicas abdominais, diarréia, febre e mal estar. Ataca principalmente crianças maiores e adultos. - E. coli enterotoxigênica (ETEC): causa diarréias em crianças e adultos. Este microrganismo está muito associado a diarréia dos viajantes estando ligada principalmente a casos onde as condições de saneamento são precárias. - E. coli entero-hemorrágica (EHEC): microrganismos desta cepa pertencem os sorotipos O157:H7. Provocam colite hemorrágica que causa dores abdominais fortes e diarréia aguda (seguida de diarréia sanguinolenta) diferenciando-se dos demais sorotipos pela ausência de febre e grande quantidade de sangue nas fezes. Em casos mais graves pode evoluir para a síndrome urêmica hemolítica (HUS). As contaminações por este microrganismo podem estar associadas a um grande número de alimentos como carnes, leites e aves. Porém, pelo fato do gado ser seu habitat normal, os alimentos de origem animal estão mais relacionados com estas contaminações. - E. coli enteroagregativa (EAggEC): difere dos demais microrganismos pelo fato das diarréias persistentes com duração superior a 14 dias infectando principalmente crianças (FRANCO; LADGRAF, 2008). No Brasil, casos de intoxicações pela E. coli representam um fator de preocupação para as autoridades de saúde (GRÁFICO 2) uma vez que a síndrome hemolítica urêmica (E. coli O157:H7) é considerada uma DTA emergente devido ao grande número de casos e surtos que tem-se verificado nos últimos anos (BRASIL, 2005).

31 30 Número de surtos Ignorado 2872 Salmonella spp Staphylococcus spp Hepatite A Bacillus cereus Rotavirus Clostridium perfringens Coliformes fecais Salmonella Enteritidis Shigella spp. Clostridium botulinum Microrganismo causador DTA Gráfico 2 Surtos de DTA por microrganismo causador Fonte: Adaptado Brasil, (2009). Outros parasitas Salmonella Typhi Cryptosporidium Novovirus De um modo geral, a sensibilidade da E. coli a temperatura é bastante grande de modo que tomando-se cuidados com o cozimento dos alimentos evitariase muitas possibilidades de contaminações. Jay (2005) cita também que entre 16 fatores de contaminação, 5 foram verificados com maior freqüência: refrigeração inadequada (25,5% dos casos), alimentos preparados com muita antecedência, manipuladores infectados com hábitos de higiene insuficientes, cozimento ou processamento inadequado e alimentos cozidos com temperaturas que favorecem o crescimento bacteriano. 3.3 Avaliação da atividade antimicrobiana Os microrganismos contaminantes apresentam diferentes padrões de sensibilidade frente as substâncias antimicrobianas devido principalmente aos complexos mecanismos de ação destas substâncias sobre os microrganismos (BLACK, 2002). Para a determinação da ação antimicrobiana de determinada substância frente a algum microrganismo, geralmente são utilizados os métodos de diluição ou da difusão em disco. O método da diluição é também denominado de concentração inibitória mínima (CIM), ambos são eficientes e rotineiramente utilizados (BLACK, 2002).

32 31 Através do teste CIM pode-se determinar a menor quantidade da substância antimicrobiana necessária para inibir o desenvolvimento do microrganismo (MADIGAN et al., 2004). O teste consiste na aplicação de um meio contendo uma quantidade constante do microrganismo teste em uma série de tubos (ou placas de microdiluição) que contenham concentrações decrescentes da substância antimicrobiana. Após período de incubação, os tubos são verificados (o crescimento microbiano é caracterizado pela turvação do meio) e a concentração menor do agente microbiano no qual não houve o crescimento bacteriano é denominada de CIM (BLACK, 2002). Apesar da larga utilização, o teste da CIM pode apresentar variações para uma mesma determinada substância uma vez que o teste pode ser influenciado pelo tipo de microrganismo, a composição do meio de cultura e tempo e condições de incubação (ph, temperatura e aeração). Porém, através da utilização de condições padronizadas, pode-se obter resultados e comparar diferentes substâncias antimicrobianas verificando-se e determinando-se a eficiência contra determinado microrganismo ou até mesmo avaliar a atividade antimicrobiana desta substância frente a diversos microrganismos (MADIGAN et al., 2004). A versatilidade de teste CIM (método de diluição) possibilita a realização de uma segunda etapa através da qual pode-se diferenciar substâncias bactericidas (que matam microrganismos) de substâncias bacteriostáticas (que inibem o crescimento). Isto pode ser verificado através dos tubos onde não verificou-se o crescimento bacteriano mas que ainda podem conter microrganismos que foram somente inibidos os quais destes são retiradas amostras que são inoculadas em meios de cultura que não contenham a substância antimicrobiana. A verificação do resultado faz-se observando a concentração mais baixa da substância bactericida que não possibilite a crescimento microbiano na segunda inoculação. Este resultado constitui a concentração bactericida mínima (CBM) (BLACK, 2002).

33 A INDÚSTRIA DE PRODUTOS CÁRNEOS A indústria de produtos cárneos é um dos setores industriais mais antigos da história do homem com referências sendo citadas no livro XVIII da Odisséia (900 a.c.) onde falasse de tripas de cabras recheadas com sangue e gordura. A partir daí, outros povos e civilizações adotaram e aperfeiçoaram estes processos de manipulação e preparo o que possibilitou a popularização e diversificação destes tipos de produtos cárneos entre a população (ORDÓÑEZ, 2005). A carne, como alimento, naturalmente é um produto muito perecível devido a suas características químicas e principalmente devido a sua elevada atividade de água. O homem, para ter produtos menos perecíveis e de melhores qualidades sensoriais, desenvolveu e aprimorou novos processos e matérias primas que possibilitaram a obtenção de produtos de qualidade muito superior. Processos de corte, embutimento, misturas de sal, condimentos e ervas aromáticas possibilitaram a produção de embutidos de sabor e odor muito agradáveis (ORDÓÑEZ, 2005). Juntamente com estas melhorias e processos, a adição de substâncias conservantes (naturais ou sintéticas) visando uma produção segura e conseqüentemente garantindo (ou aumentando) a vida de prateleira do alimento tem-se tornado cada vez mais necessária e utilizada (FORSYTHE, 2002). Estas substâncias denominadas conservantes possuem propriedades antimicrobianas atuando principalmente inibindo o crescimento e desenvolvimento de microrganismos patogênicos ou não. Alguns processos físicos utilizados no controle microbiológico dos alimentos como refrigeração, congelamento,

34 33 pasteurização e esterilização entre outros, apresentam algumas limitações (alterando características organolépticas do alimento) sendo este um dos principais fatores que torna necessária e extremamente útil a utilização dos conservantes químicos além do que na maioria das situações a utilização de processos físicos conjuntamente com os conservantes possibilita a obtenção de resultados melhores (ARAÚJO, 2008). A quantidade de substâncias permitidas e utilizadas como conservantes não é muito grande dentre as quais pode-se destacar: - Ácidos lipofílicos e derivados: ácido benzóico, ácido sórbico e ácido propiônico e seus respectivos sais de sódio, potássio e cálcio; - Nitratos e nitritos; - Dióxido de enxofre e derivados; - Nisina, e - Natamicina. Nesta classificação como conservantes não incluem-se os sais comuns, vinagres e açúcares e condimentos ou seus óleos essenciais. Devido a diversidade de alimentos e possibilidades de utilização, para o uso destas substâncias deve-se observar fatores como: - Concentração: deve ser compatível possibilitando a inativação dos microrganismos; - Temperatura de estocagem: geralmente, a toxicidade da substância aumenta proporcionalmente a temperatura. Porém, se a temperatura de estocagem estiver próxima da ideal para o desenvolvimento de microrganismos isto pode reduzir a ação do conservante; - Tipo e número de microrganismos presentes: os diferentes microrganismos atuam de maneira diferenciada no substrato além de estarem presentes em quantidade diferentes o que pode prejudicar a ação dos conservantes (FRANCO; LANDGRAF, 2008).

35 Condimentos e especiarias Estes compostos, quando utilizados na composição do alimento, por possibilitarem aos alimentos melhora nas características organolépticas podem ser considerados de ação coadjuvante (EVANGELISTA, 2008). O interesse por estas substâncias de origem natural tem aumentado consideravelmente nos últimos anos principalmente devido ao interesse dos consumidores por consumir produtos cada vez mais livres (ou com quantidades reduzidas) de substâncias conservantes. Porém, sabe-se que juntamente com isto, o consumidor exige produtos de alta qualidade e somente com a utilização destas substâncias naturais isto se tornaria inviável o que talvez realça o maior benefício destas substâncias: a possibilidade de atuarem conjuntamente potencializando outros agentes microbianos. Além disto, deve-se destacar as propriedades organolépticas (sabores e odores) que as especiarias podem transmitir conjuntamente ao alimento (SOUZA et al., 2003). Conforme destaca Riedel (2005), os condimentos em sua grande maioria são utilizados com a finalidade única de melhorar o gosto dos alimentos sendo que as qualidades bactericidas desta não podem ser provadas na prática uma vez que as quantidades de condimentos utilizados em relação ao produto são muito pequenas. Outro fator destacado está relacionado com a possibilidade de contaminações microbiológicas ocorrerem a partir dos condimentos uma vez que estes estão diretamente em contato (quando no estado in natura ) com fontes de contaminação em potencial (ar, água, solo). Apesar de atualmente uma grande gama de condimentos serem industrializados, estes não estão estéreis e apesar de contarem com substâncias bactericidas, o fato de na maioria das vezes os condimentos estarem na forma de pós secos, acaba dificultando sua atuação bactericida sobre os microrganismos que poderiam estar presentes. Segundo Jay (2005), os efeitos antimicrobianos destas substâncias, além da dificuldade de serem determinados, mudam consideravelmente conforme a composição do produto (alimento) aplicado e principalmente conforme as concentrações dos agentes antimicrobianos que compõe estas substâncias. Apesar

36 35 disto, a atividade antimicrobiana de um grande número destes compostos é comprovadamente eficaz e um grande número de pesquisas e trabalhos a respeito já foram realizados. A utilização destes condimentos como agentes antimicrobianos é geralmente feita a partir da utilização dos seus respectivos óleos essenciais (principalmente) ou extratos. Os óleos essenciais apresentam uma composição química complexa formada por hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos), álcoois e compostos carbonílicos. Os extratos compreendem material resinoso constituído de lipídios, ceras, pigmentos e uma série de outras substâncias características do condimento (ARAÚJO, 2008). A utilização dos óleos essenciais e extratos também possibilita a manutenção das principais características dos condimentos. A uso de condimentos na forma de pós potencializa principalmente a perda de aromas além do que como qualquer produto possui uma validade relativamente pequena. A utilização destes condimentes na forma de óleos essenciais e extratos permite que estas características sejam preservadas mais facilmente (ARAÚJO, 2008). Devido principalmente a fatores intrínsecos e a diversidade de microrganismos contaminantes, os condimentos naturais apresentam menor eficiência bactericida quando aplicados nos alimentos do que quando aplicados em testes (meios de cultura). As bactérias do tipo Gram-negativas (as bactérias lácticas são as mais resistentes) apresentam maior resistência que as Gram-positivas e os fungos apresentam maior sensibilidade que as Gram-negativas (JAY, 2005). As substâncias antimicrobianas atuam na maioria das vezes sobre uma estrutura ou função microbiana que as difere das demais. Estas diferenças são as responsáveis pelo efeito bactericida pelo qual o microrganismo é eliminado completamente ou pelo efeito bacteriostático no qual o crescimento do microrganismo é inibido. As formas e mecanismos de atuação das substâncias antimicrobianas são por vezes pouco conhecidos e explicados devido a complexidade das situações porém, alguns modos de ação são conhecidos:

37 36 - Inibição da síntese da parede celular: a parede celular externa rígida (peptidioglicano) é uma das características das bactérias Gram-positivas e de fungos. As substâncias antimicrobianas (anel β-lactâmico) impedem a síntese da parede celular promovendo a lise da célula; - Destruição da função da membrana celular: microrganismos possuem em sua membrana externa substâncias denominadas fosfolipídios (característica de bactérias Gram-negativas) que são atacadas pelas substâncias antimicrobianas possibilitando a destruição do microrganismo; - Inibição da síntese de proteínas: as substâncias atuam seletivamente sobre a síntese protéica dos ribossomos; - Inibição da síntese de ácidos nucléicos: os antimicrobianos agem seletivamente sobre enzimas presentes nas células bacterianas; - Ação como antimetabólitos: estas substâncias atuam impedindo a utilização de metabólitos que são essenciais para o desenvolvimento e sobrevivência do microrganismo devido possuírem estruturas muito parecidas com os metabólitos. São muito utilizados no combate a infecções virais (BLACK, 2002). 4.2 Louro uma erva condimentar Na antiguidade, os povos mediterrâneos sempre demonstraram um forte sentimento em relação a sua terra, sua história antiga e a seus costumes culinários. Isto fez com que uma grande quantidade de folhas, flores e frutos de ervas e árvores passassem a ornamentar e a temperar uma grande variedade de pratos culinários. Nesta grande variedade de ervas condimentares que passaram a ser cultivadas, o louro (Laurus nobilis que significa louro nobre), foi uma das espécies que facilmente difundiu-se e popularizou-se em todo o mundo. Para estes povos antigos, o loureiro seria proveniente do amor que Apolo sentia pela ninfa Dafne que fugindo deste teria recorrido a Zeus que acaba transformando-a na árvore de louro. Apolo fez do loureiro sua árvore (para não perder o amor de Dafne) e passou a usar coroas de folhas de louro em sua cabeça para celebrar este amor. Desta forma nasceu o costume, que mais tarde foi muito difundido pelos romanos de coroar imperadores com coroas de louro que representariam o triunfo, a vitória destes (PELT, 2003).

38 37 Segundo informativo da Embrapa (2007), o louro (Laurus nobilis L.) é uma planta da família Lauraceae que pode atingir 15 metros de altura, de casca lisa e escura, que apresenta folhas persistentes, pecioladas, alternadas, elípticas ou lanceoladas de coloração verde brilhante (na parte superior) e verde pálida (na parte inferior) e com flores pedunculares de coloração amarelada. Suas flores masculinas e femininas desenvolvem-se em plantas separadas e o fruto (baga) amadurecido apresenta coloração negra. Conforme Fochesato et al., (2006), a planta de louro pode ser utilizada em projetos paisagísticos além de representar uma fonte de renda, pois também é fonte de madeira e suas folhas são utilizadas como aromatizantes na culinária. Conforme pesquisas de Cardoso et al., (2010), as folhas de louro podem ser utilizadas como tempero em carnes vermelhas, brancas e peixes, feijão e ervilhas, cremes de leite, ovos e pudins além de possuírem usos terapêuticos atuando contra o cansaço muscular e contusões, auxilia no tratamento de hemorróidas, reumatismo e dores de cólicas menstruais. Suas folhas quando preparadas em infusão ajudam na digestão e estimulam o apetite. Como várias outras espécies de árvores e ervas aromáticas, as folhas de louro possuem em sua composição os óleos essenciais. Os óleos essenciais são substâncias voláteis, formadas por complexos compostos que caracterizam-se pelo forte odor (compostos aromáticos e metabólitos secundários) apresentando-se com coloração límpida (raramente são coloridos), apresentam solubilidade em lipídios e solventes orgânicos e com densidade mais baixa que a água (em geral). Como estão presentes em toda a planta, os óleos essenciais podem ser extraídos de todas as partes da planta: folhas, flores, frutos, caule, raízes ou casca. Estes óleos também são importantes para a planta pois são agentes antimicrobianos, antivirais, antifúngicos e inseticidas naturais que atuam de maneira a proteger a planta. Seu forte e característico odor também atrai alguns tipos de insetos que atuam dispersando o pólen e sementes e espanta alguns tipos de herbívoros que iriam alimentar-se de suas folhas (BAKALLI et al., 2008). Conforme estudos de Corato et al., (2010) e Polovka et al., (2010), a composição química do óleo essencial do louro apresentou os compostos: 1,8 cineol, eugenol, acetil e metil eugenol, α e β-pineno, felandreno, linalol, geraniol e terpeniol. Porém, vários autores (BAKALLI et al., 2010;

39 38 OUSSALAH et al., 2006 e LIRA et al., 2009) citam que a extração e composição dos óleos essenciais (de todas espécies vegetais) pode variar em função do clima, composição do solo, órgão da planta do qual foi extraído (flor, folha..), ciclo vegetativo da planta e idade da mesma. Devido a suas propriedades antimicrobianas, o óleo essencial de louro já teve vários relatos de casos de sua atuação bactericida em alimentos: Oussalah et al., (2006) obteve baixa atividade antimicrobiana frente a Pseudomonas putida, Tajkarimi et al., (2010) relata que o louro tem propriedades bacteriostáticas inibindo a deterioração e a patogenicidade de microrganismos e que o óleo essencial foi testado contra Listeria monocytogenes e Salmonella enteritidis em queijos moles obtendo bons resultados, Corato et al., (2010) obteve atividade antifúngica muito boa do óleo quando aplicado em kivis e pêssegos, Muñoz et al., (2009) observou significativa redução na velocidade e taxa de crescimento da Listeria monocytogenes quando exposta os extratos aplicado no suco de brócolis. Já Morais et al., (2009) e Hinneburg et al., (2006) relatam bons resultados obtidos a partir de extratos para fins antioxidantes.

40 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 Material vegetal As amostras das quais foram realizados os testes CIM são duas: uma amostra íntegra e outra desidratada. A amostra íntegra constitui amostra de folhas de louro in natura as quais foram coletadas em Encantado/RS em agosto de A amostra desidratada refere-se a de um preparado comercial de folhas de louro desidratadas e moídas (data de validade maio/2012) adquirido no comércio local. 5.2 Extração do extrato etanólico Após a coleta das folhas, o material vegetal foi lavado em água corrente para retirada de sujidades, de folhas danificadas e galhos maiores. Após levou-se todo o material para estufa de secagem a aproximadamente 40 C por 24 horas. Após as folhas estarem secas, estas foram trituradas em liquidificador industrial. O material triturado foi passado em uma peneira (de granulometria média) a fim de reter galhos e o material mais grosso recolhendo-se o restante do material. A partir deste material, foram pesadas duas alíquotas de 100 g que foram transferidas para frasco âmbar no qual adicionou-se 1000 ml de álcool etílico 90%. Estes frascos foram mantidos por 7 dias em ambiente escuro e em repouso. A partir desta etapa, os procedimentos foram realizados também com a amostra seca.

41 40 Passado o tempo, as amostras foram filtradas à vácuo (separadamente) onde recolheu-se o filtrado em frascos receptores (extrato etanólico). O solvente destes extratos foram removidos em evaporador rotatório, sob pressão reduzida e em banho quente (40 C). Os extratos obtidos foram recolhidos em frascos adequados, identificados e armazenados sob refrigeração. 5.3 Avaliação da atividade antimicrobiana A análise da atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos da Laurus nobilis L. foi feito através do método de microdiluição (CIM). Foram utilizadas as cepas ATCC (Amercican Type Culture Collection) dos microrganismos: - Salmonella enteritidis (ATCC 13076) - Echerichia coli (ATCC 25922) Como solução antibiótica padrão foi utilizado cloranfenicol 0,2 mg/ml -1 e como solvente para os extratos foi utilizado o dimetilsulfóxido (DMSO) Procedimentos Os procedimentos realizados para o preparo dos reagentes e soluções utilizados foram os seguintes: - Meio ágar nutriente: foram pesados 2,53 g do meio, dissolvidos em 110 ml de água destilada e levado para autoclavar (121 C por 20 minutos). Após, a solução foi transferida para as placas de Petry, aguardado sua solidificação, identificadas e armazenadas em refrigeração. - Solução padrão de turvação 0,5 McFarland: foram misturados 0,05 ml de solução de cloreto bário 0,048 M e 9,95 ml de ácido sulfúrico 0,18 M. - Solução salina 0,8%: foram pesados 0,8 g de cloreto de sódio P.A., transferidos para balão volumétrico de 100 ml, dissolvido e avolumado com água destilada.

42 41 - Meio caseína de soja: foram pesados 9,00 g do meio, dissolvidos em 300 ml de água destilada e levado para autoclavar (121 C por 20 minutos). Após, a solução foi transferida para tubos de ensaio e armazenadas sob refrigeração. - Solução de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) 0,5%: foram pesados 0,5 g de cloreto de trifeniltetrazólio, transferidos para balão volumétrico de 100 ml e avolumado com água destilada. Após, foi transferido para frasco âmbar, identificado e armazenado sob refrigeração. - Solução cloranfenicol 0,2 mg/ml -1 : foi transferido uma alíquota de 500 µl de colírio oftalmológico 4 mg/ml para balão volumétrico de 10 ml sendo após avolumado com água destilada estéril. O balão foi identificado e armazenado sob refrigeração. - Meio ágar Mueller-Hinton: pesaram-se 1,52 g do meio que foram dissolvidos em 400 ml de água destilada e levado para autoclavar (121 C por 20 minutos). Após, a solução foi transferida para as placas de Petry, aguardado sua solidificação, identificadas e armazenadas em refrigeração. Inicialmente, foram pesados 0,100 g (e 1,00 g quando os procedimentos foram repetidos com concentrações maiores) de cada uma das amostras dos extratos etanólicos em béquer, dissolvidos em uma pequena quantidade de dimetilsulfóxido sendo após transferidos para balão volumétrico de 10 ml e avolumado com o mesmo solvente. Os balões foram identificados e armazenados sob refrigeração. A partir das cepas de bactérias originais, estas foram inoculadas em placas de Petry contendo o meio de cultura ágar nutriente, identificadas e incubadas em estufa bacteriológica a 36±2 C por 24 horas. A partir do desenvolvimento destas culturas, com o auxílio de swab inoculou-se as mesmas em tubos de ensaio contendo a solução salina 0,8% (agitando-se vigorosamente). Após, foi comparado visualmente a turvação desta solução frente à solução 0,5 McFarland onde foi observado a turvação das mesmas. Após isto com o auxílio de pipetador automático (e de ponteiras adequadas) foram transferidos 200 µl das soluções contendo os microrganismos para tubos de ensaio contendo meio caseína de soja. Os tubos foram agitados vigorosamente, identificados e separados. Após isto foi transferido 1

43 42 ml destas soluções para novos tubos de ensaio com o caldo caseína de soja os quais juntou-se também 100 µl das soluções dos extratos etanólicos (previamente dissolvidos em dimetilsulfóxido) sendo após os tubos agitados e identificados apropriadamente. As amostras foram separadas. Com o pipetador automático, foram transferidas alíquotas de 100 µl do meio caseína de soja (meio de cultura) para cada um dos poços da placa estéril (96 poços divididos em 12 colunas de 8 poços cada) com exceção dos poços de controle necessários. A partir disto, com as amostras dos extratos etanólicos nos tubos de ensaio, foram transferidas alíquotas de 100 µl para os primeiros poços das placas, em triplicata. Depois disto, com auxílio de um pipetador automático foram feitas diluições seriadas destas amostras (nos 100 µl do meio de cultura já previamente inoculado) nos demais poços que resultaram nas concentrações de: 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,2 µg/ml e 15,6 µg/ml. Na segunda etapa quando os procedimentos foram repetidos, as concentrações obtidas foram as seguintes: 5000 µg/ml, 1250 µg/ml, 625 µg/ml, 312,5 µg/ml e 156,2 µg/ml. Nestas mesmas placas, também foram realizados os controles para o solvente dimetilsulfóxido (meio de cultura inoculado e solvente sem amostra), para o inoculo (meio cultura inoculado sem amostra), para o meio de cultura (sem inoculo e sem amostra) e também para o padrão antibiótico cloranfenicol que após as diluições seriadas ficaram com as concentrações: 25 µg/ml, 12,5 µg/ml, 6,25 µg/ml, 3,12 µg/ml, 1,56 µg/ml e 7,81 µg/ml. Finalizadas as diluições, as placas devidamente identificadas foram incubadas em estufa a 36±2 C por 24 horas. Após este período, as placas foram observadas visualmente (o crescimento bacteriano é confirmado pela turvação do meio) e devido ao fato dos extratos etanólicos apresentarem uma coloração escurecida (mesmo após as diluições), foram aplicadas sobre as mesmas vários

44 43 borrifos da solução de cloreto de trifeniltetrazólio 0,5% que possibilita uma melhor confirmação do crescimento bacteriano pelo desenvolvimento de coloração avermelhada nos poços. Após a verificação dos resultados com a aplicação da solução de cloreto de trifeniltetrazólio 0,5%, para a confirmação do crescimento bacteriano, foram retiradas pequenas alíquotas (com auxílio de alça de platina) de cada uma das séries de diluições e inoculadas novamente em placas de Petry (meio de cultura Mueller- Hinton) e após sendo incubadas em estufa 36±2 C por 24 horas. Após o período de incubação, as placas foram observadas visualmente sendo após os resultados verificados anotados.

45 RESULTADOS E DISCUSSÕES Conforme já descrito, os extratos etanólicos de folhas de louro utilizados nos testes foram duas sendo identificadas como: amostra íntegra que representa o extrato proveniente de folhas in natura (colhidas recentemente) e amostra desidratada que identifica o extrato produzido a partir de um preparado comercial (de folhas secas desidratadas e moídas) adquirido no comércio local. Após realizadas as extrações do material, os extratos etanólicos apresentaram coloração verde escura e odor característico do louro (FIGURAS 1 e 2). Figura 1 Extrato etanólico amostra íntegra Fonte: autor Figura 2 Extrato etanólico amostra desidratada Fonte: autor

46 45 Apesar de muitas pesquisas relatando atividade antimicrobiana do óleo essencial de folhas de louro (OUSSALAH et al., (2006), TAJKARIMI et al., (2010), CORATO et al., (2010), MUÑOZ et al., (2009) entre outros), os estudos relacionando extratos aquosos ou etanólico são poucos: Bara e Vanetti (2006) não observaram atividade bactericida do extrato etanólico frente às bactérias E.coli, S. typhymurium, S. aureus, L. monocytogenes e Yersinia enterocolitica, Shan et al., (2007) observou atividade do extrato aquoso frente às bactérias B. cereus, L. monocytogenes e S. aureus não obtendo resultados frente a E. coli e S. anatum e Sagdiç et al., (2003) não observou atividade bactericida do extrato aquoso (hidrossol) frente às bactérias Bacillus amyloliquefaciens, B. brevis, B. cereus, B. subtilis var. niger, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, E. coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis, S. gallinarum, S. typhimurium, Staphylococcus aureus, S. aureus e Yersinia enterocolitica. Já Mariutti et al., (2008), Morais et al., (2009), Hinneburg et al., (2006) observaram bons resultados do extrato como substância antioxidante. Desta forma para verificar-se CIM do extrato etanólico de folhas de louro, os testes foram realizados em 2 etapas: a primeira nas concentrações de 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,2 µg/ml e 15,6 µl/ml e na segunda etapa nas concentrações de 5000 µg/ml, 1250 µg/ml, 625 µg/ml, 312,5 µg/ml e 156,2 µg/ml. Os resultados verificados podem ser observados nas tabelas abaixo (TABELAS 5 e 6) frente aos microrganismos E. coli e S. enteritidis. Tabela 5 Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo Escherichia coli. Amostra Amostra Concentração íntegra seca substrato (µg/ml) Coluna poços poços Resultado *NA: não ativo Fonte: autor 5000 A NA* 2500 B NA* 1250 C NA* 625 D NA* 312,5 E NA* 156,2 F NA*

47 46 Tabela 6 Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo Samonella enteritidis. Amostra Amostra Concentração íntegra seca substrato (µg/ml) Coluna poços poços Resultado *NA: não ativo Fonte: autor 5000 A NA* 2500 B NA* 1250 C NA* 625 D NA* 312,5 E NA* 156,2 F NA* Conforme relata Rios et al., (2005), testes para determinação de atividade antimicrobiana a partir de substâncias naturais devem ser evitados com quantidades superiores a 1 mg/ml para extratos e 0,1 mg/ml para os compostos isoladamente e também segundo este, a atividade antimicrobiana quando comprovada é interessante para concentrações abaixo de 100 µg/ml para extratos e 10 µg/ml para os compostos isolados. Os testes realizados nas concentrações determinadas ficaram de acordo com o sugerido por este autor compreendendo concentrações acima e abaixo do especificado. Conforme resultados observados, o extrato etanólico não apresentou atividade antimicrobiana em nenhuma das concentrações frente às 2 bactérias testadas. Pode-se observar isto também pela coloração avermelhada adquirida após a aplicação do TTC (FIGURAS 3 e 4) que é indicativo de turvação e conseqüente crescimento microbiano. Observando-se as figuras abaixo (FIGURAS 3 e 4), pode-se observar que os poços correspondentes aos controles tiveram os resultados esperados.

48 47 placa S. enteritidis - primeira etapa após aplicação do TTC Figura 3 Placas de CIM da primeira etapa após aplicação TTC Fonte: autor. placa E. coli - primeira etapa após aplicação TTC

49 48 placa S. enteritidis segunda etapa após aplicação TTC Figura 4 Placas de CIM da segunda etapa após aplicação TTC Fonte: autor. placa E. coli - segunda etapa após aplicação TTC Pode-se observar que os poços 7, 8 e 9 (colunas A, B, C, D, E e F) correspondentes ao controle com solução de cloranfenicol não apresentou turvação inicial nem coloração avermelhada após a aplicação da solução de cloreto de trifeniltetrazólio. Este resultado confirmou que a solução antibiótica nas concentrações testadas teve atividade bactericida frente às 2 bactérias testadas. Já os poços 10, 11 e 12 (colunas A, B, C, D, E e F) são referentes ao controle do solvente dimetilsulfóxido o qual pode-se observar apresentou turvação inicial e coloração avermelhada (em diferentes tonalidades) em todas as concentrações testadas após a aplicação da solução de cloreto de trifeniltetrazólio. Isto confirma que o solvente não possui capacidade para inibir o desenvolvimento

50 49 dos microrganismos não sendo este o responsável por eventuais resultados negativos quanto a atividade bactericida dos extratos. A coluna G (das 4 placas) corresponde ao controle do inoculo no qual observa-se coloração avermelhada em todos os poços. Este resultado comprova que os microrganismos foram capazes de desenvolver-se no meio de cultura utilizado sendo que este não influenciou nos resultados negativos dos demais extratos. A coluna H da placa da primeira etapa do microrganismo S. enteritidis (que deveria corresponder a um controle) apresentou turvação inicial e coloração avermelhada devido a erro analítico no qual foi inoculado o microrganismo indevidamente e desta forma esta coluna não é considerada como controle nesta placa. As colunas H das demais placas correspondem ao controle do meio de cultura o qual não apresentou turvação ou coloração avermelhada o que comprova que o meio utilizado não apresentava contaminações. Observa-se na placa E. coli segunda etapa os poços 1, 2 e 12 coloração avermelhada que provavelmente decorrem de alguma contaminação durante o preparo das placas. Os resultados das atividades antimicrobianas obtidos nos testes estão de acordo com os resultados obtidos por Shan et al., (2007) que também não observou atividade antimicrobiana do extrato frente a E. coli e Salmonella anatum. Conforme suas pesquisas, que também testou outras bactérias Gram-positivas, estas apresentaram em sua grande maioria maior sensibilidade bactericida quando comparadas com as bactérias Gram-negativas e isto foi observado na medida em que a E. coli e Salmonella anatum não apresentaram atividade antimicrobiana. Em seu trabalho também, a E. coli apresentou uma resistência maior em relação a S. anatum. Sagdiç et al., (2003), além de não ter observado eficiência bactericida do extrato de louro frente a estas bactérias Gram-negativas, ressalta que os efeitos antimicrobianos também podem variar conforme os tipos de condimentos testados e das condições ambientais em que estes condimentos naturais desenvolveram-se. Da mesma forma Bakkali et al., (2010), Oussalah et al., (2006) e Lira et al., (2009) e

51 50 Marino et al., (2001) observam que as composições dos óleos essenciais (não somente do louro mas também de outras espécies vegetais) podem variar devido a fatores como o clima do local, estação da colheita, composição do solo, idade e ciclo vegetativo da planta além da parte da planta da qual este óleo é extraído. Nos testes realizados, quando comparados os resultados finais das placas contendo os microrganismos, é possível observar pela intensidade da coloração avermelhada que a Escherichia coli está mais intensa pressupondo um crescimento microbiano maior e conseqüentemente uma resistência maior ao extrato etanólico e que a placa com a Salmonella enteritidis apresenta uma coloração menos intensa indicando um crescimento microbiano menor e conseqüente menor resistência ao extrato etanólico de folhas de louro. Os resultados negativos obtidos do extrato etanólico de folhas de louro frente as bactérias Gram-negativas testadas podem ser devido as características estruturais destas bactérias que acabam dificultando ou impedindo a ação das substâncias antimicrobianas. Sabe-se que as bactérias Gram-negativas (E coli e Salmonella enteritidis) possuem uma membrana externa rica em fosfolipídios que acaba representando uma barreira a mais para a ação antibiótica de determinadas substâncias. Geralmente, as substâncias antimicrobianas atuam destruindo a parede celular e membrana citoplasmática das bactérias que acaba resultando na coagulação e destruição do citoplasma. Estes mecanismos de atuação são relatados por Shan et al., (2007), Tajkarimi et al., (2010), Souza et al., (2003) e Tassou et al., (2000). Os resultados para as confirmações de crescimento microbiano em todas as concentrações e a conseqüente ineficiência destes extratos pode ser confirmada mais uma vez pelos resultados observados quando da inoculação destas culturas no ágar Mueller-Hinton. Foram observados crescimento bacteriano em todas as concentrações dos extratos bem como frente aos microrganismos. Abaixo (FIGURA 5), pode-se verificar, como exemplo, uma destas placas na qual foram inoculadas soluções dos poços 2 (amostra íntegra com crescimento) e 5 (amostra desidratada com crescimento), poço 7 (cloranfenicol sem crescimento) e poço 11 (dimetilsulfóxido com crescimento).

52 51 Figura 5 Placa de confirmação de crescimento. Fonte: autor. Apesar dos resultados negativos obtidos, é preciso salientar que estas substâncias naturais em muitos casos podem potencializar ou atuar sinergicamente com outros conservantes (sintéticos ou não) tornando a necessidade destes menor. Hsieh et al., (2001) pesquisou o efeito antimicrobiano combinado de três extratos vegetais frente a variações de ph obtendo resultados inibitórios melhores com valores de ph ácidos (diminuindo com aumento do ph), com adição de íons metálicos observando pequena diminuição da ação e com a adição de outros aditivos alimentares no qual obteve atividade antimicrobiana levemente maior (com exceção do ácido cítrico). Bedin et al., (1999) relata que conforme pesquisas, os óleos essenciais de condimentos possuem pouca importância antimicrobiana devido as dosagens destes serem muito pequenas e nestes casos a importância destes estaria ligada com a capacidade de potencializar outros agentes antimicrobianos. Nos resultados obtidos dos testes de CIM e nas confirmações após, não é possível determinar se existem diferenças de ação, atuação ou resultados finais que possam distinguir as 2 amostras. Desta forma pode-se dizer que não existem diferenças entre a amostra íntegra (folhas colhidas recentemente) e a amostra desidratada (amostra comercial de folhas desidratadas e moídas).