EUDES OLIVEIRA DA SILVEIRA

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS- UEA FUNDAÇÃO HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS - FHEMOAM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA MESTRADO EM CIÊNCIAS APLICADAS A HEMATOLOGIA EUDES OLIVEIRA DA SILVEIRA ESTUDO DE MARCADORES TROMBOFÍLICOS ASSOCIADOS À GRAVIDEZ DE ALTO RISCO Manaus 2016

2 EUDES OLIVEIRA DA SILVEIRA ESTUDO DE MARCADORES TROMBOFÍLICOS ASSOCIADOS À GRAVIDEZ DE ALTO RISCO Dissertação apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Hematologia da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, para obtenção do Título de Mestre em Ciências aplicadas à Hematologia. Orientadora: Profª Dra. Viviana Maria Araújo de Oliveira Co-Orientador: Msc William Sérgio do Sacramento Manaus 2016

3 FICHA CATALOGRÁFICA Silveira, Eudes Oliveira da Estudo de marcadores trombofílicos associados à gravidez de alto risco. Eudes Oliveira da Silveira Manaus, 2016,... 95f. Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado do Amazonas-UEA. Fundação Hospitalar ade Hematologia e Hemoterapia do Amazonas- FHEMOAM. Programa de Pós graduação em Hematologia. Tiutlo em ingles: Study prothrombotic markers associated with high-risk pregnancy 1.Thrombophilia. 2.High risk pregnancy. 3.Prenatal.

4 FOLHA DE JULGAMENTO ESTUDO DE MARCADORES TROMBOFÍLICOS ASSOCIADOS À GRAVIDEZ DE ALTO RISCO EUDES OLIVEIRA DA SILVEIRA Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências aplicadas à Hematologia, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Hematologia da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. Banca Julgadora: Profª Dra. Viviana Maria Araújo de Oliveira (Presidente) Prof.ª Dr. Nelson Abrahim Fraiji Instituição: Universidade Federal do Amazonas UFAM (Membro) Prof.º Dr. Eric Vinicius de Paula Instituição: Universidade Estadual de Campinas UNICAMP (Membro)

5 AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar a Deus que iluminou o meu caminho durante esta caminhada. À Universidade do Estado do Amazonas-UEA pela oportunidade de ingressar no Programa de Pós-Graduação. À Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas- FHHEMOAM, representada pelo Profº Doutor Nelson Fraiji, com sua dedicação possibilitou a parceira com a UEA, resultando na criação deste programa de mestrado em hematologia no Amazonas e, somado ao seu incentivo a equipe, aproximou sonhos antes distantes À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM, por ser a agência financiadora do projeto. A Profª Doutora Viviana Maria Araújo de Oliveira pelas orientações, pelo incentivo e ajuda nos momentos difíceis da elaboração desse mestrado. A todos os Professores do Programa Visitante Sênior, em especial ao Dr Eric Vinicius de Paula pelo acompanhamento, orientações e paciência no período difícil da elaboração e conclusão dessa dissertação. A toda equipe do ambulatório de Alto risco da Maternidade Balbina Mestrinho e do ambulatório do Pré-natal da Unidade Básica de Saúde Vicente Palloti pela recepção e imensa colaboração junto aos pesquisadores e pacientes. A toda equipe do Laboratório de análises clinicas da Fundação Hemoam que de alguma forma contribuíram para a realização deste projeto. Agradeço de forma especial e carinhosa a minha família, meu pai Ehud, exemplo de vida, minha querida tia Mariazinha, meus filhos Paulo Victor e Gustavo Henrique, razões do meu viver, todos que com paciência me deu força e coragem, me apoiando nos momentos de dificuldades, a quem eu agradeço a minha existência.

6 Lembro que considero família as pessoas especiais que surgem em nossas vidas e que também escolhemos fazer parte da vida delas. À amiga, incentivadora e perseverante Francinet Bacelar, que sendo muito mais que amiga faz parte da família e me apoia incondicionalmente, pela generosa contribuição neste trabalho A todos da minha turma do mestrado, os amigos de longa data e aos novos que surgiram nesse período, pelo convívio divertido e harmonioso, em que o companheirismo foi soberano nesta difícil caminhada. As gestantes que aceitaram participar dessa pesquisa não só por desejo de ter um diagnóstico adequado para seu problema, mas, também, com a vontade de poder colaborar com a implantação de um futuro ambulatório de coagulação e trombose que irá favorecer toda a comunidade. E a todos aqueles que de alguma forma contribuem para o meu desenvolvimento pessoal e profissional.

7 É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espirito, que nem gozam muito e nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota (Theodore Rossevelt)

8 RESUMO A chamada pesquisa de trombofilias, vem sendo amplamente utilizada na arena obstétrica como ferramenta de estratificação de risco para complicações de diversas natureza, muitas vezes sem um embasamento científico adequado. Desta abordagem resulta o uso inadequado de heparina para gestantes, o que está associado não apenas a desconforto e gastos desnecessários, mas também a aumento da frequência de sangramentos e do risco de outras complicações da heparina como osteoporose. O presente trabalho teve por objetivo, avaliar e comparar o perfil demográfico e clínico, como também, caracterizar as alterações de parâmetros da hemostasia associados direta ou indiretamente ao risco de eventos tromboembólicos, em uma população de gestantes atendidas no ambulatório de alto risco da Maternidade Balbina Mestrinho em Manaus AM com antecedentes de alterações vásculo-placentárias e outra população de gestantes de risco habitual da Unidade Básica de Saúde (UBS) Vicente Palloti Manaus-AM. O recrutamento das gestantes, ocorreu em julho de 2014 a setembro de 2015 e foi realizado a partir do rastreamento de casos e controles elegíveis nos prontuários médicos das instituições envolvidas, completado em entrevista com o pesquisador, na qual as voluntárias foram esclarecidas sobre o estudo. Os parâmetros laboratoriais como: níveis de anticoagulantes naturais: proteína C, proteína S, antitrombina; alterações moleculares: mutação do fator V Leiden, mutação do gene da protrombina, mutação no gene metilenotetrahidrofolato redutase; alterações imunológicas: anticardiolipina, anticoagulante lúpico, anticorpo antiβ-2glicoproteina e outros marcadores: homocisteína, dímero D, vitamina B12 e ácido fólico, foram realizados em laboratórios especializados, avaliados e também comparados entre os grupos estudados. O perfil demográfico de nossa população de estudo com patologia vásculo-placentário, tem a média de idade de 31,8 anos, é da raça parda, escolaridade de 2º grau completo, estava no terceiro trimestre da gestação (idade gestacional de 29,9 semanas), a média do número de gestações foi de 3,88 e de abortos 1,3 e apresentava obesidade. A pré-eclâmpsia e as perdas gestacionais recorrentes foram as patologias vásculoplacentária mais comum. Nossos resultados também revelaram: ausência de associação entre marcadores diretos e indiretos de risco para TEV ( marcadores trombofílicos) e a ocorrências de complicações vásculo placentárias; ausência no aumento da frequência de FV de Leiden, mutação do gene da protrombina, polimorfismo no gene MTHFR e de marcadores sorológicos da SAF e nem redução nos níveis de anticoagulantes naturais em nossa população de estudo; houve equivalência entre as dosagens de homocisteína e dímeros D entre as duas populações estudadas. Neste contexto, nossos resultados apoiam: a relevância para o entendimento da fisiopatologia das complicações vásculo-placentárias; o conceito atual de que o uso sistemático destes testes na avaliação de risco gestacional não é indicado, destacando ainda o efeito importante da gestação sobre os valores de PS e ainda, de que a disseminação destes resultados na comunidade de hematologistas e obstetras trará benefícios importantes para a saúde pública de nossa região. Palavras-chave: Trombofilia; Gravidez alto risco; Pré-natal.

9 ABSTRACT The known thrombophilia research has been widely used in the obstetric arena as a risk stratification tool for various kinds of complications, often without an adequate scientific basis. This approach results in the inappropriate use of heparin for pregnant women, which is associated not only with discomfort and unnecessary spending, but also with the increase of bleeding frequency and with the risk of other complications related to heparin, such as osteoporosis. This present study is aimed to evaluate and compare the demographic and clinical profile, and also to characterize the parameter alterations associated directly or indirectly to the risk of thromboembolic hemostasis events in a population of high risk pregnant women at the maternity clinic Balbina Mestrinho in Manaus-AM who have a history of vascular- placental alterations as well as another population of usual risk pregnant women of the Basic Health Unit (BHU) Vicente Palloti Manaus-AM. The recruitment of the pregnant women happened from July 2014 to September 2015 and was carried out by tracking cases and eligible controls in the medical records of the involved institutions. It ended with an interview with the researcher, in which the volunteers were informed about the study. The laboratory parameters such as levels of natural anticoagulants: protein C, protein S, antithrombin; molecular alterations: Leiden V factor mutation, prothrombin gene mutation, mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene; immunological changes: anticardiolipin, lupus anticoagulant, antiβ2glicoproteina antibody and other markers: homocysteine, D-dimer, vitamin B12 and folic acid were carried out in specialized laboratories, evaluated and also compared between the groups. The demographic profile of our study population with placental vascular pathology, has the average age was 31.8 years, is latin/hispanic, High School graduate education, it in the third trimester of pregnancy (gestational age of 29.9 weeks), with an average number of 3.88 pregnancies and 1.3 abortions, having obesity. Preeclampsia and recurrent pregnancy loss were the most common placental vascular pathology. Our results also showed: lack of association between direct and indirect risk markers for VTE (prothrombotic markers) and the occurrence of placental vascular complications; absence in the increased frequency of FV Leiden, prothrombin gene mutation, polymorphism in the MTHFR gene and serological markers of APS nor reduction in the levels of natural anticoagulants in our study population; there was equivalence between homocysteine and dimers D levels between the two study groups. In this context, our results support: the relevance for understanding the pathophysiology of vascular- placental complications; the current concept that the systematic use of these tests in pregnancy risk assessments is not indicated, also emphasizing the important effect of pregnancy on the PS values and also that the dissemination of these results in hematological and obstetric community will bring important benefits to public health in our region.. Keywords: Thrombophilia; high risk pregnancy; prenatal.

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação do modelo de coagulação baseado em superfícies celulares... Figura 2. Atuação dos anticoagulantes naturais nas vias da cascata da coagulação... Figura 3. Mecanismos patogênicos que levam a complicações obstétricas em SAF Figura 4. Delineamento do estudo Figura 5. Fluxo da seleção de grupos Figura 6. Comparação dos níveis circulantes de proteína S Figura 7. Comparação dos níveis circulantes de proteína Figura 8. Comparação dos níveis circulantes de antitrombina Figura 9. Comparação dos níveis circulantes de homocisteína Figura 10. Comparação dos níveis circulantes de ácido fólico Figura 11. Comparação dos níveis circulantes de vitamina B Figura 12. Comparação dos níveis circulantes de D-dímeros... 57

11 LISTA DE QUADRO E TABELAS Quadro 1. Testes laboratoriais para marcadores adquiridos e hereditários para trombofilias Tabela1. Associação entre trombofilias e complicações na gestação Tabela 2. Características demográficas e clínicas dos grupos de estudo Tabela 3. Distribuição da idade gestacional, escolaridade, estado nutricional por 51 trimestre... Tabela 4. Distribuição da paridade e número de abortos no grupo de estudo Tabela 5. Distribuição das patologias relacionadas as alterações vásculo 52 placentárias e outras patologias encontradas no grupo alto risco... Tabela 6. Frequência de marcadores trombofílicos hereditários Tabela 7. Frequência de marcadores trombofílicos adquiridos Tabela 8. Marcadores trombofílicos no subgrupo de pacientes com pré-eclâmpsia... 58

12 LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS AAF Anticorpo antifosfolípide acl Anticorpo anticardiolipina AL Anticoagulante lúpico Arg -arginina AT Antitrombina CEP Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos DPP Descolamento prematuro de placenta ELISA Enzima imuno ensaio EPCR Receptor endotelial da proteína C FAPEAM Fundação de Amparo a pesquisa do Estado do Amazonas FT Fator tecidual FVL Fator V Leiden FvW Fator de von Willebrand IC Intervalo de confiança IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M Gln Glutamina LES Lúpus eritematoso sistêmico MTHFR Metilenotetrahidrofolato redutase OR Odds ratio PAI Inibidor específico do plasminogênio PC Proteína C PCa Proteína C ativada PCR Reação em cadeia da polimerase PDF Produto de degradação da fibrina PPSUS Programa de pesquisa para o SUS PS Proteína S RCIU Restrição de crescimento intrauterino RNAm Ácido ribonucleico mensageiro SAF Síndrome do anticorpo antifosfolípide SUS Sistema Único de Saúde TAFI Inibidor fibrinolítico ativado pela trombina

13 TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido TEV Tromboembolismo venoso e arterial TFPI Inibidor da via do fator tecidual TM Trombomodulina TP Tempo de protrombina t-pa Ativador Tecidual do plasminogênio TTPa Tempo de tromboplastina parcial ativado UBS Unidade Básica de Saúde u-pa Ativador tipo uroquinase do plasminogênio α2-ap - α2-antiplasmina β2-gpi β2-glicoproteína I

14 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Aspectos gerais Fisiologia da Coagulação Hemostasia secundária Mecanismos reguladores da hemostasia Sistema fibrinolítico A importância do balanço hemostático Alterações da hemostasia na gestação O papel potencial do fator tecidual (FT) na fisiologia das alterações 26 vásculo placentárias Doenças vásculo-placentárias e a interface materno-fetal Alterações vásculo- placentárias Pré-eclampsia Retardo de crescimento intrauterino (RCIU) Aborto de repetição Perdas fetais Descolamento prematuro da placenta (DPP) Marcadores trombofílicos e alterações vásculo-placentárias Fator V Leiden (FVL) e Mutação da Protrombina Polimorfismo no gene MTHFR e homocisteína Hiperhomocisteinemia Síndrome do anticorpo antifosfolípide (SAF) Dímero D (D- di) Obesidade e perdas recorrentes na gravidez JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Desenho do estudo População de estudo, estratégia de recrutamento e amostragem Dados demográficos e clínicos Definições de complicações vásculo-placentárias Coleta e processamento de amostras Testes laboratoriais Análises Estatísticas Aspectos Éticos Financiamento Delineamento do estudo... 50

15 5. RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ANEXOS Anexo 1 Aprovação do PPSUS Anexo 2 Permissão para utilização de imagem APÊNDICES Apêndice 1 Protocolo de Estudo Ficha individual Apêndice 2 Termo de Consentimento Livre Esclarecido TCLE Apêndice 3 Delineamento Experimental Extração do DNA... 94

16 16 1. INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos gerais As trombofilias são desordens da hemostasia que levam a um estado de hipercoagulabilidade e maior predisposição ao tromboembolismo venoso (TEV) (trombose venosa profunda e embolia pulmonar). Além disso, ao longo das últimas décadas vários estudos avaliaram a associação entre a presença destas trombofilias em gestantes e desfechos obstétricos negativos, com resultados conflitantes (1). Dentre as trombofilias associadas a risco aumentado de TEV destacam-se: (i) trombofiliais adquiridas, como a síndrome do anticorpo antifosfolípide (SAF), e (ii) trombofilias hereditárias, tais como a deficiência de proteína C (PC) e proteína S (PS), a deficiência de antitrombina (AT), a presença do fator V de Leiden (FVL), e a ocorrência de mutação no alelo G20210A do gene da protrombina (2). Também associada a risco aumentado de TEV, a hiperhomocisteinemia é considerada uma trombofilia com determinantes mistos, isto é, hereditários e adquiridos (3). Na gestação normal ocorrem mudanças na hemostasia, incluindo o aumento da concentração da maioria dos fatores de coagulação, a diminuição dos níveis de anticoagulantes naturais e uma redução da atividade fibrinolítica (4). Essas mudanças fisiológicas resultam num estado de hipercoagulabilidade que protege a mulher da hemorragia durante o parto ou possível abortamento. Assim, durante a gestação, todos os fatores de risco para o TEV descritos na chamada Tríade de Virchow estão presentes, a saber: hipercoagulabilidade, estase e dano vascular (5). Em consequência, a gestante apresenta um risco aproximadamente cinco vezes maior de eventos tromboembólicos, especialmente quando também portadora de outros fatores genéticos ou adquiridos que predispõem à trombose (6). Uma questão relativamente controversa na literatura é se a presença destas trombofilias também implicam em risco aumento de complicações obstétricas cuja fisiopatologia pode estar relacionada a alterações na circulação placentária. Entre as complicações obstétricas consideradas como vásculo-placentárias, destacam-se: a pré-eclâmpsia, a restrição de crescimento intrauterino (RCIU), o descolamento prematuro de placenta (DPP), as perdas fetais recorrentes, e o abortamento de repetição (7).

17 17 Para uma melhor compreensão da fisiopatologia destas complicações e de sua associação com alterações da hemostasia, iremos revisar brevemente os mecanismos fisiológicos da hemostasia. 1.2 Fisiologia da coagulação O sistema hemostático é composto por uma sequência de eventos integrados que envolvem componentes do endotélio vascular, plaquetas, proteínas da coagulação, fibrinólise e anticoagulantes naturais. Têm como objetivo final a interrupção de sangramentos provenientes de lesão vascular e manter o fluxo sanguíneo. Em condições fisiológicas, ou seja, sem ausência de lesão vascular, há predomínio dos mecanismos anticoagulantes sobre os procoagulantes, mantendo-se assim, a fluidez sanguínea e a desobstrução do sistema circulatório (8). A resposta primária da hemostasia engloba o endotélio vascular e as plaquetas, resultando na formação do trombo plaquetário. As proteínas da coagulação formarão a fibrina, que reforçará este trombo primário. Finalmente o sistema fibrinolítico irá dissolver o trombo gradualmente, a fim de restaurar o fluxo sanguíneo normal (9). Apesar da importância do endotélio na fisiopatologia das complicações vásculoplacentárias da gestação (7), o estudo da hemostasia secundária e dos mecanismos reguladores da hemostasia é também muito importante para o entendimento das potenciais associações entre hipercoagulabilidade e estas complicações Hemostasia secundária A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre proteases plasmáticas e seus cofatores, que culminam na gênese da trombina, que atua como regulador importante da hemostasia, além de converter o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel. A proposta para explicar a fisiologia da coagulação do sangue usando a hipótese de uma cascata foi criada por Macfarlane e Davie & Ratnoff (10,11). De acordo com este modelo, a coagulação é dividida em uma via extrínseca (envolvendo componentes do sangue e elementos que usualmente não estão presentes no espaço intravascular) e uma via intrínseca (iniciada por componentes presentes no intravascular), que convergem no ponto de ativação do fator X ( via final comum ).

18 18 Na via extrínseca, o fator VII plasmático (na presença do seu cofator, o fator tecidual ou tromboplastina) ativa diretamente o fator X. Na via intrínseca, ativação do fator XII ocorre quando o sangue entra em contato com uma superfície, contendo cargas elétricas negativas (por exemplo, a parede deum tubo de vidro). Tal processo é denominado ativação por contato e requer ainda a presença de outros componentes do plasma: précalicreína e cianogênio de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator XIIa ativa o fator XI, que, por sua vez, ativa o fator IX. O fator IXa, na presença de fator VIII, ativa o fator X da coagulação, desencadeando a geração de trombina e subsequente formação de fibrina (9). Embora útil do ponto de vista didático e clínico, a divisão do sistema de coagulação sanguínea em intrínseco e extrínseco é considerada inadequada do ponto de vista fisiológico, pois a mesma não ocorre desta forma in vivo. Mais recentemente, um novo modelo vem sendo utilizado, conhecido como modelo celular da hemostasia (12). De acordo com este modelo, a ativação da coagulação é dividida em 3 fases: iniciação, amplificação e propagação. Na fase de iniciação, a coagulação é ativada quando o fator tecidual (FT), uma proteína transmembrana expressada por praticamente todas as células do organismo, mas nunca por células em contato com a luz dos vasos, entra em contato com o plasma. Isto ocorre por exemplo quando há ruptura da integridade endotelial em um trauma. O FT se liga ao FVIIa formando o chamado complexo de iniciação da hemostasia, que ativa o FX em FXa, levando à geração de concentrações muito pequenas de trombina, ainda incapazes de levarem a formação de fibrina. Na fase seguinte da coagulação, chamada de amplificação, a trombina inicia uma série de reações que têm como objetivo aumentar sua própria geração, de modo que a concentração final de trombina atinja valores que permitam a formação do trombo. Estas reações incluem: (1) ativação das plaquetas, onde ocorrerão todas estas reações; (2) ativação do fator XI, iniciando a ação da chamada via intrínseca da coagulação para também cooperar com a geração de fator X ativado e de trombina; (3) ativação dos cofatores da cascata da coagulação, que são os fatores V e VIII e (4) ativação do fator XIII. A concentração de trombina atinge então quantidades necessárias para a formação de fibrina, dando início a fase final da coagulação, conhecida como

19 19 propagação, quando um coágulo rico em plaquetas e fibrina se propaga pela região onde a hemostasia foi iniciada pela expressão de FT (13). Estes passos são mostrados em forma de esquema na Figura 1. Todos estes passos possuem inibidores naturais, cuja ação fundamental para manter o sistema em equilíbrio, sem tendências a sangramentos ou a tromboses. Os inibidores conhecidos são: (1) o inibidor da via do fator tecidual (TFPI), que inibe o complexo FT/FVIIa; (2) a antitrombina (AT), que inibe as serinaproteases da cascata como o fator Xa e a trombina, entre outras e (3) a proteína C ativada (PCa), que inibe os fatores Va e VIIIa. A diminuição destes inibidores aumenta o risco de tromboses venosas (14).

20 20 Figura 1. Representação do modelo de coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação. Adaptado de Vine AK. Recent advances in haemostasis and thrombosis. Retina, 2009; 29(1)1:7 (19) Mecanismos reguladores da hemostasia Para evitar a excessiva ativação da coagulação, evitando formação inadequada de fibrina e oclusão vascular, as reações bioquímicas da coagulação do sangue devem ser estritamente reguladas. Esta regulação é feita por quatro anticoagulantes naturais: o inibidor da via do fator tecidual (TFPI), a PC, PS e a AT (13).

21 21 O TFPI é uma proteína secretada pelo endotélio, que forma um complexo quaternário FT/FVIIa/FXa/TFPI inativando os fatores ativados e, portanto, limitando a coagulação (15). O complexo fator VIIa/FT atua sobre dois substratos principais: os fatores IX e X da coagulação, ativando-os. Essas reações são reguladas pelo TFPI, uma proteína produzida pelas células endoteliais, que apresenta três domínios do tipo Kunitz. O primeiro domínio liga-se ao complexo fator VIIa/FT, inibindo-o, e o segundo domínio liga-se e inibe o fator Xa. Assim, a ativação direta do fator X é regulada negativamente de modo rápido na presença do TFPI, que limita, desta forma, a produção de fator Xa e fator IXa. A ligação do fator Xa é necessária para que o TFPI exerça seu papel inibitório sobre o complexo fator VIIa/FT (9). As PC e PS são dois outros anticoagulantes naturais, com capacidade de inativar os cofatores procoagulantes FVa e FVIIIa. A PC é uma proteína da coagulação dependente de vitamina K, sintetizada nos hepatócitos e circula no plasma em concentrações muito baixas. Sua ativação ocorre sobre a superfície de células endoteliais pela trombina que está vinculada ao receptor endotelial trombomodulina (TM) (16). A PC, quando ligada ao seu receptor no endotélio EPCR (endothelial PC receptor), é ativada após a ligação da trombina à TM. A PCa inibe a coagulação, clivando e inativando os fatores Va e VIIIa, processo que é potencializado pela PS, que atua como um cofator não enzimático nestas reações de inativação. A identificação do sistema da PCa implicou importante mudança conceitual no que se refere ao papel da trombina no sistema hemostático. Não obstante seu papel procoagulante, quando gerada em excesso, sua função, na fisiologia do sistema também envolve a ativação de mecanismos reguladores anticoagulantes como o da PC (17). A PS é sintetizada principalmente nos hepatócitos, mas, também nos megacariócitos, osteoblastos, células de Leydig e músculo liso vascular. A PS também é uma proteína dependente de vitamina K e possui um importante papel no sistema de coagulação natural, aumentando a velocidade de inativação, mediado pela PCa, do fator Va e do fator VIIIa (17). Os níveis de PS são influenciados pelo sexo, idade e estado hormonal. Em geral, mulheres possuem níveis mais baixos de PS que os homens, e os níveis de PS aumentam com a idade nas mulheres, possivelmente devido à influência hormonal. Níveis mais baixos são observados antes da

22 22 menopausa, durante a terapia com contraceptivos orais ou reposição hormonal, e durante a gestação (18). A AT é uma α2-globulina sintetizada predominantemente no fígado, cuja função e inibir serinoproteases que inativa fisiologicamente a trombina (fator II ativado) e o fator Xa, e em menor quantidade inativa os fatores IXa, XIa, XIIa. Além do seu papel anticoagulante também se verificou que a AT possui efeito anti-inflamatório, onde a inibição de trombina e fator Xa e sua consequente redução faz com que ocorra a liberação de citocinas, tais como a interleucina 6 e 8. Devido à ligação da AT ao heparansulfato, proteoglicano presente nas células endoteliais, há um aumento importante de citocinas e prostaciclinas que iram desencadear o relaxamento da musculatura vascular e a inibição da agregação plaquetária (19). Os diferentes mecanismos reguladores da coagulação sanguínea não trabalham isoladamente, havendo sinergismo entre o TFPI e a AT e entre o TFPI e o sistema da PCa, suprimindo a produção da trombina pelo complexo fator VII/FT (8). A relevância biológica destes anticoagulantes naturais fica clara pelo risco aumentado de TEV em pacientes com deficiências leves de cada um destes fatores (20) e pela ocorrência de hipercoagulabilidade grave, incompatível com a vida, nas deficiências completas destas proteínas, como nos casos de purpura fulminante neonatal (21) Figura 2. Figura 2. Atuação dos anticoagulantes naturais nas vias da cascata da coagulação.

23 Sistema fibrinolítico A fibrinólise é o mecanismo final que se contrapõe ao processo de coagulação. Ela é iniciada pelos ativadores do plasminogênio, os quais convertem o plasminogênio na enzima ativa plasmina, que possui atividade fibrinolítica. Os ativadores do plasminogênio são: o ativador tecidual do plasminogênio (t-pa) e o ativador tipo uroquinase do plasminogênio (u-pa) (22). Os dois ativadores possuem alta afinidade de ligação com o seu substrato (plasminogênio) e promovem a ativação eficiente do plasminogênio em plasmina. A plasmina cliva o fibrinogênio e/ou a fibrina, gerando produtos de degradação. Um destes produtos são os dímeros D (D-di), amplamente usados na arena diagnóstica como marcadores indiretos da geração de trombina. Os produtos da degradação do fibrinogênio/fibrina inibem a ação da trombina e a polimerização da fibrina (8). Embora atue na fase final da formação do coágulo, sabese hoje que este sistema é ativado precocemente pela trombina e pelo fator XII. Desvios na regulação do sistema fibrinolítico também estão associados a aumento de sangramentos (hiperfibrinólise) ou tromboses (hipofibrinólise) (23) A importância do balanço hemostático Em condições fisiológicas, ou seja, sem ausência de lesão vascular, há predomínio dos mecanismos anticoagulantes sobre os procoagulantes, mantendo-se assim, a fluidez sanguínea. A manutenção do chamado balanço hemostático é um processo ativo, que envolve o endotélio. Situações de estresse orgânico de diversas naturezas, tais como infecções, traumas, cirurgias, entre outros, resultam na produção de mediadores inflamatórios que tendem a desequilibrar este balanço, ora para o pólo do sangramento, ora para o pólo das tromboses. Nestas situações, o bom funcionamento do sistema regulador composto por endotélio, trombina, e sistemas anticoagulantes naturais é fundamental para preservação da homeostase vascular. Não por acaso, indivíduos com alterações nestes sistemas, como por exemplo aqueles portadores de trombofilias hereditárias, em geral apresentam tromboses apenas na vigência de situações de estresse tais como cirurgias, imobilizações, entre outras. Embora a gestação normal não possa ser considerada uma condição patológica, ela cursa com uma série de modificações que exigem adaptações do

24 24 sistema hemostático, como veremos a seguir. Tal como ocorre nas situações citadas acima, podemos imaginar que indivíduos com defeitos nos sistemas regulatórios apresentem também maior susceptibilidade para complicações vásculo-placentárias. 1.3 Alterações da hemostasia na gestação Durante à evolução da gestação o organismo materno altera-se para propiciar a proteção e a desenvolvimento do embrião e feto. Deste modo ocorrem mudanças fisiológicas e anatômicas, como as modificações uterinas, hipertrofia e dilatação, aumento da vascularização pela necessidade de maior perfusão sanguínea. Na placenta, devido ao aumento progressivo, há uma maior circulação de sangue materno-fetal durante, necessitando, assim, do aumento do número de vasos sanguíneos (7). As alterações no sistema de coagulação durante a gestação são consideradas mecanismos adaptativos e destinam-se a: (1) a prevenção de hemorragias no momento da implantação trofoblasto e a expulsão do feto; (2) permitir o fluxo laminar no espaço interviloso placentário; e (3) selar vazamento de líquido amniótico e reduzir a hemorragia obstétrica. Na gravidez normal há um aumento na geração de trombina e da agregação plaquetária (24,25). Além disso, ocorre também a diminuição das propriedades anticoagulantes naturais e da fibrinólise, contribuindo para o desequilíbrio do balanço hemostático para o polo de hipercoagulabilidade (26). Em conjunto, estes dados nos permitem definir a gestação como um estado prótrombótico. Em relação à hemostasia primária, observamos uma pequena diminuição no número de plaquetas, possivelmente relacionadas a hemodiluição e consumo, mas cujos mecanismos ainda não estão claros. Por outro lado, ocorre também um aumento progressivo da produção de tromboxano A2, que induz a agregação plaquetária (27). Ainda em relação à hemostasia primária, observamos um importante aumento nos níveis de fator de von Willebrand (FvW), que pode chegar a até 400% (28). Em relação à hemostasia secundária, observamos que o fibrinogênio aumenta, progressivamente, até o parto de 2 a 3 vezes nas suas concentrações. Além disso,

25 25 ocorrem aumentos de 20% a 1000% nos fatores VII, VIII, IX, X, XII (28). A protrombina e o fator V permanecem inalteradas, enquanto as concentrações dos fatores XIII e XI apresentam queda moderada (29). FVIII é uma glicoproteína sintetizado e liberado pelo endotélio vascular, onde apresenta-se ligado ao FvW para formar um complexo estável. O fator VIII na da trombina ou fator Xa, se dissocia do complexo para interagir com o fator IXa na cascata da coagulação. Assim, o Fator VIII age como cofator para o fator IXa na ativação do fator X, e o fator X com o seu cofator fator Va, ativa ainda mais a trombina. Assim, a trombina cliva o fibrinogênio em fibrina que se polimeriza e fazendo ligações cruzadas com o fator XIII forma o coágulo sanguíneo. O FVIIIa sem a ligação com o FvW é inativado pela PC e pelo fator IXa sendo rapidamente removido do sangue (28). Quanto aos anticoagulantes naturais, também observamos mudanças importantes durante a gestação normal. A concentração de PS livre diminui em até 55%, devido a um aumento da circulação da sua proteína de ligação ao complemento 4b. A PS tem seu ponto mais baixo durante o parto e esta redução se agrava no parto cesáreo e infecções. O diagnóstico da deficiência hereditária de PS é notavelmente difícil, devido à sobreposição dos níveis de PS em portadores e não portadores de mutações e variações dos níveis relacionados à idade, sexo e condições adquiridas do indivíduo. Para evitar falso positivo deve-se realizar o exame após o termino da terapia com estrogênio ou antagonista da vitamina K. Em gestantes os resultados positivos devem ser confirmados após o puerpério (29,30). Por sua vez, a PCa encontra-se aumentada durante a gestação e sua atividade é aumentada por alguns cofatores, como a PS, inativando os fatores Va e VIIIa com consequente hipercoagulabilidade. Assim, pacientes com deficiência de PC possuem uma capacidade diminuída para regular a propagação e geração de trombina, fator V e fator VIII, após a ativação da PC pela pequena quantidade de trombina gerada no início da coagulação (29,30). A concentração do inibidor especifico do plasminogênio (PAI-1 e PAI-2). O PAI- 1 aumenta de 3 a 4 vezes durante a gravidez e valores plasmáticos de PAI-2, que são

26 26 insignificantes antes da gravidez, podem atingir altas concentrações no momento do parto (30). Por fim, a gravidez normal está associada com um perfil de hipercoagulabilidade em testes globais da hemostasia. Observamos aumento da geração de trombina (24,31), bem como, da elevação das concentrações maternas de fibrinopeptídeo A, fragmentos protrombina 1 e 2, complexos trombina-antitrombina (TAT) (24,32). A concentração destes complexos novos aumenta durante e após o parto normal e, posteriormente, diminui durante o puerpério (24,33) O papel potencial do fator tecidual (FT) na fisiopatologia das alterações vásculo-placentárias O FT tem papel fundamental na ativação da coagulação por ser o responsável pela sua iniciação. Condições patológicas associadas a aumento da expressão intravascular de FT (como parte da ativação endotelial) cursam com desequilíbrios importantes do balanço hemostático e risco aumentado de tromboses, como no caso clássico da sepse e coagulação intravascular disseminada (34,35). Um dos mediadores mais importantes do estado de hipercoagulabilidade da gravidez normal parece ser o FT. Com efeito, há um aumento substancial da concentração de FT na placenta e miométrio (36). A placenta é uma importante fonte de FT devido à organização citoarquitetônica das células trofoblásticas, que se comportam como endotélio ativado. A exposição aumentada de FT na placenta, se não controlada por mecanismos anticoagulantes fisiológicos, predispõe a complicações trombóticas (36). O principal mecanismo de inibição de FT é o TFPI, cujo RNAm é altamente expresso em macrófagos nas vilosidades em placenta (37). O TFPI foi também encontrado no líquido amniótico (38), sugerindo que a interação entre estes dois mediadores seja importante durante a gestação normal (39). 1.4 Doenças vásculo-placentárias e a interface materno-fetal O sucesso da gestação está relacionado ao desenvolvimento da placenta normal e ao estabelecimento de uma circulação materno-fetal adequada. As redes da árvore vascular placentária, tanto do lado materno como fetal são estruturas

27 27 dinâmicas que podem ser alteradas em casos de placentação anormal e invasão do trofoblasto. O trofoblasto humano tem propriedades de células endoteliais e pode regular o grau de ativação da cascata de coagulação no espaço interviloso (40). Os trofoblastos vilosos expressam o sulfato de heparina, a PC, entre outros reguladores da hemostasia na sua superfície, que atuam como mediadores anticoagulantes, e sustentam o fluxo sanguíneo laminar através do espaço interviloso (7). Por outro lado, ao contrário do endotélio de outros órgãos, o trofoblasto apresenta FT constitutivamente ativo em sua superfície (40). Este FT tem ainda uma afinidade mais elevada pelo o fator VIIa, o que pode contribuir para o aumento da ativação da cascata de coagulação (41). Figura 3. Mecanismos patogênicos que levam a complicações obstétricas em SAF. (Willis R, Pierangeli S. Pathophysiology of the antiphospholipid antibody syndrome. Autoimmun Highlights. Online March 24, doi: /s ; com permissão)(124). Estas observações ilustram o papel crítico da regulação do balanço hemostático para o bom funcionamento da interface materno-fetal, e tornam plausível a hipótese de que alterações neste balanço, possam levar a aumento de complicações vásculo-placentárias. A seguir, definiremos brevemente as complicações vásculoplacentárias potencialmente associadas a alterações da hemostasia.

28 Alterações vásculo-placentárias O grupo de condições conhecido como alterações vásculo-placentárias inclui complicações como pré-eclampsia, aborto de repetição, perdas fetais, DPP e RCIU. Estas patologias serão objetos de discussão nessa dissertação Pré-eclampsia A pré-eclâmpsia é considerada o exemplo clássico de associação entre síndrome obstétrica e lesão vascular, apresentando anormalidade da circulação placentária e subperfusão materna (42). A pré-eclâmpsia é uma condição específica da gestação que envolve a falência de diversos órgãos e está associada à hipertensão e proteinúria. Ela é caracterizada por aumento da pressão sanguínea, que provoca efeitos deletérios sobre diversos sistemas, principalmente o vascular, o hepático, o renal e o cerebral. A prevalência da pré-eclâmpsia gira em torno de 4,6% das gestações em todo o mundo (43). Em todo o mundo, 10 a 15% das mortes maternas diretas (isto é, resultante de complicações obstétricas de gestação) estão associados com pré-eclampsia. A pré-eclampsia apresenta alta incidência de mortalidade e morbidade fetal e materna, sendo uma das principais causas de morte materna no Brasil (37% das causas de morte obstétricas diretas) (44) Um estudo de base populacional observou que a pré-eclampsia de início tardio ( 34 semanas) é mais prevalente do que a doença de início precoce (<34 semanas) (45). As mulheres com pré-eclâmpsia têm um risco aumentado de eventos graves como DPP, lesão renal aguda, hemorragia cerebral, insuficiência hepática ou ruptura, edema pulmonar, coagulação intravascular disseminada, e evolução para eclâmpsia (44,46). Os principais fatores de risco para a pré-eclampsia são: história passada de pré-eclâmpsia; primeira gravidez; uma história familiar de pré-eclâmpsia; comorbidades (como diabetes pré-gestacional, pressão arterial 130/ 80 mmhg, presença de anticorpos antifosfolípides, índice de massa corporal 26.1, doença renal crónica (IRC), gravidez gemelar e idade materna avançada) (47 50).

29 29 Como destacado acima, já foram descritas lesões vasculares na placenta de pacientes com pré-eclâmpsia. Estas lesões são mais graves quanto mais precoce a idade gestacional em que a doença se instala (51). Mulheres com pré-eclampsia que apresentam complicações como o RCIU apresentam lesões vasculares fetais compatíveis com doença trombo-oclusiva fetal em comparação com mulheres com pré-eclampsia sem RCIU (51). Em relação à hemostasia, já foi demonstrado que gestantes com pré-eclâmpsia apresentam expressão aumentada do FT na placenta uma redução da expressão de TFPI, com uma correlação significativa entre os níveis de FT e TFPI entre plasma materno e placenta (52) Retardo de crescimento intrauterino (RCIU) Outra condição que pode resultar de anomalias na vasculatura placentária é a RCIU (53,54). A RCIU ocorre quando o feto não atinge o tamanho esperado ou determinado pelo seu potencial genético, sendo identificada clinicamente quando o peso fetal está abaixo do percentil 10 para a idade gestacional (55). Ela é uma causa frequente de morte fetal, morbidade perinatal e sequelas de longo prazo, embora sua etiologia seja desconhecida na maioria dos casos. Estudos sugerem que a RCIU esteja associada com anormalidades da vasculatura placentária e o desequilíbrios da hemostasia levando a uma circulação inadequada materna e fetal (50,56). De modo geral, pode-se afirmar que a RCIU é um problema clínico comum, podendo ocorrer em 7% a 15% das gestações (57). No Brasil a ocorrência de RCIU está estimada entre 4,3 a 13,1% das gestações (58). As placentas de gestações relacionadas ao RCIU são menores e têm, significativamente, aumento das lesões vasculares maternas e fetais em comparação com placentas de gestações normais, com recém-nascidos de idade gestacional adequada (59,60). Essas lesões vásculo-placentárias maternas foram detectados em cerca de 50% das placentas de gestações que evoluíram com RCIU, em comparação com apenas 20% em gestações normais, ao passo que as lesões vásculoplacentárias fetais foram observados em 11% das gravidas com RCIU em comparação com apenas 4% em placentas de gestações normais (51). Outro estudo

30 30 mostrou que placentas de gestações com RCIU de início tardio mostram também mais anormalidades vasculares fetais, em comparação com controles sem RCIU (61) Aborto de repetição A definição de aborto de repetição pode variar conforme protocolos empregados e é um desafio para o aconselhamento e tratamento de casais com esse histórico. As definições de aborto de repetição incluem: a) duas ou mais perdas gravídicas documentadas por ultrassonografia ou exame histopatológico, b) três perdas de gravidez consecutivos, podendo ser não intrauterina (62). Essas perdas de repetição podem ainda ser dividas em perdas primárias e secundárias. As perdas primárias referem-se a perda da gravidez em mulheres que nunca tiveram filhos e a secundária refere-se a perda da gravidez em uma mulher que teve um nascimento anterior (que demonstram ter melhor prognóstico) (63). Em relação ao número de aborto de repetição, um estudo identificou que cerca de 15% das mulheres grávidas apresentam perda esporádica de uma gravidez clinicamente reconhecida, sendo que 2% das mulheres grávidas apresentam duas perdas consecutivas na gravidez e entre 0,4 a 1% têm três perdas consecutivas na gravidez (64). Quanto a etiologia das causas de abortos, em apenas 50% das pacientes são definidos. O risco de recorrência dessas perdas inclui causas anatômicas, imunológicos, genéticos, endócrinos, infecciosos, idade materna e fatores ambientais. A presença de marcadores trombofílicas é frequentemente citada como causa potencial destas perdas (65). Especula-se que a trombose das artérias em espiraladas e do espaço interviloso no lado materno da placenta poderiam comprometer a perfusão placentária adequada. Uma relação à perda de gravidez precoce é menos clara e pode ser restrito a defeitos trombofílicos específicos que não foram completamente definidos, ou a presença de vários defeitos (66,67). A associação entre abortos de repetição e SAF reforça esta possibilidade (68).

31 Perdas fetais Dentre os diversos resultados perinatais adversos, encontra-se o óbito fetal, que é definido pela morte do produto conceptual, antes de sua expulsão ou extração completa do organismo materno. A maioria dos autores considera o óbito fetal aquele ocorrido posteriormente à 20ª semana de gestação ou combinações de idade gestacional e peso do produto conceptual igual ou superior a 500g. Em razão da diversidade dos conceitos adotados, a incidência de óbito fetal relatada na literatura é variável e podem ser inferior aos valores reais por causa de subnotificação (69,70). A doença vásculo-placentária tem sido reconhecida como uma importante causa de óbito fetal inexplicada. As anormalidades vásculo-placentárias fetais são amplamente envolvidos na morte fetal tanto precoce quanto tardia, ao invés do que ocorre nas lesões vasculares maternas (71). A injúria no desenvolvimento vásculo-placentário mais precoce e prolongado está relacionado a morte fetal que ocorre antes de 34 semanas de gestação. Por outro lado, a morte fetal tardia é um evento imprevisível que é caracterizada principalmente por lesões não trombóticos do cordão umbilical e menos relacionada com o comprometimento vásculo-placentário (72). Aqui também, a associação entre SAF e perdas fetais reforça o papel potencial de alterações vásculo-placentárias na etiologia destas perdas Descolamento prematuro da placenta O DPP refere-se à separação parcial ou completa da placenta antes do parto. A maioria ocorrer por um processo vascular patológico crônico, mas alguns são devido a eventos agudos, tais como trauma ou vasoconstrição. A incidência do DPP complica 0,2 a 1 % das gestações (73). A causa imediata da separação da placenta é a ruptura dos vasos sanguíneos maternos na decídua basal, depois ocorre a liberação do fator tecidual e geração de trombina sendo uma das causas clinicas e de sequelas do descolamento aguda. O diagnóstico é normalmente reservado para gestações >20 semanas. Os principais

32 32 achados clínicos são sangramento vaginal e dor abdominal, muitas vezes acompanhada por contrações uterinas hipertónicas, sensibilidade uterina, e um padrão irregular da frequência cardíaca fetal. DPP é uma importante causa de morbidade materna e perinatal e mortalidade perinatal (73). A taxa de mortalidade perinatal é de aproximadamente 12% (74). O aumento da morbimortalidade do DPP está associado à hipoxemia, asfixia, baixo peso ao nascer, e/ou parto prematuro, além da RCIU nos casos de descolamento crônico (74,75). Em relação à associação de DPP com hemostasia, são bem descritas as consequências da DPP sobre este processo. No DPP ocorre liberação de grande quantidade de FT (tromboplastina) gerando uma enorme quantidade de trombina que entra na circulação materna num curto período de tempo. Isso sobrecarrega os mecanismos de controle hemostático, sem dar tempo suficiente para a recuperação de mecanismos compensatórios (75). A consequência clínica é uma profunda diátese hemorrágica sistêmica e, devido à deposição de fibrina intravascular disseminada, lesão tecidual isquêmica e anemia hemolítica microangiopática, ocorre a chamada coagulação intravascular disseminada (CIVD), com a presença de produtos de degradação da fibrina (PDF) elevados e D-di (76). No entanto, o papel de alterações da hemostasia como causa do DPP é menos claro. Os resultados de estudos de meta-análise sobre a associação entre principais trombofilias hereditárias e complicações obstétricas estão relacionados na tabela 1.

33 33 Tabela1. Associação entre trombofilias e complicações na gestação. Trombofilias Freqüência Abortos Recorrentes Fator V Leiden (Homozigoto) ( ) Fator V Leiden (Heterozigoto ( ) Mutação do gene da Protrombina (Heterozigoto) ( ) MTHFR C677T (Homozigoto) ( ) Deficiência de AT ( ) Deficiência de Proteína C ( ) Deficiência de Proteína S ) Anticoagulante Lúpico NA Anticorpo Anticardiolipina 2* 3.4 ( ) Perdas fetais Pré-eclampsia DPP RCIU 1.98 ( ) 2.06 ( ) 2.66 ( ) 1.31 ( ) 7.63 ( ) 3.05 ( ) ( ) 2.4 ( ) 3.3 ( ) 1.87 ( ) 2.19 ( ) 2.54 ( ) 1.37 ( ) 3.89 ( ) 5.15 ( ( ) 1.5 ( ) 2.7 ( ) 8.43 ( ) 4.70 ( ) 7.71 ( ) 1.47 ( ) 1.08 ( ) 5.93 ( ) 2.11 ( ) NA 1.42 ( ) 4.64 ( ) 2.68 ( ) 2.92 ( ) 1.24 (0, ) NA NA NA NA 6.9 ( ) DPP - descolamento prematuro de placenta; RCIU - retardo de crescimento intrauterino. *incidência de anticorpos antifosfolípides (anticoagulante lúpico, anticorpo anticardiolipina) Robertson et al(114); NA- não avaliado. Adaptado de Simcox LE, Ormesher L, Tower C, Greer IA. Thrombophilia and pregnancy complications. Int J Mol Sci, 2015 Jan 30 (125).

34 Marcadores trombofílicos e alterações vásculo-placentárias Um grande número de estudos, com grande heterogeneidade de desenhos experimentais (retrospectivos, prospectivos, caso-controle, etc.) já exploraram a associação entre marcadores trombofílicos e complicações vásculo-placentárias. A grande heterogeneidade dos desenhos experimentais, e das populações estudadas, no que diz respeito à prevalência e à definição destas complicações vásculoplacentárias, dificulta a análise global destes resultados. Neste contexto, algumas meta-análises foram realizadas sobre o tema Fator V Leiden (FVL) e Mutação da Protrombina Esta mutação foi descrita pela primeira vez em O FVL resulta da substituição de arginina (Arg) por glutamina (Gln) na posição 506 na proteína fator V. Em condições normais, o fator V é neutralizado pela proteína C ativada que, funcionando como enzima proteolítica, digere a molécula do fator V ativado em três sítios (77). O fator V mutante é resistente à neutralização mediada pela PCa, o que resulta em um estado de hipercoagulabilidade e suscetibilidade aumentada para a ocorrência de TEV. O FVL aumenta o risco para TEV em aproximadamente 3-8 vezes em heterozigose e em vezes em homozigose. Com o fator Va funciona em conjunto com o fator Xa para converter diretamente a protrombina em trombina haverá mais a formação de trombina, e, assim, um estado de hipercoagulabilidade. Embora a forma heterozigótica seja a mais comum, das trombofilia hereditária a sua prevalência ainda é baixa na população e menos de 0,3% desses heterozigotos terão TEV na gravidez (78). Descrito em 1996, a mutação do gene da protrombina é uma transição G >A no nucleotídeo na região não traduzida a 3 do gene do fator II da coagulação. O Fator II G20210A está associado à hiperprotrombinemia, formação aumentada de trombina, e risco aumentado para ocorrência de TEV. Esta mutação é encontrada em 1-3% de indivíduos da população geral, e em 6-18% dos pacientes com TEV. Desta forma, FII G20210A pode ser considerada a segunda anormalidade genética mais frequentemente associada às trombofilias e sua descrição veio reforçar o conceito de que fatores genéticos determinam o risco de TEV (77).

35 35 O diagnóstico desta anormalidade em geral é estabelecido por técnicas de análise gênica por PCR e reconhecimento da mutação por digestão enzimática. A Incidência de TEV com mutação da protrombina é baixo, estudos sugerem que a forma heterozigótica tem um risco absoluto < 0,5% e forma homozigótica para alcançar apenas 2% a 3% (79). Uma meta-análise de 8 estudos de caso-controle que avaliou os riscos de TEV em pacientes portadores do FVL e / ou a mutação da protrombina G20210A. O odds ratio (OR) para o risco de TEV foram: FVL heterozigotos - 4.9, mutação da protrombina G20210A heterozigotos - 3,8 e ambas as mutações (heterozigotos duplos) A heterozigosidade dupla ocorreu em 2,2% dos pacientes com TEV em geral e em 12% dos pacientes que eram heterozigóticos para o FVL, e em 23% dos pacientes heterozigóticos para a mutação de protrombina G20210A (80). Estudos retrospectivos variáveis sugerem que há uma ligação entre complicações na gravidez mediada pela placenta, incluindo a pré-eclâmpsia perda da gravidez, DPP e RCIU e o FVL / mutação da protrombina. Uma meta-análise de dez estudos de coorte prospectivos que examinaram a associação entre FVL / mutação do gene da protrombina e complicações na gravidez mediada pela placenta, as probabilidades de perda da gravidez em mulheres com FVL (risco absoluto de 4,2%) foi 52% maior (OR1,52, 95% intervalo de confiança [IC] 1,06-2,19) em comparação com as mulheres sem FVL (risco absoluto de 3,2%). Não houve associação significativa entre FVL e pré-eclampsia (OR 1,23, 95% IC 0,89-1,70) ou entre FVL e RCIU (OR 1,0, IC 95% 0,80-1,25). A mutação da protrombina não foi associado com pré-eclampsia (OR 1,25, 95% IC 0,79-1,99) ou RCIU (OR 1,25, IC 95% 0,92-1,70). Assim, concluiu-se que não houve associação significativa entre o FVL ou mutação da protrombina e o desfecho composto de qualquer complicação da gravidez mediada pela placenta. A pesquisa concluiu que embora não pareça haver nenhum aumento do risco, é necessária maior investigação para confirmar esta descoberta e para confirmar a falta de uma associação entre trombofilia e DPP. Os pesquisadores também alertam que todos estes resultados tranquilizadores devem ser tratados com cautela devido à variabilidade entre os estudos (81). É importante salientar, no entanto, estes resultados sugerem que a introdução de terapias anticoagulantes para mulheres com trombofilia e uma história de

36 36 complicações na gravidez, com base em estudos caso-controle retrospectivo pode ter sido prematura. A terapêutica anticoagulante deve ser considerada experimental, portanto, até que estudos controlados da abordagem fossem concluídos (81) Polimorfismos no gene MTHFR e homocisteína O gene da MTHFR humana codifica a enzima metilenotetrahidrofolato redutase que tem importante função no metabolismo do folato e homocisteína. A MTHFR catalisa a redução biologicamente irreversível de 5,10-metilenotetrahidrofolato para 5- metilenotetrahidrofolato, que fornece o grupo metilo para o remetilação de homocisteína a metionina (82). Os dois mais importantes polimorfismos da enzima MTHFR, são o C677T e A1298C, que podem afetar o folato e estado da homocisteína total. A MTHFR C677T está associada com uma redução das concentrações de folato no soro, plasma e hemácias, e o aumento da concentração de homocisteína no plasma (83). Com base nas suas funções biológicas, MTHFR C677T pode ser considerado uma causa de perdas gestacionais recorrentes e concentrações elevadas de homocisteína foram relacionadas com um risco aumentado de TEV (84,85). Um estudo avaliou duas meta-análises: uma de 24 estudos retrospectivos (n = 3289 casos) e três estudos prospectivos (n = 476 casos) foi realizada para examinar a associação da homocisteína com TEV e a outra meta-análise de 53 estudos (n = 8364 casos) do genótipo MTHFR 677TT foi realizado para avaliar se essa associação é causal. O aumento da homocisteína foi associado com 27% (IC 95%: 1-59) maior o risco de trombose venosa em estudos prospectivos e de 60% (IC 95%: ) maior o risco em estudos retrospectivos, sendo o genótipo 677TT foi associado com um maior risco de TEV, 20% (IC 95%: 8-32). Em contraste com estudos de não americanos, o genótipo 677TT não teve efeito sobre trombose venosa na América do Norte, devido, provavelmente, à maior ingestão de folato e riboflavina na América do Norte. Esta meta-análise concluiu que estudos prospectivos e retrospectivos demonstram uma modesta associação da homocisteína com trombose venosa. O risco elevado associado com o genótipo MTHFR 677TT parece ser casual (86). Outro estudo de meta-análise que teve como objetivo verificar a força da associação entre trombofilia e perda fetal, avaliou 31 estudos, sendo excluídas as

37 37 mulheres com outras patologias que poderiam explicar a perdas fetais recorrente tanto precoces como tardias. Nesse estudo à mutação MTHFR C677T não foi significativamente associada com a perda fetal (87). Para investigar a associação entre a mutação MTHFR C677T e o risco de perda de gravidez recorrentes inexplicada, um estudo de meta-análise de caso-controle comparando a população chinesa e de países da Europa. A análise estratificada, mostrou fortes associações significativas entre o polimorfismo MTHFR C677T e perdas fetais recorrentes. A conclusão foi que a mutação MTHFR C677T não era um fator de fator de risco genético para perdas fetais recorrentes, exceto em uma população chinesa (88) Hiperhomocisteinemia A hiperhomocisteinemia é o estado de hipercoagulabilidade que ocorre devido a uma combinação de fatores adquiridas e hereditários. A homocisteína é um intermediário de aminoácidos contendo enxofre, que funciona como um grupo dador de metilo durante o metabolismo de metionina, um aminoácido essencial derivado da dieta. A interconversão de metionina, homocisteína é depende da disponibilidade de 5-metiltetrahidrofolato, um grupo doador de metilo, vitamina B12 e de folato, cofatores para a interconversão, e os níveis de metionina sintetase. O aumento da enzima de homocisteína pode ser o resultado do aumento da produção ou diminuição do metabolismo (83). Níveis elevados de homocisteína plasmática durante a gestação são frequentemente associados ao aumento da incidência de abortos espontâneos, RCIU, infartos placentários, defeitos do tubo neural e pré-eclâmpsia (89). Considerando que a vitamina B6 (piridoxina), a vitamina B12 (cobalamina) e o ácido fólico participam do processo metabólico da homocisteína, as deficiências na ingestão destas vitaminas levam ao aumento dos níveis séricos de homocisteína. Os níveis de homocisteína são geralmente mais baixos durante a gravidez, quer devido a uma resposta fisiológica da gravidez com aumento de estrogênio e hemodiluição ou o aumento do consumo da metionina tanto pela mãe quanto pelo feto (86). A homozigose para MTHFR mutação do gene C677T, é o mais comum defeito hereditário associado com hiperhomocisteinemia. Essa alteração não tem sido

38 38 demonstrada como causa do aumento do risco de TEV em mulheres grávidas (4). A ausência de uma associação desse genótipo com TEV gestacional pode estar relacionada com a redução fisiológica na gravidez dos níveis de homocisteína e/ou o efeitos da suplementação de ácido fólico, amplamente utilizado para evitar defeitos do tubo neural (4). A administração de ácido fólico, junto com a vitamina B12 e vitamina B6, reduziram os níveis de homocisteína em ensaios clínicos randomizados, entretanto, demonstram que tais terapias não reduzem o risco de eventos cardiovasculares recorrentes em pacientes com doença coronária ou acidente vascular cerebral nem diminuir o risco de tromboembolismo venoso recorrente. Com base em resultados negativos de diversos estudos e a diminuição da incidência de hiperhomocisteinemia, a triagem da hiperhomocistemina tem sido desestimulado (90) Síndrome do anticorpo antifosfolípide (SAF) A trombofilia adquirida é representada pela SAF, que em mulheres, refere-se a uma síndrome caracterizada por trombose arterial ou venosa ou complicações específica da gravidez e evidência laboratorial da presença aumentada de anticorpos antifosfolípides, que são o anticoagulantes lúpico (AL) e anticorpos anticardiolipina (acl) IgG e IgM (91), embora a presença de anticorpos anti-beta-2-glicoproteína-1 (anti-β2gpi) podem ser um fator de risco para abortos espontâneos e / ou TEV (92). Os anticorpos antifosfolípides reconhecem e ligam-se a complexos de proteínas plasmáticas, associadas a fosfolípides de membrana, em testes laboratoriais in vitro, as duas principais proteínas plasmáticas que funcionam como alvos antigênicos nos complexos reconhecidos pelos anticorpos antifosfolípides são a β2-glicoproteína I e a protrombina (93). Em 2006, foram estabelecidos os critérios de Sydney para a definição de morbidade na gravidez para o diagnóstico de SAF que são: i) 1 mortes fetais inexplicáveis 10 semanas de gestação; ii) 1 partos prematuros de um recém morfologicamente normais antes de 34 semanas de gestação, devido à pré-eclâmpsia grave, eclâmpsia ou recursos consistentes com insuficiência placentária e iii) 3 perdas de gravidez espontânea, inexplicáveis e consecutivos, <10 semanas de gestação (91).

39 39 Uma meta-análise com 28 estudos de associação de anticorpos antifosfolípides e complicações mediadas pela placenta, o anticoagulante lúpico foi associado com pré-eclampsia (OR 2,34; IC 95% 1,18-4,64), RCIU (OR 4,65 IC 95% ) e perda fetal tardia (OR 4,73; IC 95% 1,08-20,81) entre os estudos caso-controle e somente com a perda fetal tardia (OR 10,59 IC 95% 1,87-59,88) entre os estudos de coorte. Os anticorpos anticardiolipina foram associados com pré-eclampsia (OR 1,52; IC 95% 1,05-2,20) e perda fetal tardia (OR 4,29; IC 95% 1,34-13,68) entre os estudos caso-controle e só a perda fetal tardia (OR 8,85 IC 95% 1,84-42,50) entre os estudos de coorte. Finalmente, os anticorpos anti-β2gpi mostraram associações com préeclampsia (OR 19,14, IC 95% 6,34-57,77), RCIU (OR 20,03; IC 95% 4,59-87,43) e perda fetal tardia (OR 23,46, IC 95% ,01) em dois estudos de coorte. As conclusões foram que os anticorpos antifosfolípides parecem estar associados com as perdas fetais tardias, no entanto, a associação entre anticorpos antifosfolípides e outras complicações mediadas pela placenta é inconsistente. O anticoagulante lúpico está mais consistentemente associada a complicações mediadas pela placenta e atualmente, existem dados suficientes para sustentar uma ligação significativa entre anticorpos anti-β2gpi e morbidade na gravidez (94). Outra revisão sistemática e meta-análise de estudos observacionais com objetivo de identificar evidências da associação de anticorpos anticardiolipina com pré-eclâmpsia, em mulheres sem doenças autoimunes, analisou 12 estudos. Foram observadas a associação de anticorpos anticardiolipina com a pré-eclâmpsia o OR de 2,86 (IC 95% 1,37-5,98) e na associação de anticorpos anticardiolipina e préeclâmpsia grave, o OR foi de 11,15 (IC 95% 2,66-46,75). Concluiu-se que de moderado a altos níveis de anticorpos anticardiolipina estão associados com préeclâmpsia, mas não há provas suficientes para usar anticorpos anticardiolipina como preditores de pré-eclâmpsia na prática clínica (95) Dímero D (D-di) O D-di é um marcador antigénico único de degradação de fibrina, que é formado pelo ato sequencial de três enzimas: trombina, fator XIIa e plasmina. Enquanto outros sistemas de ensaio detectam estruturas relacionadas com a ativação da coagulação aguda, ensaios de D-di detectam fragmentos proteolíticos de trombos lançados depois que o evento trombótico terminou (96).

40 40 Uma meta análise sobre a associação entre pré-eclampsia e à deposição de fibrina na microvasculatura e disfunção de órgãos maternos, avaliou o D-di como um marcador de produção / degradação de fibrina in vivo. O D-di surgiu como uma ferramenta de diagnóstico útil para condições trombóticas devido a sua concentração plasmática ter um alto valor preditivo negativo para TEV aguda. O objetivo deste estudo foi avaliar as publicações de análise transversal dos níveis de D-Di em mulheres com pré-eclâmpsia e (grupo controle) grávida normotensos. De acordo com esta abordagem, o aumento da D-Di foi observado em pré-eclâmpsia vs controles normais. A média global foi de 135,3 ng/ml (28,4-242,1 ng/ml). Não houve evidência de heterogeneidade entre os estudos. A conclusão, foi que a análise dos dados indicou um possível papel diagnóstico / prognóstico para os níveis de D-di em préeclâmpsia, especialmente no terceiro trimestre de gestação (97). 1.7 Obesidade e perdas recorrentes na gravidez Não existe um consenso quanto à definição de obesidade na gestação. Enquanto muitos autores utilizam como parâmetro o índice de massa corpórea - IMC (kg/m 2 ) pré-gravídico ou no primeiro trimestre >30, outros utilizam o peso corporal da gestante superior a 150% do peso ideal. Independente da definição, muitos estudos têm apontado que mulheres que iniciam a gravidez com IMC acima do normal (20 a 24,9) têm riscos mais elevados para diversas complicações (98). Estratificação do IMC segundo a OMS: i) menor que 18,5 baixo peso; ii) entre 18,5 e 24,9 normal; entre 25 e 29,9 sobrepeso; entre 30 e 34,9 obesidade classe I e entre 35 e 39,9 obesidade classe II e maior que 40 obesidade classe III (99). Um estudo de meta-análise para investigar a associação entre obesidade e aborto. Foram avaliados estudos com pacientes obesos e com sobrepeso que tiveram aborto espontâneo após a concepção espontânea ou assistida, em comparação com pacientes com IMC normal. Foram incluídos 16 estudos e obteve-se os seguintes resultados: as pacientes com IMC 25 kg/m² tiveram chances significativamente maiores de aborto espontâneo, independentemente do método de concepção (OR 1,67; 1,25-2,25). As análises de subgrupos sugerem que este grupo de mulheres também podem ter chances significativamente maiores de aborto após a doação de ovócitos (OR 1,52; 1,10-2,09) e indução da ovulação (OR 5,11; 1,76-14,83). Não havia

41 41 nenhuma evidência de aumento chances de aborto após a injeção de esperma intracitoplasmático. Concluiu-se que há evidências de que a obesidade pode aumentar o risco de aborto espontâneo geral. No entanto, não há provas suficientes para descrever o efeito da obesidade sobre aborto em grupos específicos, tais como aqueles de concepção após assistida (100).

42 42 2. JUSTIFICATIVA Complicações obstétricas relacionadas a alterações da microcirculação placentária tais como a pré-eclampsia, abortos de repetição, perdas fetais e DPP e RCIU são bastante prevalentes e causam significativa morbidade na gestação. Embora não completamente definida, a fisiopatologia destas condições envolve o endotélio, a inflamação e a coagulação. Durante a gestação, o equilíbrio fino entre fatores pró e anticoagulantes é desafiado pela necessidade de manter a viabilidade fetal sem complicações para a gestação. Neste contexto, diversas alterações de elementos isolados da hemostasia já foram descritas, e testadas no que diz respeito a sua associação com complicações obstétricas. No entanto, a caracterização precisa se algumas destas alterações da hemostasia são fisiológicas ou patológicas ainda não foi alcançada. Desse modo, o estudo de parâmetros da coagulação, classicamente associados a aumento do risco trombótico em uma população de pacientes com estas complicações, durante a gestação, oferece uma oportunidade interessante para abordagem desta questão. No Estado do Amazonas, dados sobre o acompanhamento do ambulatório de pré-natal de alto risco em três maternidades da cidade de Manaus, coordenados pela Secretaria de Estado da Saúde SUSAM, Maternidades Balbina Mestrinho, Ana Braga, e Nazira Dauo, revelam que em 2012 foram atendidas cerca de gestantes. No entanto, há pouca interação entre diferentes especialidades medidas neste seguimento. Assim, o acompanhamento hematológico, mesmo quando indicado, é muitas vezes negligenciado. A avaliação sistemática de gestantes portadoras de complicações vásculo-placentárias pode facilitar a organização da assistência integral a estas gestantes no Sistema Único Saúde.

43 43 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Avaliar as alterações de parâmetros da hemostasia classicamente associados a aumento do risco trombótico em uma população de gestantes atendidas no ambulatório de alto risco da Maternidade Balbina Mestrinho em Manaus AM, com antecedentes de alterações vásculo-placentárias 3.2 Objetivos específicos 1) Avaliar o perfil demográfico e clínico destas gestantes 2) Caracterizar as alterações de parâmetros da hemostasia associados direta ou indiretamente ao risco de eventos tromboembólicos na população do estudo, a saber: Níveis de anticoagulantes naturais: proteína C, proteína S, antitrombina Alterações moleculares: mutação do fator V Leiden, mutação do gene da protrombina, mutação no gene metilenotetrahidrofolato redutase Alterações imunológicas: anticardiolipina, anticoagulante lúpico, anticorpo antiβ2glicoproteina. Outros marcadores: homocisteína, dímero D, vitamina B12 e ácido fólico 3) Comparar as alterações observadas entre gestantes do grupo de estudo e gestantes de risco habitual

44 44 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Desenho do estudo Trata-se de um estudo não experimental tipo caso-controle, com pareamento 1:1, baseado na idade cronológica e idade gestacional. Foram utilizadas amostras e dados clínicos obtidos de estudo epidemiológico, prospectivo descritivo desenvolvido na Maternidade Balbina Mestrinho, e na Unidade Básica de Saúde Vicente Palloti, na cidade de Manaus (AM), Brasil. 4.2 População de estudo, estratégia de recrutamento e amostragem A população do estudo corresponde a gestantes de alto risco caracterizadas pelo antecedente de complicações vásculo-placentárias, a saber: pré-eclâmpsia, aborto de repetição, perdas fetais recorrentes, DPP e RCIU. O recrutamento foi feito a partir do rastreamento de casos e controles elegíveis nos prontuários médicos das instituições envolvidas. Pacientes e controles foram contatadas pelo telefone e convidadas a participar. O recrutamento foi completado em entrevista com o pesquisador, na qual as voluntárias foram esclarecidas sobre o estudo. Os procedimentos do estudo só foram iniciados após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). O recrutamento ocorreu durante julho/2014 a setembro/2015. Grupo experimentais: os sujeitos do estudo foram divididos em dois grupos: um grupo de casos, denominado alto risco (AR) nesta dissertação, e outro de controles, composto por gestantes de risco habitual (CTL). O grupo controle foi recrutado na Unidade Básica de Saúde (UBS) Vicente Palloti, em Manaus, AM, na mesma microrregião geográfica onde se localiza a maternidade Balbina Mestrinho. Critérios de inclusão (casos): presença de abortamentos de repetição, histórico prévio de perdas fetais, histórico de pré-eclâmpsia grave e/ou eclampsia em gestação anterior, histórico de restrição de crescimento fetal grave em gestação anterior e histórico de descolamento prematuro de placenta em gestação anterior; Critérios de exclusão (casos): gestantes já selecionadas que tenham amostras

45 45 inadequadas e com insucesso de reconvocação. Critérios de inclusão (controles): gestantes de risco habitual. Critérios de exclusão (controles): gestantes com qualquer outra patologia prévia e gestantes já selecionadas que tenham amostras inadequadas e com insucesso de reconvocação. Cálculo do tamanho amostral: a fim de demonstrar uma diferença equivalente 0,66 desvios-padrão, com um nível de significância de 0,05 e um poder de 0,8, estimamos uma população de 36 sujeitos por grupo. O cálculo foi feito na plataforma online da Universidade da Columbia Britânica, Canadá ( 4.3 Dados demográficos e clínicos Os dados demográficos e clínicos foram obtidos dos prontuários médicos dos sujeitos da pesquisa, de forma codificada, a fim de garantir a privacidade dos mesmos. Os dados foram registrados em uma planilha Excel. Definições das complicações vásculo-placentárias Abortamentos de repetição: dois ou mais abortamentos espontâneos consecutivos, principalmente, quanto já havia sido identificada batimentos cardíacos fetais antes de qualquer abortamento. Categorias: presente ou ausente; Perdas fetais: toda perda superior a 20 semanas de gestação ou fetos com peso superior a 500g. Categorias: presente ou ausente. Pré-eclâmpsia: é definida como uma doença multisistêmica caracterizada por início de hipertensão, proteinúria e/ou disfunção órgãos-alvo, na última metade da gravidez. No entanto, em nosso estudo, a identificação foi baseada no registro do prontuário. A informação foi confirmada com as pacientes durante a entrevista. DPP: é definida a hemorragia na interface decidual-placentária que provoca o desprendimento parcial ou total da placenta antes do parto (>20 semanas de gestação). No entanto, em nosso estudo, a identificação foi baseada no registro do prontuário. As informações foram confirmadas com as pacientes durante a entrevista.

46 46 RCIU: é definida clinicamente quando o peso fetal está abaixo do percentil 10 para a idade gestacional. 4.4 Coleta e processamento de amostras Foram coletados de cada participante um total de 25 ml de sangue venoso, distribuídos em 9 ml em tubo estéril (Vacutainer) contendo citrato de sódio a 3,2% para dosagens de testes de hemostasia, 8 ml em tubos sem anticoagulante para testes bioquímicos e imunológicos e 8 ml de sangue em tubo estéril (Vacutainer) contendo ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA) para a realização dos testes moleculares. As amostras foram processadas no setor de fracionamento do Laboratório de Análises Clínicas da Fundação Hemoam (FHEMOAM). Para obtenção de soro, as amostras coletadas em tubos sem anticoagulantes foram centrifugadas a rotações por minuto (RPM) durante 5 minutos e para obtenção do plasma, as amostras coletadas em tubos contendo citrato de sódio 3,2%, foram centrifugadas a RPM durante 15 minutos, conforme manual de procedimento operacionais padrão (MPOP) pertencentes ao setor. Após o fracionamento, as amostras de plasma foram congeladas a -70º C para posterior dosagens dos testes de coagulação, realizados no Laboratório de Hemostasia da FHEMOAM, as de soro foram encaminhadas para o laboratório de apoio, Diagnóstico do Brasil DB (Curitiba-PR) para dosagens bioquímicas e imunológicas, e as amostra coletadas com EDTA, foram encaminhadas para o Laboratório de HLA da FHEMOAM para a extrações de DNA para posterior análises moleculares realizadas no Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Treinamento da Empresa Biometrix Diagnóstica (Curitiba-PR). A Operacionalização detalhada do manuseio dos equipamentos, assim como dos kits reagentes, pode-se consultar nos manuais de operação e bulas dos kits reagentes já existentes nos respectivos laboratórios. Para os exames realizados fora da instituição, a serem implantados, já existe um encaminhamento para a formulação dos MPOP.

47 Testes laboratoriais Os testes laboratoriais para marcadores adquiridos e hereditários para trombofilias são apresentados no quadro 1. Quadro 1. Testes laboratoriais para marcadores adquiridos e hereditários para trombofilias Exames Método Valores de referência Anticorpo anticardiolipina IgM e IgG (acl): Anticoagulante Lúpico (AL): Anticorpo anti-β2- glicoproteína I (antiβ2gpi): Fluoroenzimaimunoensaio Coagulométrico Quimiluminescência. Ácido Fólico: Quimioluminescência 3,50 17,0 ng/ml. Vitamina B12: Quimioluminescência pg/ml. Proteína C (PC): Proteína S (PS): Substrato cromógeno sintético Substrato cromógeno sintético Valores reagentes para IgM e IgG superiores à 10UMPL/mL e 10UGPL/mL são considerados positivos. Para nosso estudo, a positividade foi considerada apenas quando títulos superiores a 40U/mL, em conformidade com os critérios de diagnóstico da SAF. Kit comercial HemoIL R Instrumentation Laboratory, em coagulômetro automatizado (ACL TOP 300CTS), seguindo as recomendações do fabricante, conduzida em três etapas. Primeiramente foi realizado o teste de triagem com as técnicas de TTPa (tempo de tromboplastina parcial ativado) ou drwt (tempo de veneno de víbora de Russel diluído). Obtendo-se valores superiores a relação 1,26 e/ou 1,20 para os testes de TTPA ou drwt respectivamente; realizou-se a segunda etapa onde procedeu-se teste de TTPa utilizando o teste da Mistura de 50% de plasma do paciente e 50% de plasma normal. Não havendo correção, procedeu-se a terceira etapa, que consistiu na realização do teste drwt confirmatório, cujo resultado positivo para anticoagulante lúpico é inferior a relação de 1,20. Anti-β2Glicoproteína I IgG e IgM: Não reagente: < 7,00 U/mL Inconclusivo: 7,00 a 10,00 U/mL Reagente: > 10,00 U/mL Kit comercial HemoIL R Instrumentation Laboratory, em coagulômetro automatizado (ACL TOP 300CTS), seguindo as recomendações do fabricante. Valor de referência: %. Kit comercial HemoIL R Instrumentation Laboratory, em coagulômetro automatizado (ACL TOP 300CTS), seguindo as recomendações do fabricante. Valor de referência: 63,5%-149% (obs. não há valores de referência para gestação). Substrato cromógeno Kit comercial HemoIL R Instrumentation Laboratory, Antitrombina (AT): sintético em coagulômetro automatizado (ACL TOP 300CTS). Valor de referência: 79,4-112,0%. Homocisteína plasmática: Quimioluminescência. Consideradas elevadas superiores a 13,56 µmol/l. Fator V Leiden (R506Q) Mutação no gene da protrombina (G20210A) Mutação no gene MTHFR (C677T) Mutação no gene MTHFR (A1298C). PCR-RT (Reação de cadeira de polimerase real time) Homozigoto selvagem; sem mutação Heterozigoto: possui mutação em um dos cromossomos Homozigoto mutante: possui mutação nos dos cromossomos.

48 48 Para a extração do DNA utilizou-se o kit comercial PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen by Life technologies) seguindo as recomendações do fabricante. Para a discriminação alélica, utilizamos a técnica PCR em tempo real que foi realizada utilizando aparelho ABI Prisma 7300 e kit comercial Elitech PCR AmpliMaster, AmpliMix e AmpliProbe, ambos da NANOGEN-BIOMETRIX. Para cada reação é adicionado 20 μl de tampão universal AmpliMaster no qual contem solução de AmpliMIX contendo iniciadores 5'-3' e solução de AmpliPROBE que contém sondas alelo-específico com fluoróforos (VIC-MGB e FAM-MGB) e 5 μl de amostra de DNA. A placa possui poços para controle negativo e positivo adicionando 5,0 μl de água deionizada e 5 μl de controle positivo respectivamente. A amplificação foi feita utilizando a seguinte ciclagem: 50ºC/2 min, 95ºC/10 min e 50 ciclos de 95ºC/15s e 60ºC/1 min. A mistura contendo iniciadores e sondas fazem parte do kit comercial Elitech da marca Nanongen-Biometrix e padronizada para uso em qualquer equipamento de PCR em Tempo Real da empresa Applied Biosystems. 4.6 Análises Estatísticas Os dados foram expressos em frequências absolutas e distribuição percentual, utilizando médias e medianas como medidas de tendência central, e mínimo, máximo e desvio-padrão como medidas variância, conforme detalhado em cada análise. Para comparação entre variáveis categóricas, utilizamos o teste de Exato Fisher ou Quiquadrado, para estimativa da razão de risco (odds ratio). Para comparação de variáveis quantitativas, utilizamos o teste t de Student. Valores de p< 0,05 foram considerados significativos. As análises foram realizadas no software Graphpad Prism 6.0 (La Jolla, CA, EUA).

49 Aspectos Éticos O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos - CEP/FHEMOAM, registro número CAAE: , também sendo avaliado em comitês de ética e pesquisa da Secretaria Municipal de Saúde de Manaus SEMSA. 4.8 Financiamento Este estudo foi realizado como parte de um projeto aprovado em edital PPSUS- FAPEAM chamada Nº 002/2013 conforme Decisão Nº 288/2013.

50 Delineamento do Estudo Figura 4- Delineamento do estudo

51 51 5. RESULTADOS Fluxo do estudo Durante o período do estudo, foram avaliados 1735 prontuários do ambulatório de alto risco da Maternidade Pública Balbina Mestrinho. Do total, foram 168 prontuários de gestantes que preencheras os critérios de inclusão (presença de alterações vásculo-placentárias). Destas 168 gestantes, 43 compareceram e aceitaram participar da pesquisa (Figura 5). Para seleção do grupo controle, foram avaliados 144 prontuários de gestantes acompanhadas no pré-natal de risco habitual da Unidade Básica de Saúde Vicente Pallotti. Para obtenção de pareamento por idade cronológica e idade gestacional foram selecionadas 85 gestantes. No entanto, apenas 40 compareceram e aceitaram participar do estudo. Figura 5- Fluxo da seleção dos grupos

52 52 Caracterização da população do estudo Das 43 gestantes pertencentes ao grupo AR a média de idade foi de 31,8±5,4 anos e para as 40 gestantes do grupo CTL, a média de idade foi 25±5,3 anos. Houve diferença significativa (p<0,0001) entre a média das idades das gestantes dos grupos estudados. Considerando a média da idade gestacional, às gestantes do grupo AR, foi de 29,9±5,0 semanas, enquanto às do grupo CTL foi de 27,4±7,7 semanas. Não evidenciamos uma diferença significativa (p=0,1340) entre a média da idade gestacional dos dois grupos. Na divisão da idade gestacional por trimestre, as gestantes aprestavam-se no 1º trimestre com 5% (2/40) no grupo CTL, sem nenhuma no grupo AR, no 2º trimestre, 27,9% (12/43) estavam no grupo AR e 42,5% (17/40) no grupo CTL, e no 3º trimestre os grupos AR e CTL apresentavam 79,1% (31/43) e 52,5% (21/40), respectivamente. As características demográficas e clínicas dos grupos de casos e controles são demonstradas na tabela 2. Tabela 2. Características demográficas e clínicas dos grupos de estudo Como observado na tabela 2, a média do número de gestações das gestantes do grupo AR foi de 3,88 ±1,87, enquanto no grupo CTL um número médio foi de 2,02±1,20 gestações, evidenciando uma diferença significativa (p<0,0001) entre as gestantes dos grupos estudados. Em relação ao número de abortos espontâneos, observamos que a média do número das gestantes do grupo AR foi de 1,30±1,44, enquanto no grupo CTL um número médio foi de 0,22±0,57 gestações, evidenciando uma diferença significativa (p<0,0001) entre as gestantes de ambos os grupos.

53 53 A distribuição por trimestre das variáveis idade gestacional, escolaridade, estado nutricional são mostradas na tabela 3. Tabela 3. Distribuição da idade gestacional, escolaridade, estado nutricional por trimestre. Em relação paridade e ao número de abortos, a distribuição entre dos dois grupos é mostrada na tabela 4. Tabela 4. Distribuição da paridade e número de abortos no grupo de estudo.

54 54 A frequência de complicações vásculo-placentárias na população do estudo é mostrada na tabela 5. Algumas gestantes apresentavam de mais de uma comorbidades. Tabela 5. Distribuição das patologias relacionadas as alterações vásculo placentárias e outras patologias encontradas no grupo alto risco ** Além das alterações vásculo-placentárias, outras co-morbidades gestacionais estavam presentes em 41 pacientes do grupo AR. Estas complicações incluíam: Asma, diabetes gestacional, hidronefrose, hipertensão arterial, idade materna, insuficiência renal, lúpus, nódulo de tireóide, obesidade, tromboembolismo pulmonar, tromboembolismo venoso Frequência de marcadores trombofílicos na população do estudo Em seguida, avaliamos a frequência de marcadores trombofílicos direta ou indiretamente associados a risco aumentado de TEV, na população do estudo. Nesta etapa, apenas aqueles marcadores cujos resultados não são influenciados pela gestação foram considerados (FV Leiden, mutação da protrombina, polimorfismos no gene MTHFR, anticoagulante lúpico, anticorpos anticardiolipina IgG e IgM e β2gpi). Os resultados são mostrados nas tabelas 6 e 7.

55 55 Tabela 6. Frequência de marcadores trombofílicos hereditários na população do estudo Homo: homozigoto, Het: heterozigoto * No caso do FV Leiden, mutação da protrombina e MTHFR A1298C, a análise estatística foi feita comparando selvagem x homo+het. ** No caso do polimorfismo MTHFR C677T também foi feita uma análise comparando selvagem+het x homo. Tabela 7. Frequência de marcadores trombofílicos adquiridos na população do estudo Níveis de marcadores diretos ou indiretos de risco trombótico na população do estudo A etapa seguinte da análise consistiu na comparação dos níveis circulantes de uma série de marcadores já associados, direta ou indiretamente, a risco trombótico em outros contextos. Os resultados são apresentados em forma de figuras (6-12), e os valores foram comparados pelo teste t de Student.

56 56 Figura 6. Comparação dos níveis circulantes de proteína S entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL). Figura 7. Comparação dos níveis circulantes de proteína C entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL).

57 57 Figura 8. Comparação dos níveis circulantes de antitrombina entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL). Figura 9. Comparação dos níveis circulantes de homocisteína entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL).

58 58 Figura 10. Comparação dos níveis circulantes de ácido fólico entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL). Figura 11. Comparação dos níveis circulantes de vitamina B12 entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL).

59 59 Figura 12. Comparação dos níveis circulantes de D-dímeros entre gestantes de alto risco (AR) e gestante de risco habitual (CTL) Análise dos marcadores trombofílicos estratificados por complicação vásculoplacentária Embora seja interessante avaliar os parâmetros estudados em cada subgrupo de pacientes, o n limitado para algumas patologias compromete a possibilidade desta análise. Assim, demonstraremos a seguir apenas os resultados no subgrupo de pacientes com pré-eclâmpsia (n=22), em comparação ao grupo controle total. Os resultados são mostrados na tabela 8.

60 60 Tabela 8. Marcadores trombofílicos no subgrupo de pacientes com pré-eclâmpsia Os níveis séricos da homocisteína, vitamina B12, ácido fólico e D-di foram avaliados na distribuição geral e por trimestres. A avaliação dos níveis de homocisteína (μmol/ml) no grupo das gestantes AR, apresentou uma média de 6,1±2,3 e o grupo CTL uma média de 6,04±3,6,5, sem diferença significativa (p=0,76) entre as gestantes de ambos os grupos. Também, não houve diferença estatística por trimestres. Os níveis séricos da vitamina B12 (pg/ml) no grupo das gestantes AR, apresentou uma média de 212,3±89,3 e o grupo CTL uma média de 200,2±67,5, sem diferença significativa (p=0,77) entre as gestantes de ambos os grupos. Também, não houve diferença estatística por trimestres. Porém, a deficiência de vitamina B12 estava presente em 23,3% (10/43) das gestantes do grupo AR e 15% (6/40) do grupo CTL. Em relação ao ácido fólico, seus níveis séricos (ng/ml), no grupo das gestantes AR a média apresentada foi de 13,7±13,2 e o grupo CTL uma média de 15,9±8,4, evidenciando uma diferença significativa (p<0,05) entre as gestantes dos grupos estudados. Na avaliação por trimestres, apenas houve diferença estatística no terceiro trimestre onde o grupo AR, apresentou uma média de 14,8±7,4 e o grupo CTL uma média de 11,6±10 (p<0,05).

61 61 A avaliação do D-di (ng/ml) no grupo das gestantes AR, apresentou uma média de 1359±784,2 e o grupo CTL uma média de 1613±943,3, sem diferença significativa (p=0,10) entre as gestantes de ambos os grupos. Porém, na avaliação do D-di por trimestres, observamos, também, diferença estatística no terceiro trimestre, o grupo AR apresentou uma média de 1894±1002 e o grupo CTL uma média de 1396±861 (p<0,05). Análise de casos individuais Embora a análise individual de casos não seja o objetivo deste estudo, optamos por incluir a descrição de alguns casos individuais de interesse clínico que apresentavam a associação de eventos trombóticos e marcadores trombofílicos. Das duas gestantes do grupo AR que apresentavam as mutações na forma heterozigótica para a protrombina, uma apresentava histórico de TVE e positividade para o marcador MTHFR C677T na forma heterozigótica. A única positividade da mutação do fator V de Leiden, foi na forma heterozigótica e encontrada no grupo CTL, a gestante apresentou idade materna acima de 35 anos de idade. Para as quatros gestantes do grupo AR que evidenciaram positividade para a mutação do MTHFR C677T na forma homozigótica mutante, uma apresentou histórico de 4 abortos de repetição e as outras, apresentaram histórico de pré-eclâmpsia. Das vinte e três gestantes que apresentaram positividade para a forma heterozigótica, seis tinham histórico de aborto de repetição, sendo uma, que apresentou também positividade para o marcador MTHFR A1298C na forma heterozigótica, tinha histórico de aborto de repetição, idade materna acima de 35 anos e malformação congênita. Das onze gestantes do grupo CTL com positividade para o marcador da mutação do MTHFR C677T na forma homozigótica mutante, uma apresentou positividade para o anticoagulante lúpico e duas apresentaram hiperhomocisteinemia. Já na forma MTHFR C677T heterozigótica, das quatorze gestantes que apresentaram positividade, uma apresentou positividade para o anticoagulante lúpico e todas com deficiência de PS. Para a análise da mutação MTHFR A1298C, das treze gestantes com positividade na forma heterozigótica no grupo AR, uma apresentou níveis muito baixos de atividade de PS (7%), com histórico de pré-eclâmpsia, DPP e TEV em membros

62 62 inferior esquerdo e duas apresentaram positividade para anticoagulante lúpico com histórico de aborto de repetição e perdas fetais. A análise da mutação MTHFR A1298C do grupo CTL, revelou treze gestantes que apresentaram positividade para a forma heterozigótica, duas apresentaram também positividade na forma heterozigótica para o marcador da mutação do MTHFR C677T, além de uma que apresentou associação com o anticorpo anticardiolipina classe IgG.

63 63 6. DISCUSSÃO As trombofilias consistem na predisposição genética ou adquirida à trombose. Na gestação, sabe-se que a presença de trombofilias pode ser identificada em 20 a 50% das gestantes que apresentaram um evento de TEV na gestação ou puerpério e tem sido cada vez mais estudada como fator causal de resultados adversos gestacionais, como trombose placentária, formas graves de doença hipertensiva específica da gestação, DPP, RCIU e óbito fetal (101,102). Além disso, as concentrações elevadas de complexos III e alterações na coagulação da trombina-anti trombina, bem como fatores anticoagulantes pode ser detectado na circulação materna antes do desenvolvimento da doença clínica em algumas destas síndromes (7). Mastrolia et al, descreveu diversos estudos que correlacionam atividades plasmáticas coagulantes e anticoagulantes com a geração de trombina em síndromes obstétricas, a saber: i) a pré-eclampsia, apresenta aumento da atividade e concentração do FT, aumento da concentração do TFPI, aumento da concentração de AT e aumento da geração de trombina; ii) o DPP, apresenta aumento da atividade e da concentração do FT, diminuição da concentração de TFPI, aumento da concentração de AT e aumento da geração de geração de trombina; iii) o RCIU apresenta aumento da atividade com diminuição da concentração do FT, sem alteração na concentração de TFPI, aumento da concentração de AT e aumento da geração de geração de trombina e iv) a morte fetal apresenta a atividade e concentração do FT normais, sem alteração atividade, porém, com aumento da concentração de TFPI, aumento da concentração de AT e aumento da geração de geração de trombina (7). Em conjunto, estas informações tornam plausível a hipótese que desequilíbrios no balanço hemostático que resultem em aumento da propensão a tromboses, possam ser um dos fatores associados à fisiopatologia de alguma destas condições obstétricas. Dentre as condições associadas a desequilíbrio do balanço hemostático destacam-se as chamadas trombofilias. Classicamente, o termo trombofilias é usado para caracterização de alterações específicas nos níveis ou na função de elementos da hemostasia (fatores da coagulação, anticoagulantes naturais e outros moduladores do balanço hemostático) que estejam associados tanto do ponto de vista biológico

64 64 quanto do ponto de vista epidemiológico com risco aumentado de TEV. Cabe aqui destacar a importância do reconhecimento que o termo trombofilias é definido a partir de sua associação específica com o tromboembolismo venoso, e não com outras condições clínicas como as complicações vásculo-placentárias. A importância deste aspecto será discutida mais adiante. De fato, a identificação das trombofilias clássicas foi feita a partir de estudos em famílias com recorrência de trombose venosa profunda e embolia pulmonar. Nestas famílias, as primeiras trombofilias descritas foram as deficiências dos anticoagulantes naturais, a saber: AT, PC e PS, ainda nos anos 1980 ( ). Após um longo período de pesquisas, em que grande parte das famílias com história de TEV recorrente não apresentava nenhum achado de trombofilia além das raras deficiências de PC, PS e AT, a descoberta de uma variante do fator V da coagulação resistente à inativação pela proteína C ativada (o FV Leiden) e de uma variante do fator II associada a níveis elevados de protrombina na circulação (a mutação G20210A no gene da protrombina) mudou este quadro. Por serem polimorfismos gênicos muito prevalentes em algumas populações, sua associação com TEV é bem mais frequente que as deficiências de anticoagulantes naturais, de modo que atualmente, cerca de 50% dos pacientes com TEV espontâneo apresentam algumas destas cinco alterações (as chamadas trombofilias hereditárias clássicas). Durante este período uma série de outros fatores hereditários foram descritos como potencialmente associados a risco aumentado de TEV, tais como alterações no fator XIII, fibrinogênio e em outros pontos da cascata da coagulação (106). No entanto, embora associações positivas entre estes fatores e o risco de TEV tenham sido descritas inicialmente, apenas as trombofilias clássicas mantêm a associação estatística em estudos com maior número de pacientes. Além destas cinco alterações hereditárias, outras alterações adquiridas também foram associadas ao risco de TEV, tais como a SAF (107), caracterizada laboratorialmente pela positividade para anticorpos anticardiolipina ou do (85) anticoagulante lúpico, e a hiperhomocisteinemia. No caso da hiperhomocisteinemia, o aumento é considerado como de causa mista, já que componentes hereditários não explicam isoladamente sua ocorrência. A deficiência

65 65 de elementos como o ácido fólico e a vitamina B12 sabidamente influenciam os níveis de homocisteína (108). Não obstante, muitos casos de aumento moderado da homocisteína estão associados a polimorfismos no gene MTHFR, motivo pelo qual a pesquisa destes polimorfismos chegou a ser incorporada por muitos grupos no painel molecular de pesquisa de trombofilias. No que diz respeito ao risco trombótico, hoje está bem estabelecido na literatura que polimorfismos neste gene não apresentam uma associação direta com o risco de TEV (109), sendo o valor da homocisteína no soro ou plasma o parâmetro mais adequado para dosagem como marcador trombofílico. De fato, as associações de risco entre TEV e alterações no gene MTHFR identificadas nos estudos iniciais não foram reproduzidas em estudos com maior número de pacientes (110). Por fim, embora a dosagem de dímeros D (D-di) tenha sua maior utilidade no diagnóstico agudo do TEV, nos últimos anos ela vem sendo usada cada vez mais na estratificação de risco de recorrência de trombose em pacientes com antecedente de TEV. Estudos recentes mostram que pacientes com níveis elevados de D-di (acima do valor de referência) apresentam maior risco de recorrência que pacientes com valores dentro da faixa da normalidade (111). Assim, embora não seja correto incluir a dosagem de D-di no grupo de trombofilias, seus valores podem ser considerados marcadores indiretos do risco trombótico, ou de desequilíbrios do balanço hemostático. Se por um lado a associação entre estes marcadores e TEV encontra-se bem documentada, o mesmo não se pode dizer sobre sua associação com as chamadas complicações vásculo-placentárias. De fato, diretrizes de diferentes instituições ligadas tanto à obstetrícia quanto à hematologia não recomendam a pesquisa sistemática de trombofilias hereditárias em pacientes com estas complicações, indicando que esta pesquisa deve ser feita de forma individualizada (112,113). Isto não significa, no entanto, que a questão esteja resolvida do ponto de vista científico. Como vimos, várias linhas de evidência tornam atrativa a hipótese que desequilíbrios no balanço hemostático aumentem o risco das complicações vásculo-placentárias, e resultados apoiando ou refutando esta hipótese abundam na literatura.

66 66 Estudos têm sugerido uma associação entre resultados adversos gravidez e trombofilias hereditárias e homozigose para a MTHFR, causando homocisteinemia. Seria a hipótese de que trombofilia pode causar insuficiência placentária devido à trombose vascular da placenta. Outros estudos não suportam esta associação e em geral, a evidência é fraca. Os argumentos contra a hipótese corrente de trombose vascular da placenta concluem que se hipercoagulabilidade foi a associação causal, então, porque a ocorrência de aborto e perdas fetais não é maior em mulheres com antecedentes de TEV do que nos controles. Evidências de meta-análise de estudos de caso-controle, onde as mulheres com complicações na gravidez foram comparados com aqueles sem complicações, concluem que há um aumento da prevalência de trombofilia naquelas mulheres com complicações, mas a magnitude da associação é modesta, sugerindo que este é um fator contributivo em vez de uma causa primária (81,114). Vários fatores metodológicos podem explicar ao menos em parte a dificuldade de obtenção de dados definitivos sobre o assunto. Por exemplo, o conceito de complicações vásculo-placentários engloba condições heterogêneas e multifatoriais como perdas fetais e abortos recorrentes, o que certamente influencia negativamente os estudos sobre o tema. Não raro, pacientes com antecedentes de fenômenos tromboembólicos são também agregadas de forma inapropriada a estes grupos de gestantes de maior risco. Outro fator crítico é a influência da gestação nos níveis circulantes de muitos destes fatores. Muitos estudos não definem precisamente o momento de coleta (antes, durante ou após a gestação), o que introduz um viés grave na análise dos resultados. É reconhecido o efeito da gestação sobre a PS, cujos níveis até valores muito abaixo do limite inferior da normalidade fora da gestação. Variações menos exuberantes podem ocorrer com outros fatores, o que exige muito cuidado na interpretação destes estudos. De fato, diretrizes sobre o manejo de gestantes com risco de eventos tromboembólicos recomendam que a pesquisa de marcadores trombofílicos seja feita fora da gestação (115,116), e a maioria dos estudos de maior impacto sobre o tema avaliaram a presença destes marcadores fora da gestação (87). Curiosamente, há

67 67 poucos dados avaliando eventuais diferenças em parâmetros da hemostasia durante a gestação em pacientes com complicações vásculo-placentárias. Diante deste contexto, nosso estudo teve como objetivo comparar os níveis e a frequência de alterações em um painel amplo de marcadores trombofílicos, entre uma população bem caracterizada de gestantes com complicações vásculoplacentárias e uma população de gestantes de risco habitual. A fim de minimizar o impacto de variações nos níveis destes parâmetros decorrentes da gestação, casos e controles foram pareados por idade gestacional. É importante destacar que nosso estudo não teve como objetivo replicar estudos anteriores que avaliaram a associação de trombofilias hereditárias com complicações obstétricas, mas sim o de comparar os níveis de parâmetros que influenciam direta ou indiretamente o risco trombótico entre dois grupos bem definidos de gestantes. O pareamento de nossa população foi eficaz no que diz respeito à idade gestacional, que é o parâmetro mais crítico para a dosagem de fatores da hemostasia. A média da idade gestacional do grupo AR e CTL, foram de 29,9±5,0 semanas e 27,4±7,7 semanas, respectivamente. Não evidenciando uma diferença significativa (p=0,1340). Infelizmente, não conseguimos obter um pareamento perfeito no que diz respeito à idade. Como demonstrado nos resultados, mais de 50% das gestantes potencialmente elegíveis para o grupo controle foram convidadas a participar, mas as que aceitaram o convite apresentavam idade significativamente inferior às do grupo de casos. Acreditamos que o impacto desta limitação seja inferior às vantagens de trabalhar com um grupo pareado por idade gestacional, na medida em que não há descrição de um efeito significativo da idade sobre os parâmetros estudados (117). Além disso, embora significativa do ponto de vista estatístico, entre os dois grupos a média de idade, 31,8±5,4 anos no grupo AR e de 25±5,3 anos no grupo CTL (p<0,0001), não nos parece muito relevante quando se avaliam aumentos potenciais de níveis de fatores da coagulação. Também observamos uma diferença no IMC entre os dois grupos, com valores mais elevados para o grupo de alto risco. Não é possível descartar um efeito desta variável sobre os níveis de fatores de coagulação, embora a literatura seja controversa neste aspecto.

68 68 Morgan et al, em estudo para determinar se a variação do IMC no terceiro trimestre da gestação estava associado a alterações pró-trombóticos, participaram 110 mulheres, sendo excluídas as mulheres com maior risco de TEV, e/ou em tromboprofilaxia, e/ou mais de 35 anos e aqueles em trabalho de parto, concluiu-se que não houve diferenças significativas nas medidas hemostáticas com a mudança de IMC, sugerindo que o aumento do risco de TEV em mulheres grávidas obesas pode ser por causa de outros mecanismos como a disfunção endotelial, inflamação e estase venosa (118). De qualquer forma, entendemos esta diferença como parte das características clínicas do grupo de casos, não vendo esta diferença como um problema no desenho do estudo. O mesmo vale para diferenças observadas na paridade e no número de abortos entre os dois grupos, que refletem possivelmente um pior prognóstico obstétrico no grupo de casos. Ao contrário do IMC, estas duas variáveis não apresentem potencial de influenciar os valores ou a frequência de alteração nos marcadores estudados. O principal resultado de nosso estudo foi a ausência de associação entre marcadores diretos ou indiretos de risco para TEV (que aqui chamamos de marcadores trombofílicos) e a ocorrência de complicações vásculo-placentárias. Especificamente, o grupo de pacientes não apresentou aumento na frequência de FVL, mutação da protrombina, polimorfismos no gene MTHFR, e de marcadores sorológicos da SAF, nem redução nos níveis de anticoagulantes naturais. Além disso, tanto os valores de homocisteína quanto a dosagem de dímeros D também se mostraram equivalentes entre casos e controles. A diferença observada nos níveis de ácido fólico e vitamina B 12 entre os dois grupos encontra-se dentro dos valores de referência (acima do limite inferior da normalidade), motivo pelo qual não acreditamos que tenha relevância como fator de risco. Em conjunto, estes dados nos levam a duas hipóteses possíveis. A primeira, de que complicações vásculo-placentárias não estão associadas a hipercoagulabilidade. Esta hipótese é corroborada por resultados de algumas metaanálises com grande número de pacientes, que não apontam associações significativas entre tromboses e estas complicações

69 69 Rodger et al, em um importante estudo de intervenção, randomizados e duplo cegos, publicados em prestigiosas revistas médicas também apoiam que alterações da coagulação não seriam elementos críticos na fisiopatologia de algumas destas complicações. O primeiro estudo foi desenhado para determinar se o uso da dalteparina (heparina de baixo peso molecular- HBPM) profilática, reduziria o risco de TEV e complicações mediada pela placenta em mulheres com trombofilia e de alto risco de complicações na gravidez. Foram elegíveis 292 grávidas e foram dividias em dois grupos (1:1). O primeiro grupo recebeu dalteparina, injeções subcutâneas (SC), pré parto (5000 UI) SC, uma vez por dia desde o dia da randomização até 20 semanas de gestação, aumentando para UI duas vezes por dia a partir de 20 semanas até 37 semanas ou mais. O outro grupo não recebeu nenhum anticoagulação. Concluiu-se que a dalteparina profilática pré parto não reduz a ocorrência de TEV ou complicações na gravidez mediada pela placenta, além de estar associada com um risco aumentado de hemorragia menor (119). No estudo de Pasquier et al, que incluiu 256 mulheres, foi um estudo duplocego randomizado controlado por placebo, sobre o efeito da HBPM em mulheres grávidas com história de abortos recorrentes inexplicados. As gestantes foram distribuídas aleatoriamente para receber enoxaparina 40 mg, uma injeção SC diária, ou de placebo, até 35 semanas de gestação. O desfecho primário foi a taxa de nascidos vivos e viáveis. Os desfechos secundários incluíram taxas de aborto, as taxas de complicações obstétricas, taxas de trombocitopenia materna, episódios de sangramento e reações cutâneas. Concluiu-se que o uso de enoxaparina (40 mg uma vez por dia) não melhorou a chance de um nascimento vivo em mulheres não trombofílicas com uma história de abortos recorrentes inexplicados e devem, consequentemente, deixarem de poder ser prescritos rotineiramente (120). Uma segunda explicação para nossos resultados seria que embora presente do ponto de vista biológico, um eventual estado de hipercoagulabilidade associado ao risco destas complicações não seria detectável pelo painel de testes utilizados. As limitações de testes isolados da hemostasia são conhecidas, motivo pelo qual muita ênfase é dada ao uso de testes globais. Em nosso caso, utilizamos o D-dímero, como um marcador global da coagulação, capaz de capturar de forma indireta a geração de trombina. A ausência de alteração no D-dímero torna pouco provável esta hipótese, embora não seja possível descartá-la formalmente.

70 70 Outro resultado que merece ser discutido é a presença de valores elevados de PC e AT no grupo de casos. Não há evidência clínica de que aumento nestes valores possam ter implicação funcional. Embora estatisticamente significativas, as variações são muito pequenas. Embora o papel da idade cronológica sobre os níveis destes fatores seja controverso, é possível que as diferenças observadas decorram do efeito da idade ou do IMC sobre os níveis destes fatores. Outro fato que nos chamou atenção foi a presença de deficiência de vitamina B12 e ácido fólico em 16 e 03 pacientes, respectivamente. Embora este dado não pareça ter associação com o risco de complicações (as diferenças nas médias entre os dois grupos de gestantes não sugerem isso), o fato tem importância médica e de saúde pública, diante das consequências destas deficiências na população. Níveis adequados de folato são fundamentais na gestação para suportar o rápido crescimento, replicação e divisão celular, assim como a síntese de nucleotídeos fetais e placentares. As gestantes têm alta carência de folato, sobretudo no segundo e terceiro trimestre, quando há o rápido crescimento fetal. O risco de defeito do tubo neural fetal aumenta 10 vezes se houver deficiência desta vitamina (121). Junto com a vitamina B12 (cobalamina), o folato é um dos substratos necessários para a eritropoiese eficaz. A sua carência da vitamina B12 é rara na gravidez e a sua deficiência associa-se a anemia megaloblástica que pode estar relacionada com diminuição da resposta imunitária e neuropatia fetal (122). Portanto, o diagnóstico carencial e a suplementação dietética destas vitaminas faz parte imprescindível do acompanhamento do pré-natal. Além das implicações de relevância para o entendimento da fisiopatologia das complicações vásculo-placentárias, nosso objetivo principal, nossos resultados têm implicações práticas relevantes. A chamada pesquisa de trombofilias vem sendo amplamente utilizada na arena obstétrica como ferramenta de estratificação de risco para complicações de diversas natureza, muitas vezes sem um embasamento científico adequado. Desta abordagem resulta o uso inadequado de heparina para gestantes, o que está associado não apenas a desconforto e gastos desnecessários, mas também a aumento da frequência de sangramentos (119,120), e do risco de outras complicações da heparina como osteoporose. Recentemente, o papel dos testes de trombofilia e do uso de heparinas na gestação vem sendo discutido e desafiado (123).

71 71 Neste contexto, nossos resultados corroboram o conceito atual de que o uso sistemático destes testes na avaliação de risco gestacional não é indicado, destacando ainda o efeito importante fisiológico da gestação sobre os níveis séricos da PS. A disseminação destes resultados na comunidade de hematologistas e obstetras trará benefícios importantes para a saúde pública.

72 72 7. CONCLUSÕES A pesquisa de trombofilias vem sendo amplamente utilizada pela obstétrica como ferramenta de estratificação de risco para complicações de diversas naturezas, muitas vezes sem um embasamento científico adequado. Como a própria anticoagulação tem um risco aumentado de hemorragia, o seu uso deve ser limitado as pacientes que se se beneficiariam claramente. A abordagem terapêutica com o uso inadequado de heparina para gestantes, o que está associado não apenas a desconforto e gastos desnecessário, mas também a aumento da frequência de sangramentos e do risco de outras complicações da heparina como a osteoporose, bem como, o papel dos testes diagnósticos de trombofilia, vem sendo amplamente questionado. Neste contexto, nossos resultados apoiam: que existem relevâncias no entendimento da fisiopatologia das complicações vásculo placentárias; o conceito atual de que o uso sistemático desde testes na avaliação de risco gestacional não é indicado, destacando ainda o efeito importante fisiológico da gestação sobre os níveis séricos da PS; em nossos resultados o perfil demográfico das gestantes de alto risco, com histórico de comprometimento vásculo-placentário, da maternidade Balbina Mestrinho tem a média de idade foi de 31,8 anos, é da raça parda, escolaridade de 2º grau completo, em relação ao estado nutricional apresentava-se obesa, a maioria estava no terceiro trimestre da gestação (média da idade gestacional de 29,9 semanas), teve média do número de gestações de 3,88 e de abortos 1,3. A pré-eclâmpsia e as perdas gestacionais recorrentes foram as patologias vásculo-placentária mais comum. houve ausência de associação entre marcadores diretos ou indiretos de risco para TEV (que aqui chamamos de marcadores trombofílicos) e a ocorrência de complicações vásculo-placentárias. hão houve aumento da frequência de FV Leiden, mutação da protrombina, polimorfismos no gene MTHFR, e de marcadores sorológicos da SAF, nem redução dos níveis de anticoagulantes naturais em nossa população de estudo;

73 73 houve equivalência entre as dosagens de homocisteína e D-dimeros entre as duas populações estudadas Assim, sendo este estudo pioneiro em nossa região, identificamos a necessidade a disseminação destes resultados na comunidade de hematologistas e obstetras que trará benefícios importantes para a saúde pública de nossa comunidade, com implantação de ambulatórios especializados, como também, laboratórios de excelência para um melhor diagnósticos e acompanhamento das gestantes de alto risco e pacientes hematológicos. Um melhor acompanhamento diagnóstico com clareza cientifica e a identificação de um tratamento adequado podem mudar drasticamente tanto o resultado da gestação quanto a sobrevida e a qualidade de vida da mulher.

74 74 8. REFERÊNCIA BIBLOGRÁFICA 1. Marik PE, Plante LA. Venous Thromboembolic Disease and Pregnancy. N Engl J Med [Internet]. Massachusetts Medical Society; 2008 Nov 6;359(19): Available from: /pdf/ /nejmra Martinelli I, Battaglioli T, De Stefano V, Tormene D, Valdrè L, Grandone E, et al. The risk of first venous thromboembolism during pregnancy and puerperium in double heterozygotes for factor V Leiden and prothrombin G20210A. J Thromb Haemost. 2008;6(3): Kujovich JL. Thrombophilia and pregnancy complications. Am J Obstet Gynecol [Internet] Aug [cited 2015 Nov 24];191(2): Available from: 4. Battinelli EM, Bauer K a. Thrombophilias in Pregnancy. Hematol Oncol Clin North Am [Internet]. 2011;25(2): Available from: 5. HYERS TM. Venous thromboembolism [Internet]. American journal of respiratory and critical care medicine. American Thoracic Society; 1999 [cited 2015 Nov 25]. p Available from: 6. James AH. Pregnancy-associated thrombosis. Hematology Am Soc Hematol Educ Program [Internet]. 2009; Available from: 7. Mastrolia SA, Mazor M, Loverro G, Klaitman V, Erez O. Placental vascular pathology and increased thrombin generation as mechanisms of disease in obstetrical syndromes. PeerJ [Internet]. 2014;2:e653. Available from: ntrez&rendertype=abstract 8. Norris LA. Blood coagulation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol [Internet] Jun [cited 2015 Nov 25];17(3): Available from: 9. Franco RF. Trombofilias hereditárias. Medicina (B Aires). 2001;34(3-4): Macfarlane RG. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. Nature. 1964;202: Davie EW, Ratnoff OD. Waterfall Sequence for Intrinsic Blood Clotting. Science. 1964;145: Hoffman M. Remodeling the blood coagulation cascade. J Thromb Thrombolysis. 2003;16(1-2): Ferreira CN, Sousa MO, Dusse LMS, Carvalho MG. O novo modelo da cascata de coagulação baseado nas superfícies celulares e suas implicaçoes. Rev Bras

75 75 Hematol Hemoter [Internet]. 2010;32(5): Retiado em de. Available from: Levi M, van der Poll T. Inflammation and coagulation. Crit Care Med. 2010;38(2):S Malý M a., Tomašov P, Hájek P, Blaško P, Hrachovinová I, Salaj P, et al. The role of tissue factor in thrombosis and hemostasis. Physiol Res. 2007;56(6): Mosnier LO, Zlokovic B V, Griffin JH. The cytoprotective protein C pathway. Blood [Internet] Apr 15;109(8): Available from: Dahlbäck B, Villoutreix BO. Regulation of blood coagulation by the protein C anticoagulant pathway: Novel insights into structure-function relationships and molecular recognition. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(7): Dahlbäck B. Blood coagulation and its regulation by anticoagulant pathways: genetic pathogenesis of bleeding and thrombotic diseases. J Intern Med [Internet]. 2005;257(3): Available from: Vine AK. Recent advances in haemostasis and thrombosis. Retina. 2009;29(1): Pabinger I. Thrombophilia and its impact on pregnancy. Thromb Res [Internet] Jan [cited 2016 Mar 14];123 Suppl :S Available from: Mueller FM, Ehrenthal W, Hafner G, Schranz D. Purpura fulminans in severe congenital protein C deficiency: Monitoring of treatment with protein C concentrate. Eur J Pediatr. 1996;155(1): Franco RF. Fisiologia da coagulação, anticoagulação e fibrinólise. Medicina (B Aires). 2001;34(3-4): Lisman T, De Groot PG, Meijers JCM, Rosendaal FR. Reduced plasma fibrinolytic potential is a risk factor for venous thrombosis. Blood. 2005;105(3): Uszyński M. Generation of thrombin in blood plasma of non-pregnant and pregnant women studied through concentration of thrombin antithrombin III complexes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol [Internet] Dec [cited 2016 Mar 14];75(2): Available from: Tchaikovski SN, Thomassen MCLGD, Costa S-D, Peeters LLH, Rosing J. Role of protein S and tissue factor pathway inhibitor in the development of activated protein C resistance early in pregnancy in women with a history of preeclampsia. Thromb Haemost [Internet]. 2011;106(5): Available from:

76 Mahmoodi BK, Brouwer J-LP, Ten Kate MK, Lijfering WM, Veeger NJGM, Mulder AB, et al. A prospective cohort study on the absolute risks of venous thromboembolism and predictive value of screening asymptomatic relatives of patients with hereditary deficiencies of protein S, protein C or antithrombin. J Thromb Haemost [Internet] Jun [cited 2015 Nov 24];8(6): Available from: Thornton P, Douglas J. Coagulation in pregnancy. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol [Internet]. Elsevier Ltd; 2010 Jun [cited 2016 Feb 11];24(3): Available from: Brenner B. Haemostatic changes in pregnancy. Thromb Res. 2004;114(5-6 SPEC. ISS.): Eichinger S, Weltermann A, Philipp K, Hafner E, Kaider A, Kittl E-M, et al. Prospective Evaluation of Hemostatic System Activation and Thrombin Potential in Healthy Pregnant Women with and without Factor V Leiden. Thromb Haemost [Internet]. Schattauer Publishers; 1999;82(10): Available from: Bremme KA. Haemostatic changes in pregnancy. Best Pract Res Clin Haematol [Internet] Jun [cited 2016 Mar 14];16(2): Available from: Chaiworapongsa T, Espinoza J, Yoshimatsu J, Kim YM, Bujold E, Edwin S, et al. Activation of coagulation system in preterm labor and preterm premature rupture of membranes. J Matern Neonatal Med [Internet]. Taylor & Francis; 2002 Jan 1;11(6): Available from: de Moerloose P, Mermillod N, Amiral J, Reber G. Thrombomodulin Levels during Normal Pregnancy, at Delivery and in the Postpartum: Comparison with Tissuetype Plasminogen Activator and Plasminogen Activator Inhibitor-1. Thromb Haemost [Internet]. Schattauer Publishers; 1998;79(3): Available from: Andersson T, Lorentzen B, Høgdahl H, Clausen T, Mowinckel M-C, Abildgaard U. Thrombin-inhibitor complexes in the blood during and after delivery. Thromb Res [Internet]. Elsevier; 1996 Apr 15 [cited 2016 Mar 14];82(2): Available from: Osterud B, Flaegstad T. Increased tissue thromboplastin activity in monocytes of patients with meningococcal infection: related to an unfavourable prognosis. Thromb Haemost Feb;49(1): Fiusa MML, Carvalho-Filho MA, Annichino-Bizzacchi JM, De Paula E V. Causes and consequences of coagulation activation in sepsis: an evolutionary medicine perspective. BMC Med Jan;13: Erlich J, Parry GCN, Fearns C, Muller M, Carmeliet P, Luther T, et al. Tissue factor is required for uterine hemostasis and maintenance of the placental labyrinth during gestation. Proc Natl Acad Sci [Internet] Jul 6 [cited 2016

77 77 Mar 14];96(14): Available from: Edstrom CS, Calhoun DA, Christensen RD. Expression of tissue factor pathway inhibitor in human fetal and placental tissues. Early Hum Dev [Internet] Aug [cited 2016 Mar 14];59(2): Available from: Uszyński M, Żekanowska E, Uszyński W, Kuczyński J. Tissue factor (TF) and tissue factor pathway inhibitor (TFPI) in amniotic fluid and blood plasma: implications for the mechanism of amniotic fluid embolism. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol [Internet] Apr [cited 2016 Mar 14];95(2): Available from: Sarig G, Blumenfeld Z, Leiba R, Lanir N, Brenner B. Modulation of systemic hemostatic parameters by enoxaparin during gestation in women with thrombophilia and pregnancy loss. Thromb Haemost [Internet]. Schattauer Publishers; 2005;94(11): Available from: Sood R, Sholl L, Isermann B, Zogg M, Coughlin SR, Weiler H. Maternal Par4 and platelets contribute to defective placenta formation in mouse embryos lacking thrombomodulin. Blood. 2008;112(3): Butenas S, Orfeo T, Brummel-Ziedins KE, Mann KG. Tissue factor in thrombosis and hemorrhage. Surgery [Internet]. Elsevier; 2007 Oct 1 [cited 2016 Jan 6];142(4):S2 14. Available from: Salafia CM, Pezzullo JC, Ghidini A, Lopèz-Zeno JA, Whittington SS. Clinical correlations of patterns of placental pathology in preterm pre-eclampsia. Placenta [Internet] Jan [cited 2016 Mar 13];19(1): Available from: Abalos E, Cuesta C, Grosso AL, Chou D, Say L. Global and regional estimates of preeclampsia and eclampsia: A systematic review. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol [Internet]. Elsevier Ireland Ltd; 2013;170(1):1 7. Available from: Laurenti R, Jorge MHPDM, Gotlieb SLD. A mortalidade materna nas capitais brasileiras: algumas características e estimativa de um fator de ajuste. Rev Bras Epidemiol [Internet]. 2004;7(4): Available from: Lisonkova S, Sabr Y, Mayer C, Young C, Skoll A, Joseph KS. Maternal Morbidity Associated With Early-Onset and Late-Onset Preeclampsia. Obstet Gynecol [Internet]. 2014;124(4): Available from: Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin Perinatol [Internet] Jun [cited 2015 Mar 11];33(3): Available from:

78 Duckitt K, Harrington D. Risk factors for pre-eclampsia at antenatal booking: systematic review of controlled studies. BMJ. 2005;330(7491): Dekker GA, Sibai BM. Etiology and pathogenesis of preeclampsia: Current concepts. Am J Obstet Gynecol [Internet] Nov [cited 2016 Mar 13];179(5): Available from: Bramham K, Briley AL, Seed PT, Poston L, Shennan AH, Chappell LC. Pregnancy outcome in women with chronic kidney disease: a prospective cohort study. Reprod Sci [Internet]. 2011;18(7): Available from: Cassell KA, O Connell CM, Baskett TF. The Origins and Outcomes of Triplet and Quadruplet Pregnancies in Nova Scotia: 1980 to Amer J Perinatol. 2004;21(08): Kovo M, Schreiber L, Ben-Haroush A, Wand S, Golan A, Bar J. Placental vascular lesion differences in pregnancy-induced hypertension and normotensive fetal growth restriction. Am J Obstet Gynecol [Internet] Jun [cited 2016 Mar 13];202(6):561.e1 5. Available from: Teng Y, Jiang R, Lin Q, Ding C, Ye Z. The relationship between plasma and placental tissue factor, and tissue factor pathway inhibitors in severe preeclampsia patients. Thromb Res [Internet] Jul [cited 2016 Jan 5];126(1):e41 5. Available from: Karakantza M, Androutsopoulos G, Mougiou A, Sakellaropoulos G, Kourounis G, Decavalas G. Inheritance and perinatal consequences of inherited thrombophilia in Greece. Int J Gynecol Obstet [Internet] Feb [cited 2016 Mar 15];100(2): Available from: Rodger et al. Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisites. Obstet Ginecol. 2008;112(2): Battaglia FC, Lubchenco LO. A practical classification of newborn infants by weight and gestational age. J Pediatr [Internet] Aug [cited 2016 Feb 13];71(2): Available from: Ogueh O, Chen M., Spurll G, Benjamin A. Outcome of pregnancy in women with hereditary thrombophilia. Int J Gynecol Obstet [Internet] Sep [cited 2016 Mar 13];74(3): Available from: Cetin I, Alvino G. Intrauterine growth restriction: implications for placental metabolism and transport. A review. Placenta [Internet] Mar [cited 2016 Mar 13];30 Suppl A:S Available from:

79 Sclowitz IKT, Santos I da S dos. Fatores de risco na recorrência do baixo peso ao nascer, restrição de crescimento intra-uterino e nascimento pré-termo em sucessivas gestações: um estudo de revisão. Cad Saude Publica [Internet]. 2006;22(6): Available from: Redline RW. Placental pathology: a systematic approach with clinical correlations. Placenta [Internet] Mar [cited 2016 Jan 5];29 Suppl A:S Available from: Salafia CM, Minior VK, Pezzullo JC, Popek EJ, Rosenkrantz TS, Vintzileos AM. Intrauterine growth restriction in infants of less than thirty-two weeks gestation: Associated placental pathologic features. Am J Obstet Gynecol [Internet] Oct [cited 2016 Mar 14];173(4): Available from: Kovo M, Schreiber L, Ben-Haroush A, Gold E, Golan A, Bar J. The placental component in early-onset and late-onset preeclampsia in relation to fetal growth restriction. Prenat Diagn [Internet] Jul [cited 2015 Dec 19];32(7): Available from: Jauniaux E, Farquharson RG, Christiansen OB, Exalto N. Evidence-based guidelines for the investigation and medical treatment of recurrent miscarriage. Hum Reprod. 2006;21(9): Paukku M, Tulppala M, Puolakkainen M, Anttila T, Paavonen J. Lack of association between serum antibodies to Chlamydia trachomatis and a history of recurrent pregnancy loss. Fertil Steril [Internet] Sep [cited 2016 Mar 14];72(3): Available from: Salat-Baroux J. [Recurrent spontaneous abortions]. Reprod Nutr Dev [Internet]. Service de Gynécologie Obstétrique, Biologie de la Reproduction, Hôpital Tenon, Paris., Biologie de la Reproduction, Hôpital Tenon, Paris.; 1988;28(6B): Available from: Hatasaka HH. Recurrent miscarriage: epidemiologic factors, definitions, and incidence [Internet]. Clinical obstetrics and gynecology [cited 2016 Mar 15]. p Available from: com/&output=citation&scisig=aagbfm0aaaaavuevnjujtacrd8zzj0ybnejz w81tcr2i&scisf=4&hl=pt-br 66. Middeldorp S. Thrombophilia and pregnancy complications: Cause or association? J Thromb Haemost. 2007;5(SUPPL. 1): Lockwood CJ, Toti P, Arcuri F, Paidas M, Buchwalder L, Krikun G, et al. Mechanisms of abruption-induced premature rupture of the fetal membranes:

80 80 thrombin-enhanced interleukin-8 expression in term decidua. Am J Pathol [Internet] Nov [cited 2016 Mar 14];167(5): Available from: Tong M, Viall CA, Chamley LW. Antiphospholipid antibodies and the placenta: a systematic review of their in vitro effects and modulation by treatment. Hum Reprod Update [Internet]. 2015;21(1): Available from: Organization WH. International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, Volume 1 [Internet] [cited 2016 Mar 15]. Available from: Joseph KS, Kinniburgh B, Hutcheon J a, Mehrabadi A, Dahlgren L, Basso M, et al. Rationalizing definitions and procedures for optimizing clinical care and public health in fetal death and stillbirth. Obstet Gynecol [Internet]. 2015;125(4): Available from: Kovo M, Schreiber L, Bar J. Placental vascular pathology as a mechanism of disease in pregnancy complications. Thromb Res [Internet]. Elsevier Ltd; 2013 Jan [cited 2016 Jan 5];131 Suppl :S Available from: Bar J, Schreiber L, Ben-Haroush A, Ahmed H, Golan A, Kovo M. The placental vascular component in early and late intrauterine fetal death. Thromb Res [Internet]. Elsevier; 2012 Dec 1 [cited 2016 Mar 14];130(6): Available from: Ananth C V, Keyes KM, Hamilton A, Gissler M, Wu C, Liu S, et al. An international contrast of rates of placental abruption: an age-period-cohort analysis. PLoS One [Internet]. 2015;10(5):e Available from: Tikkanen M, Riihimäki O, Gissler M, Luukkaala T, Metsäranta M, Andersson S, et al. Decreasing incidence of placental abruption in Finland during Acta Obstet Gynecol Scand. 2012;91(9): Ananth C V., Vanderweele TJ. Placental abruption and perinatal mortality with preterm delivery as a mediator: Disentangling direct and indirect effects. Am J Epidemiol. 2011;174(1): Thachil J, Toh C-H. Disseminated intravascular coagulation in obstetric disorders and its acute haematological management. Blood Rev [Internet] Jul [cited 2016 Mar 15];23(4): Available from: Anderson JAM, Weitz JI. Hypercoagulable States. Crit Care Clin [Internet] Oct [cited 2015 Dec 14];27(4): Available from: Lockwood C, Wendel G, Committee on Practice Bulletins Obstetrics. Practice bulletin no. 124: inherited thrombophilias in pregnancy. Obstet Gynecol [Internet] Sep;118(3): Available from:

81 Bradley LA, Palomaki GE, Bienstock J, Varga E, Scott JA. Can Factor V Leiden and prothrombin G20210A testing in women with recurrent pregnancy loss result in improved pregnancy outcomes?: Results from a targeted evidence-based review. Genet Med [Internet]. American College of Medical Genetics; 2012 Jan;14(1): Available from: Emmerich J, Rosendaal FR, Cattaneo M, Margaglione M, De Stefano V, Cumming T, et al. Combined effect of factor V Leiden and prothrombin 20210A on the risk of venous thromboembolism: Pooled analysis of 8 case-control studies including 2310 cases and 3204 controls. Thromb Haemost. 2001;86(3): Rodger MA, Betancourt MT, Clark P, Lindqvist PG, Dizon-Townson D, Said J, et al. The association of factor V leiden and prothrombin gene mutation and placenta-mediated pregnancy complications: a systematic review and metaanalysis of prospective cohort studies. PLoS Med [Internet]. 2010;7(6):e Available from: ntrez&rendertype=abstract 82. Bailey LB, Gregory JF. Recent Advances in Nutritional Science Polymorphisms of Reductase and Other Enzymes : Metabolic Significance, Risks and. Metab Clin Exp. 1999; Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet [Internet]. 1995;10(1): Available from: Ray JG. Meta-analysis of hyperhomocysteinemia as a risk factor for venous thromboembolic disease. Arch Intern Med. 1998;158(19): Bos GMJ, Den Heijer M. Hyperhomocysteinemia and venous thrombosis. Semin Thromb Hemost. 1998;24(4): Den Heijer M, Lewington S, Clarke R. Homocysteine, MTHFR and risk of venous thrombosis: a meta-analysis of published epidemiological studies. J Thromb Haemost [Internet]. 2005;3(2): Available from: Rey E, Kahn SR, David M, Shrier I. Thrombophilic disorders and fetal loss: a meta-analysis. Lancet (London, England) [Internet]. Elsevier; 2003 Mar 15 [cited 2016 Mar 3];361(9361): Available from: Ren A, Wang J. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and the risk of unexplained recurrent pregnancy loss: a meta-analysis. Fertil Steril [Internet] Dec [cited 2016 Mar 21];86(6): Available from:

82 Wu X, Zhao L, Zhu H, He D, Tang W, Luo Y. Association between the MTHFR C677T polymorphism and recurrent pregnancy loss: a meta-analysis. Genet Test Mol Biomarkers [Internet]. 2012;16(7): Available from: Lonn E, Yusuf S, Mj A, Med NEJ. Lowering homocysteine with folic acid and B vitamins did not prevent vascular events in vascular disease Lowering homocysteine with folic acid and B vitamins did not prevent vascular events after myocardial infarction. 2006;145(1). 91. MIYAKIS S, LOCKSHIN MD, ATSUMI T, BRANCH DW, BREY RL, CERVERA R, et al. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost [Internet]. Blackwell Science Inc; 2006;4(2): Available from: Bill Giannakopoulos, 1 Freda Passam, 1 Yiannis Ioannou 1 and Steven A. Krilis1 1Department. How we diagnose the antiphospholipid syndrome Bill. Blood. 2009;113(5): Doyle NM, Monga M, Gerhardt A, Scharf RE, Beckmann MW, Struve S, et al. Thromboembolic disease in pregnancy. Obstet Gynecol Clin North Am [Internet] Jun;342(6): Available from: Abou-Nassar K, Carrier M, Ramsay T, Rodger MA. The association between antiphospholipid antibodies and placenta mediated complications: a systematic review and meta-analysis. Thromb Res [Internet] Jul [cited 2016 Mar 11];128(1): Available from: do Prado AD, Piovesan DM, Staub HL, Horta BL. Association of anticardiolipin antibodies with preeclampsia: a systematic review and meta-analysis. Obstet Gynecol. 2010;116(6): Damodaram M, Kaladindi M, Luckit J, Yoong W. D-dimers as a screening test for venous thromboembolism in pregnancy: is it of any use? J Obstet Gynaecol [Internet]. 2009;29(2): Available from: Pinheiro M de B, Junqueira DRG, Coelho FF, Freitas LG, Carvalho MG, Gomes KB, et al. D-dimer in preeclampsia: systematic review and meta-analysis. Clin Chim Acta [Internet] Dec 24 [cited 2016 Feb 10];414: Available from: Mattar R, Torloni MR, Betrán AP, Merialdi M. Obesidade e gravidez. Rev Bras Ginecol e Obs. 2009;31(3): OMS. Obesity preventing and managing the global epidemic p Metwally M, Ong KJ, Ledger WL, Li TC. Does high body mass index increase the risk of miscarriage after spontaneous and assisted conception? A metaanalysis of the evidence. Fertil Steril. 2008;90(3):

83 Pomp ER, Lenselink AM, Rosendaal FR, Doggen CJM. Pregnancy, the postpartum period and prothrombotic defects: Risk of venous thrombosis in the MEGA study. J Thromb Haemost. 2008;6(4): Gerhardt A, Scharf RE, Beckmann MW, Struve S, Bender HG, Pillny M, et al. PROTHROMBIN AND FACTOR V MUTATIONS IN WOMEN WITH A HISTORY OF THROMBOSIS DURING PREGNANCY AND THE PUERPERIUM. N Engl J Med [Internet]. 2000;342(6): Available from: Bertina RM, Broekmans AW, van der Linden IK, Mertens K. Protein C deficiency in a Dutch family with thrombotic disease. Thromb Haemost [Internet]. 1982;48(1):1 5. Available from: Griffin JH, Evatt B, Zimmerman TS, Kleiss AJ, Wideman C. Deficiency of protein C in congenital thrombotic disease. J Clin Invest. 1981;68(5): Broekmans AW, Bertina RM, Reinalda-Poot J, Engesser L, Muller HP, Leeuw JA, et al. Hereditary protein S deficiency and venous thrombo-embolism. A study in three Dutch families. Thromb Haemost [Internet]. 1985;53(2): Available from: Sotiriadis A, Makrigiannakis A, Stefos T, Paraskevaidis E, Kalantaridou SN. Fibrinolytic defects and recurrent miscarriage: a systematic review and metaanalysis. Obstet Gynecol [Internet]. 2007;109(5): Available from: Sangle NA, Smock KJ. Antiphospholipid antibody syndrome. Arch Pathol Lab Med [Internet]. Elsevier Inc; 2011;135(9): Available from: Heijer M Den, Brouwer IA, Bos GMJ, Blom HJ, Put NMJ Van Der, Spaans AP, et al. Blood Homocysteine Levels A Controlled Trial in Patients With Venous Thrombosis and Healthy Volunteers. 1998; 109. Ziakas PD, Poulou LS, Pavlou M, Zintzaras E. Thrombophilia and venous thromboembolism in pregnancy: a meta-analysis of genetic risk. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol [Internet] Aug [cited 2015 Nov 9];191: Available from: Kazem Ghaffari, Ali Ghasemi, Abbas Ghotaslou, Mohsen Mohammadi ZS. Correlation between C677T and A1298C Mutations on the MTHFR Gene with Plasma Homocysteine Levels and Venous Thrombosis in Pregnant Women at Risk of Thrombosis. 2013; Kovac M, Mikovic Z, Rakicevic L, Srzentic S, Mandic V, Djordjevic V, et al. The use of D-dimer with new cutoff can be useful in diagnosis of venous thromboembolism in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol [Internet] Jan [cited 2016 Mar 9];148(1): Available from: Chan W-S, Rey E, Kent NE, Group =VTE in Pregnancy Guideline Working, Chan

84 84 W-S, Kent NE, et al. Venous thromboembolism and antithrombotic therapy in pregnancy. J Obstet Gynaecol Can [Internet]. Vancouver BC.; 2014;36(6): Available from: Bates SM, Middeldorp S, Rodger M, James AH, Greer I. Guidance for the treatment and prevention of obstetric-associated venous thromboembolism. J Thromb Thrombolysis [Internet]. Springer US; 2016;41(1): Available from: " Robertson L, Wu O, Langhorne P, Twaddle S, Clark P, Lowe GDO, et al. Thrombophilia in pregnancy: A systematic review. Br J Haematol. 2006;132(2): Said JM, Ignjatovic V, Monagle PT, P Walker S, Higgins JR, Brennecke SP. Altered reference ranges for protein C and protein S during early pregnancy: Implications for the diagnosis of protein C and protein S deficiency during pregnancy. Thromb Haemost [Internet]. Schattauer Publishers; 2010;103(5): Available from: Hunt SPBH. The Obstetric Hematology Manual. Cambrige University Press p Parker SE, Werler MM. Epidemiology of ischemic placental disease: a focus on preterm gestations. Semin Perinatol [Internet]. Elsevier; 2014;38(3): Available from: Morgan ES, Wilson E, Melody T, Parmar K, Zhang Y, Gao F, et al. An observational study of haemostatic changes, leptin and soluble endoglin during pregnancy in women with different BMIs. Blood Coagul Fibrinolysis [Internet]. 2016;1. Available from: Rodger MA, Hague WM, Kingdom J, Kahn SR, Karovitch A, Sermer M, et al. Antepartum dalteparin versus no antepartum dalteparin for the prevention of pregnancy complications in pregnant women with thrombophilia (TIPPS): a multinational open-label randomised trial. Lancet [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;384(9955): Available from: cdn.com/s /1-s2.0-s main.pdf?_tid=e3da4f72-c05b-11e4-b59b aab0f01&acdnat= _d46d f5d878d5e0946f Pasquier E, Martin LD Saint, Bohec C, Gal L, Douvier S, Heisert M, et al. Enoxaparin for prevention of unexplained recurrent miscarriage : a multicenter randomized double-blind placebo-controlled trial. 2015;125(14): Greenberg JA, Bell SJ. Multivitamin Supplementation During Pregnancy: Emphasis on Folic Acid and l-methylfolate. Rev Obstet Gynecol [Internet]. 2011;4(3-4): Available from: ntrez&rendertype=abstract 122. Lima MM de S, Diniz CP, Souza ASR, Melo AS de O, Neto CN. Ácido Fólico Na

85 85 Prevenção De Gravidez Acometida Por Morbidade Fetal: Aspectos Atuais. Femina. 2009;37(10): Rodger MA, Hague WM, Kingdom J, Kahn SR, Karovitch A, Sermer M, et al. Antepartum dalteparin versus no antepartum dalteparin for the prevention of pregnancy complications in pregnant women with thrombophilia (TIPPS): A multinational open-label randomised trial. Lancet [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;384(9955): Available from: cdn.com/s /1-s2.0-s main.pdf?_tid=e3da4f72-c05b-11e4-b59b aab0f01&acdnat= _d46d f5d878d5e0946f Pierangeli SS, Leader B, Barilaro G, Willis R, Branch DW. Acquired and Inherited Thrombophilia Disorders in Pregnancy. Obstet Gynecol Clin North Am. 2011;38: Simcox LE, Ormesher L, Tower C, Greer IA. Thrombophilia and pregnancy complications. Int J Mol Sci [Internet]. Multidisciplinary Digital Publishing Institute; 2015 Jan 30 [cited 2016 Mar 14];16(12): Available from:

86 ANEXOS 86

87 Anexo 1 Aprovação do PPSUS (fl1) 87

88 Anexo 1 Aprovação do PPSUS (fl 2) 88

89 Anexo 2 Permissão para utilização de imagem: (Autoimmun Highlights. Online March 24, doi: /s ) Editora Springer 89

90 APÊNDICES 90

91 Apêndice 1 91

92 Apêndice 2 92