Desenvolvimento de sistemas de liberação do óleo essencial da Hyptis fruticosa em β-ciclodextrina e lipossomas

Transcrição

1 Desenvolvimento de sistemas de liberação do óleo essencial da Hyptis fruticosa em β-ciclodextrina e lipossomas Bruna M. H. Sousa 1, Paula. P. Menezes 1*, Marcelo C. Duarte 1, Isabella G. Matos 1, Francielly O. Araújo 1, Grace Anne A. Dória 1, Gabriel F. Silva 2, Péricles B. Alves 3, Rafaely N. Lima 3, Lucindo J. Quintans-Jr 1, Daniel P. Bezerra 4, Adriano A. S. Araújo 1, Mairim R. Serafini 1 1 Departamento de Farmácia, 2 Departamento de Engenharia Química, 3 Departamento de Química, Universidade Federal de Sergipe. 4 Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz, Fundação Oswaldo Cruz. *Autor correspondente. Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe-UFS, Av. Marechal Rondon, s/n, São Cristóvão, Sergipe-Brasil. Tel.: ; paulamenezes_16@yahoo.com.br Resumo A Hyptis fruticosa é um arbusto abundante no nordeste brasileiro e bastante estudada devido as suas propriedades farmacológicas, em particular do seu óleo essencial. No entanto, a baixa solubilidade em água compromete as perspectivas de uso terapêutico. Dessa forma, a inclusão do óleo essencial de Hyptis fruticosa (OEHF) em ciclodextrinas (CDs) ou lipossomas são alternativas interessantes para veiculação desse conjunto de compostos. Este trabalho avaliou a composição química do OEHF, bem como preparou complexos de inclusão pelos métodos da mistura física (MF), malaxagem (MA) e coevaporação (CE). Paralelamente, esse trabalho realizou um estudo comparativo incorporando o OEHF em sistemas lipossomais. Essas preparações foram caracterizadas físico-quimicamente pelas técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados obtidos através das técnicas termoanalíticas demonstraram que a formação de complexos de inclusão do OEHF com β-cd foi mais eficaz pelo método da MA. A análise por MEV corroborou os resultados de análise térmica mostrando que a MF possui baixa capacidade de complexação, uma vez que não há alteração na forma cristalina da β-cd, em detrimento da MA e CE, nas quais houve amorfização das amostras. No que concerne a amostra de lipossoma, foi observado na faixa de temperatura de ºC da curva DSC, um evento endotérmico atribuído a transição de fase do fosfolipídio. No entanto esse é apenas um estudo preliminar para o desenvolvimento desse tipo de sistema. A formação de complexos de inclusão e a veiculação de óleos essenciais em novos sistemas terapêuticos são promissores para melhorar a estabilidade e solubilidade de moléculas insolúveis. Palavras-Chave: Hyptis fruticosa, complexos de inclusão, ciclodextrinas e lipossomas. 1. Introdução A Hyptis fruticosa, conhecida popularmente como alecrim de tabuleiro ou alecrim do campo, é um arbusto encontrado na costa do nordeste brasileiro, onde é utilizado para fins medicinais. Foi comprovada na literatura a atividade analgésica, anticonvulsivante, antibacteriana e antinociceptiva do seu óleo essencial [1-3]. No entanto, a baixa solubilidade em água, características da dissolução e instabilidade são limitações dos óleos essenciais e aplicações terapêuticas dos mesmos [4]. Nesse sentido, novos sistemas terapêuticos têm sido largamente utilizados para contornar estes problemas, tais como lipossomas e complexos de inclusão. Lipossomas são vesículas microscópicas formadas por lipídio de tamanho médio de 50 à 100 nm. Devido ao seu caráter anfifílico, possuem a capacidade de incorporar drogas hidrofóbicas e hidrofílicas. Em virtude da sua ótima biocompatibilidade, baixa toxicidade, proteção de drogas contra a degradação e o direcionamento do composto até o local de ação são interessantes para incorporar óleos essenciais [5,6]. As ciclodextrinas (CDs) têm sido amplamente investigadas e utilizadas no meio farmacêutico devido à sua capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de compostos, incluindo óleos essenciais, em sua cavidade hidrofóbica composta de oxigênios etéreos [7, 8]. Consequentemente, as CDs aumentam a solubilidade, a estabilidade e a biodisponibilidade do fármaco complexado, assim como diminuem sua toxicidade. A β-cd é um tipo de CD obtida por modificação enzimática que contém 7 unidades glicopiranosas e é comumente utilizada devido ao tamanho favorável de sua cavidade, produção fácil e baixo custo [9]. 2. Material e métodos 2.1 Material A Hyptis fruticosa foi coletada no município de São Cristóvão-Sergipe [lat: long: err: ±23587 WGS84] em março de 2014, uma excicata da planta foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Sergipe, sob número de voucher O óleo essencial das folhas de Hyptis fruticosa foi extraído por hidrodestilação utilizando um aparato do tipo clevenger durante duas horas e a β-cd (lote:#041m1759v; pureza 97%) foi adquirida da Sigma-Aldrich. O fosfolipídio foi da marca Lipoid 575 (lote: /903) com 75% de fosfatidilcolina.

2 2.2 Análise da composição e identificação dos constituintes químicos do OEHF A análise da composição química do óleo essencial foi realizada em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa CG-EM (Shimadzu, modelo QP 5050A), utilizando uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 de 30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 μm de filme, usando He como gás de arraste com fluxo de 1,0 ml/min, a temperatura foi programada mantendo 50 C por 1,5 min, seguido de um aumento de 4 C/min até atingir 200 C, depois a 10 C até atingir 250 C mantendo constante esta temperatura por 5 min.; temperatura do injetor de 250 C e temperatura do detector (ou interface) de 280 C; foi injetado um volume de 0,5 µl em acetato de etila; taxa de partição do volume injetado de 1:100 e pressão na coluna de kpa. As condições do EM foram detector de íons do tipo quadrupolo operando por impacto eletrônico e energia de impacto de 70 ev; velocidade de varredura 1.000; intervalo de varredura de 0,50 fragmentos/s e fragmentos detectados na faixa de 40 a 500 Da. A identificação dos constituintes foi realizada com base na comparação dos índices de retenção da literatura. Para o índice de retenção foi utilizada a equação de Van den Dool e Kratz 1963 [10] em relação a uma série homóloga de n- alcanos (nc9- nc18). Também foram utilizadas três bibliotecas do equipamento WILEY8, NIST107 e NIST21 que permite a comparação dos dados dos espectros com aqueles constantes das bibliotecas utilizando um índice de similaridade de 80%. 2.3 Preparo das amostras A mistura física (MF) foi preparada mediante mistura mecânica de 204 mg do OEHF (baseado no peso molecular do constituinte majoritário, (E)-cariofileno) e 1135 mg da β-cd. A malaxagem (MA) foi preparada mediante mistura de OEHF e β-cd e adição de água em q.s.p. formar uma pasta e a co-evaporação (CE) foi preparada mediante mistura de 204 mg do OEHF, 1135 mg da β-cd, 20 ml de água destilada e posterior agitação magnética por 36h. Todos os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente na razão molar de 1:1 e submetidas a secagem em dessecador de vidro. A incorporação do OEHF em lipossoma foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Liolios et al (2009) [11] com modificações. Para a preparação dos lipossomas contendo OEHF 5%, foram utilizados 100 mg do OEHF e 1200 mg de fosfolipídeo. Em seguida, estes foram dissolvidos em solução 3:1 clorofórmio:metanol. A mistura foi levada ao rotaevaporador sob 300 rpm e 40ºC, onde permaneceu até que todo o solvente fosse evaporado e houvesse a formação de um filme na parede do balão. Depois disso, adicionou-se 15 ml de água destilada para hidratar o filme e foi realizada agitação manual até o desprendimento total da parede do balão. Logo após, a mistura foi levada ao banho de ultrassom (sonicador) onde ficou por 30 min, e posteriormente congelada e liofilizada. 2.4 Caracterização físico-química 2.4.1Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e Termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG) As amostras do OEHF, β-cd, MF, MA, CE e lipossomas foram submetidas ao ensaio de DSC e TG/DTG. As curvas DSC e TG/DTG foram obtidas em célula DSC-50 e termobalança TGA-51, respectivamente, ambas da marca Shimadzu, utilizando razão de aquecimento de 10 C/min. As curvas DSC foram obtidas entre C, enquanto as curvas TG/DTG foram obtidas de ºC, sob atmosfera dinâmica de N 2 (100 ml/min), empregando-se cápsula de alumínio (Al) e cadinho de platina (Pt), respectivamente, contendo ~2 mg de amostra Microscopia eletrônica de varredura (MEV) As amostras da β-cd, MF, MA, CE e lipossoma foram montadas em stubs de alumínio, posteriormente metalizados com feixes de ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico (JEOL modelo JSM-6390-LV) em aceleração de voltagem de 8 kv. 3. Resultados e discussão Na Tabela 1 estão apresentados os constituintes do OEHF. Como pode ser observado, o composto majoritário foi o (E)- cariofileno, um monoterpeno cíclico largamente encontrado em óleos essenciais de plantas medicinais.

3 Tabela 1: Constituintes químicos do OEHF obtidos por CG-EM. A curva DSC (Figura 1A) do OEHF apresentou um evento endotérmico na faixa de ºC, referente a sua volatilização. A curva DSC da β-cd apresentou três eventos endotérmicos, o primeiro na faixa de temperatura de ºC, atribuído a desidratação da molécula conforme descrito por Azevedo et al (2011) [12], o segundo na faixa de ºC, característico de mudança de fase cristalina e de ºC, etapa de fusão da β-cd seguida de decomposição [13]. A curva DSC da MF apresentou dois eventos endotérmicos, o primeiro na faixa de ºC atribuído a liberação de moléculas de água e óleo adsorvido na superfície da β-cd, o segundo endotérmico referente a transição de fase, e o terceiro na faixa de temperatura de ºC referente a etapa de fusão da molécula hospedeira. Entretanto, as curvas da MA e CE exibiram um evento endotérmico na faixa de 31-93ºC, ausência do evento referente a transição de fase e redução do evento referente a fusão do hóspede. A curva TG do OEHF apresentou uma etapa de perda de massa na faixa de ºC (Δm=100%). Já a curva TG da β-cd apresentou três etapas de perdas de massa importantes, conforme descrito na Tabela 2. A primeira referente a desidratação da molécula, e a partir de 300ºC tem início a etapa de decomposição com carbonização. Na curva TG referente a MF, pode-se observar que na primeira etapa houve uma perda de massa de 22,8% referente a liberação de água e OEHF adsorvido a superfície. Entretanto, na curva da MA, pode ser visto que na primeira etapa o Δm foi inferior ao da MF, enquanto na segunda etapa, entre o C, o valor de perda de massa foi superior (6,8%) e na CE, Δm=3,9%. Dessa forma, pode-se sugerir que a MA foi o melhor método de complexação uma vez que na segunda etapa, na qual não houve perda de massa do OEHF livre e da β-cd, a MA exibiu um valor elevado referente ao OEHF incorporado.

4 Figura 1: Curvas DSC (A) e TG/DTG (B) do OEHF, β-cd, MF, MA e CE obtidas em atmosfera de N 2. Tabela 2: Percentuais de perdas de massa obtidas por TG das amostras do óleo essencial da Hyptis fruticosa, -CD, MF, MA e CE. Produto m 1 (%) m 2 (%) m 1 (%) m 1 (%) C C C C Hyptis fruticosa 100, ciclodextrina 11,9 0,6 64,7 22,8 Mistura física 22,8 5,4 62,6 9,2 Malaxagem 10,0 6,8 71,3 11,9 Co-evaporado 8,2 3,9 79,1 8,8 Na Figura 2 estão apresentadas as imagens da β-cd, MF, MA e CE obtidas por MEV, onde é possível observar a forma prevalente retangular dos cristais da β-cd com partículas aderidas a sua superfície. Na fotomicrografia da MF pode ser visto que o OEHF não interage com a molécula hóspede, ele envolve-a, mas não causa alteração morfológica. Adicionalmente, nas imagens de MA e CE pode ser visto o processo de amorfização dos materiais sugerindo a formação de complexos de inclusão por estes métodos, o que de acordo com a TG, foi mais eficiente pelo método MA. Figura 2: Fotomicrografias da β-cd, MF, MA e CE nos aumentos de 500 e 800x, obtidas em aceleração de voltagem de 8kV. Nas Figuras 3 e 4 estão expressos os resultados da caracterização do OEHF incorporado em sistema lipossomal. Na curva DSC (Figura 3) foi observado um evento endotérmico na faixa de ºC, característico de transição de fase, um fenômeno comum em curvas DSC de lipossomas que descreve a mudança de fase sólida para líquida dos fosfolipídios, levando em consideração a quantidade de água e os intermediários da forma líquida cristalina [14]. A curva TG demonstrou uma etapa de perda de massa na faixa de ºC, representando 77,5% que pode estar relacionada a degradação dos fosfolipídios e possivelmente OEHF incorporado, uma vez que a decomposição do óleo livre (Tabela 2), se dá até 172ºC.

5 Figura 3: Curvas DSC e TG/DTG do lipossoma com OEHF obtidas em atmosfera dinâmica de N Conclusão Os resultados obtidos demonstraram que o complexo de inclusão obtido por MA, exibiu um melhor perfil para complexação do OEHF e que sistemas lipossomais também são interessantes para veicular óleos essenciais. No entanto, este é um estudo preliminar, pois uma caraterização completa desses sistemas exige a utilização de outras técnicas com a finalidade de determinar o tamanho das vesículas lipídicas, a eficiência de complexação através do doseamento e o aumento da solubilidade dos compostos. 5. Agradecimentos Os autores agradecem a CAPES, CNPq, e FAPITEC/SE pelo suporte financeiro nesta pesquisa. Nós agradecemos também a Dra. Maria Lúcia Vieira Moreno, Dr. Cláudio Pereira Figueira e a Profa. Adriana Lanfredi Rangel pelas imagens da MEV obtidas no Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz, Salvador. 6. Referências 1. Santos M, Carvalho A, Medeiros I, Alves P, Marchioro M, Antoniolli A. Cardiovascular effects of Hyptis fruticosa essential oil in rats. Fitoterapia. 2007: Menezes I, Marques M, Santos T, Dias K, Silva A, Mello I et al. Antinociceptive effect and acute toxicity of the essential oil of Hyptis fruticosa in mice. Fitoterapia. 2007: Lima A, Paixão M, Santana M, Damascena N, Dias A, Porto Y et al. Orofacial antinociceptive effect and antioxidant properties of the hydroethanol extract of Hyptis fruticosa salmz ex Benth.. J Ethnopharmacol. 2013: PS S-L, AA A, AM L, JS Q, PP M, PB A et al. B-Cyclodextrin Complex Containing Lippia grata Leaf Essential Oil Reduces Orofacial Nociception in Mice Evidence of Possible Involvement of Descending Inhibitory Pain Modulation Pathway. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2014;114: Bharali D, Khalil M, Gurbuzimone M, Simone T, Mousa S. Nanoparticles and cancer therapy: a concise review with emphasis on dendrimers.. Int J nanomedicine 2009;4: Mufamadi M, Pillay V, Choonara Y, Toit L, Modi G, Naidoo D et al. A review on composite liposomal technologies for specialized drug delivery. J Drug Delivery. 2011: Xu C, Tang Y, Hu W, Tian R, Jia Y, Deng P et al. Investigation of inclusion complex of honokiol with sulfobutyl ether-βcyclodextrin.. Carbohydr Polym. 2014: Valle MD. Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochem. 2004;5: Yao Y, Xie Y, Hong C, Li G, Shen H, Ji G. Development of a myricetin/hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: preparation, characterization, and evaluation.. Carbohydrate polymers. 2014: Dool HVd, Kratz PD. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 1963;11: Liolios CC, Gortzi O, Lalas S, Tsaknis J, Chinou I. Liposomal incorporation of carvacrol and thymol isolated from the essential oil of Origanum dictamnus L. and in vitro antimicrobial activity. Food Chemistry. 2009;112: Azevedo MdBM, Tasic L, Juliana F, Rodrigues FH, Cantos FC, Ribeiro LP et al. New formulation of an old drug in hypertension treatment: the sustained release of captopril from cyclodextrin nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 2011;6: Menezes PP, Serafini MR, Quintans-Júnior LJ, Silva GF, Oliveira JF, Carvalho FMS et al. Inclusion complex of (-)- linalool and b-cyclodextrin. J Therm Anal Calorim. 2014;115: Taylor KMG, Morris RM. Thermal analysis of phase transition behaviour in liposomes Thermoch Acta 1995;248: