ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE SUBCONJUNTOS CELULARES RAROS: RT-PCR DIRETA EM LIMITADO NÚMERO DE CÉLULAS OBTIDAS POR FACS OU ENSAIOS EM SOFT ÁGAR

Transcrição

1 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE SUBCONJUNTOS CELULARES RAROS: RT-PCR DIRETA EM LIMITADO NÚMERO DE CÉLULAS OBTIDAS POR FACS OU ENSAIOS EM SOFT ÁGAR Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular Biologia Molecular 6855 Professora Dra. Maria Aparecida Fernandez Acadêmica: Amanda Vieira Montrezol RA: 82401

2 AUTORES/PESQUISADORES Victor Ho¹*, Shi Yun Yeo²*, Kamini Kunasegaran¹, Duvini De Silva¹, Gerard A. Tarulli¹, P. Mathijs Voorhoeve²,³ e Alexandra M. Pietersen¹,², 4 1-Laboratory of Mammary Gland Biology, National Cancer Centre Singapore, Singapore; 2-Program in Cancer & Stem Cell Biology, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore; 3-Department of Biochemistry, National University of Singapore, Singapore; 4-Department of Physiology, National University of Singapore, Singapore. Revista: Benchmarks, BioTechniques 54: (April 2013) /

3 INTERESSES DO ESTUDO: Descrever um método para estudo de expressão gênica sem a necessidade de isolamento e amplificação de mrna; Avaliar se este método é eficiente para separar diferentes linhagens celulares de glândulas mamárias e analisar a expressão de seus transcritos na formação de câncer de mama.

4 PROBLEMÁTICA: Dificuldade em isolar e quantificar RNA em subconjuntos raros de células, como as células-tronco utilizando FACS; Dificuldade em identificar alterações no potencial gerador de tumores avaliando a transcrição em células de mamíferos, enquanto estas células crescem em uma cultura de soft ágar. SOLUÇÃO APRESENTADA: Lise direta; Avaliação de até 20 transcritos em subpopulações distintas funcionalmente sem a necessidade de isolamento de RNA ou de amplificação. Transcrição reversa em PCR quantitativo (RT-qPCR) em 500 células separadas ou uma única colônia em soft ágar.

5 FACS Separação Celular Eletrônica Ativada por Fluorescência REAGENTES RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen, )-(a RNase, é inibida para não degradar o RNA durante a reação de amplificação); Tween -20 (Biorad) substância que atua como detergente, não ionizante, portanto solubiliza as proteínas, sem desnaturá-las. Tween 20 é utilizado para romper a membrana celular e liberar o conteúdo celular com material genético; SuperScript VILO cdna Synthesis Kit (Invitrogen, ) kit para síntese de cdna; iscript select cdna synthesis kit (Biorad, ) - kit para síntese de cdna. OBS: protocolos de isolamento de RNA padrão ainda requerem um número relativamente grande de células. Como alternativa, protocolos voltados para um número pequeno de células, mesmo as células individuais, necessitam de amplificação de RNA!

6 Procedimentos para o FACS 1. No programa DiVa do separador eletrônico de células ativado por fluorescência, selecione a opção com precisão de única célula, para dois tubos contendo suspensão de 500 células; 2. Coloque 2 tubos de 200ul longe da borda vertical; 3. No programa FACSDiva abra a opção "Sort > custom devices. Defina "1" para o número de linhas e colunas. Coloque o adaptador de placa de tal modo que o suporte da placa de 96 poços esteja em linha com a borda da câmara, faça isso clicando nas setas; 4. - Remova a proteção contra respingos e teste a suspensão para os tubos 200 µl clicando duas vezes no ícone (verifique se a tensão de placa estará ligada). Assegure-se que a queda da suspensão termine na parte inferior do microtubo. Faça ajustes para a posição de ambos os fluxos laterais (usando o regulador de voltagem) ou a posição da placa de adaptador. Faça ajustes para a posição de ambos os fluxos laterais (usando o regulador de voltagem) ou a posição da placa de adaptador; 5. Uma vez que o layout adequado é definido, clique em "Set Home" e "Set Farthest" na janela de configuração de dispositivo para salvar a posição para futuras suspensões. Feche a janela de configuração do dispositivo para começar a separar; 6. Fazer um mastermix de reagente de lise e preparar tubos de 200µl com reagente de lise 10µl cada. Manter os tubos em gelo até suspender; 7. Suspender 500 células por tubo, em seguida, toque os tubos para misturar. Depois de uma volta rápida, deixe tubos no gelo pelo menos 10 minutos garantir a lise completa. Proceda para adicionar o mastermix de transcriptase reversa depois que todos os tubos foram suspensos.

7 Reagentes utilizados para preparar o soft ágar 1.Agarose, baixa temperatura, A9045 Sigma; 2.DMEM, coagulação alta de glicose, , Gibco, Invitrogen; 3. Soro Fetal Calf.

8 COLHENDO COLÔNIAS NA SEMEADURA DE ÁGAR 1. Fazer um mastermix de reagente de lise e preparar tubos de 200 µl com 6µl de reagente de lise cada. Manter os tubos em gelo; 2. Coloque a placa de semeadura de ágar na plataforma do microscópio; 3. Utilizando uma pipeta de ponta para 200µl, ajuste o diafragma no microscópio para permitir a passagem de luz; 4. Coloque a ponta diretamente acima da colônia de células que pretende pegar; 5. Abaixe lentamente a ponta para isolar a colônia de células; 6. Solte a colônia de células colhidos no tubo com reagente de lise delicadamente com uma pipeta de 200µl; 7. Após o isolamento de colônias, centrifugue em tubos cap-tira a 4000rpm durante 1 min; 8. Congelamento-descongelamento do reagente de lise líquido durante pelo menos 3 vezes para garantir que a colônia de célula é rompida; 9. Adicionar mastermix transcrição reversa.

9 4 3 7

10 TRANSCRIÇÃO REVERSA COM CÉLULAS LISADAS OBTIDAS POR FACS OU SELECIONADAS EM ÁGAR 1. Faça um RT mastermix contendo a enzima Superscript VILO RT; 2. Adicionar 8µl RT mastermix à solução de lise celular 12µl, obtida pela FACS ou adicionar 3µl RT mastermix lysis da pilha 7µl de uma colônia de ágar; 3. Transferirr os tubos para uma máquina de PCR. Execute o programa a seguir: 25 C durante 10 minutos, 42 C por 90 minutos e 85 C por 5 minutos; 4. Use 1µl do cdna não diluído para qpcr reação subsequente. OBS: qpcr foi realizado com SsoFast DaleneValorie Supermix (Biorad, ) de acordo com as instruções do fabricante. 1µl de cdna foi adicionado ao 9µl de mastermix contendo DaleneValorie e 0.5µM de cada primer. As amostras foram executadas em CFX96 real-time PCR Detection System (Biorad) com o seguinte programa: 98 C por 30 segundos, 40 ciclos com: 98 C por 5 segundos e 57 C por 5 segundos, então 9.

11 Método modificado de lise osmótica, usando um tampão de transcrição reversa que contêm uma proteína auxiliar para a síntese mais eficiente de cdna; Transcrição reversa direta em 500 células separadas permite uma maior resolução por analisar pequenos subconjuntos celulares em vez de o tecido como um todo, e também é aplicável a clones individuais que crescem em soft ágar. NÃO É MAIS LENTO OU MAIS TRABALHOSO DO QUE PROTOCOLOS PADRÃO DE ISOLAMENTO DE RNA/RT! MUITA VARIABILIDADE!

12 Preparação das linhagens: As glândulas mamárias de um rato de 8-12 semanas de idade foram recolhidas em meio L15 e processadas para células isoladas; Células individuais foram coradas com DAPI para excluir as células mortas; Anticorpos com marcadores que emitem fluorescência foram adicionados: CD45 para excluir linfócitos, juntamente com anticorpos CD24 (antígeno de calor estável) e CD49f (α6 integrina) rotulados para identificar células do epitélio mamário e identificar as linhagens basal e luminal.

13 A maior parte da atividade de células-tronco reside na população de células na ponta da nuvem basal (MRU, unidades de repovoamento mamário, o que é a definição funcional de célulastronco mamárias). A atividade é enriquecida nas progenitoras na ponta da nuvem luminal (CFC, células formadoras de colônias).

14 Nós rotineiramente fazemos triplicatas de 500 células por população de interesse, acrescidas de um tubo adicional com 500 células de um controle menos RT. 500 células de glândulas mamárias equivalem a aproximadamente 2 µl de fluido do invólucro de células classificadas em tubos pré-cheios com solução de lise de 10 µl. A lise celular é baseada em choque osmótico.

15 Seleção da TR Selecionaram a Transcriptase Reversa Superscript III (Invitrogen, Grand Island, NY), pois contêm uma proteína auxiliar (Vilo) que requer até seis ciclos a menos que outras testadas. Obtenção de cdna Obtenção de cdna foi feita pelo mastermix baseado no iscript Select Buffer, tanto com oligodt quanto com hexâmeros aleatórios.

16 Se necessário, a contribuição do DNA genômico para o sinal de qpcr pode ser estimada usando amostras de referência de DNA genômico e conjuntos de primers, contendo íntrons, inclusive. RT-qPCR por SYBR (Bio- Rad) (Fluoróforos ligandose ao dsdna e emitindo fluorescência) foi realizada com 1 µl de cdna em 10 µl de reação, permitindo assim um máximo de 20 transcritos para serem analisados por amostra de 500 células. y/ibcgetattachment.jsp?citemid=20958&fileid= &sitex =10020:22372:US

17 Polycomb Bmi1 é um marcador de célulastronco de tecidos; na glândula mamária, Bmi1 também previne a diferenciação precoce da linhagem luminal e, por isso, tem maior expressão na linhagem luminal. Obs: glândulas mamárias foram retiradas de ratos juvenis!

18 p63 é em supressor tumoral, por isso, sua expressão foi específica para a linhagem basal.

19 O fator de transcrição Elf5 é responsável pela alveologênese, maturação de queratinócitos e destinação de célulastronco. Por isso, sua expressão foi enriquecida na população de células progenitoras luminais.

20 Amostras com Ct entre 27 e 30 ciclos=método é suficientemente sensível para investigar os genes de interesse que são expressos em níveis modestos!

21 O método foi adaptado para ser usado em soft ágar; Crescimento Fixação-Independente em soft ágar é o mais preciso e rigoroso ensaio in vitro para a detecção de transformação maligna das células. Uma aplicação disso é a introdução de um conjunto definido de lesões genéticas que podem transformar células humanas primárias (indiferenciadas) em células capazes de crescer em soft ágar e iniciar tumores em ratos; Surpreendentemente, mesmo em uma população geneticamente definida, apenas uma pequena porcentagem das células formam colônias, o que sugere que características adicionais são selecionadas em soft ágar.

22 Para permitir monitoramento de níveis de transcrição, as colônias individuais que consistem de 100 a 300 células foram colhidas a partir de agarose -soft ágar- (agarose de baixa de gelificação, A9045, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) utilizando uma ponta de pipeta de 200 µl guiada por um estereomicroscópio e cada colônia foi libertada a partir da agarose por centrifugação e ressuspensas em tampão de lise 6 µl. Mais algumas etapas de congelamento/descongelamento, para lise efetiva!

23 htert (human telomerase reverse transcriptase) SV40 T (Simian vacuolating virus 40) Células epiteliais mamárias humanas (HMECs) com crescimento limitado! Ras ativas (RAt Sarcoma vírus) ATIVAÇÃO DA VIA DE p53 (gene de supressão tumoral).

24 Não existe diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão de p21 e HDM2 entre células com p53 ou p14arfshrnas. Suportando a hipótese de que apenas células p14 ARF knockdown (nocaute), que efetivamente impediram a ativação de p53, foram capazes de crescer em soft ágar.

25 Notavelmente, as colônias com a redução mais forte nos níveis de mrna de p21 também tinham maior redução nos níveis de mrna de HDM2, indicando que a variação entre as colônias individuais representa a variação biológica na extensão da inativação de p53 em vez de variação técnica.

26 Em resumo, descrevemos um método conveniente que pode ser utilizado para testar diretamente hipóteses sobre a resposta transcricional de um subconjunto celular, sem a necessidade de amplificação de RNA ou de uma única célula em longas análises. O método direto RT em colônias de soft ágar permite a detecção de níveis de expressão relevantes nas células que formam colônias e revela eventos de seleção que são obscurecidos na população em massa.

27 AGRADECIMENTOS Gostaríamos de agradecer a Manu Beillard pela valiosa contribuição. Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Pesquisa Médica do Conselho Nacional de Saúde de Singapore sob sua Concessão de Desenvolvimento Exploratório (NMRC / EDG / 0066/2009) e Concessão de esquema de pesquisa individual (NMRC / GMS / 1250/2010). OBRIGADA