Imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina

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1 Rev. educo confino CRMV SP / Continuous Educatio" }ollmal CRMV Sp, São Paulo, volume 4, fascículo 3, p. 7/ /. Imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina Immunophenotyping ofcanine lymphoma in paralfin embedded tissue VeridianaMariaBrianezi Dignam De Moura l - CRMV-SP -0 l()085 Julio Lopes Sequeira 2 - CRMV-SP RenéeLauferAmorim l - CRMV-SP * EnioPedooeBandarra 3 - CRMV-SP ISSN "'Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP Departamento de Clínica Veterinária Serviço de Patologia Veterinária Caixa Postal 560 Distrito de Rubião Júnior sln CEP Bolucalu - SP End. Eletrôn.: bandarraep@fml/z.unesp.br I Douloranda em Medicina Veterinária - Departamento de Clínica Veterinária - Serviço de Patologia Veterinária - FMVYUNESPlBotucatulSP. 2 Professor Assistente Doutor - Departamento de Clínica Veterinária - Serviço de Patologia Veterinária - FMV7.IUNESPlBotucatulSP. 3 Professor Adjunto - Departamento de Clínica Veterinária - Serviço de Patologia Veterinária - FMVYUNESPlBotucatulSP. RESUMO o presente estudo teve como objetivo a utilização da técnica de imunoistoquúnica para realizar a imunofenotipagem dos linfomas caninosem tecido incluídoem parafina. Paraisso, foram utilizados os anticorpos anti-cd3 para células T e anti-cd79a para células B. Os resultados demonstraram que os Iinfomas T são os de maior ocorrência (60,2%), seguidos pelos linfomas B (32,6%) e TIB (7,2%). Realizando aclassificação imunofenotípica destes linfomas, concluiu-se que os marcadores linfóides anti-cd3 (Dako A0452) e anti-cd79a (Dako M7051), espécie-específicos para humanos, apresentam reatividade cruzada com a espécie canina, sendo eficientes na determinação da linhagem linfóide dos linfomas caninos. Constatou-se ainda, que a técnica de imunoistoquímica aplicada em tecido incluído em parafina, apresenta excelentes resultados, principalmente com o avanço na descoberta de novos anticorpos mono e policlonais espécie-específicos ou que apresentem reatividade cruzada entre as espécies. Palavras-chave: cão, linfoma, imunoistoquímica, anticorpos, CD3, CD79a. Introdução e Revisão de Literatura infomas são neoplasias malignas caracterizadas pela proliferação de células nativas do tecido linfóide, que são linfócitos, histiócitos e, seus precursores e derivados (COTRAN et ai., 1994; VON- DERHAAR; MORRISON, 1998). Também chamado de linfossarcoma e linfoma maligno, é um dos tumores de maior ocorrência nos cães (CAPURRO et ai., 1992; VALLl, 1993; TESKE, 1994; MILNER et ai., 1996; VONDERHAAR; MORISON, 1998). Os linfomas caninos podem ser classificados anatomicamente em: multicêntricos, tímicos, digestivos, cutâneos e solitários; quanto a citomorfologia em: baixo, 71

2 DE MOURA, V. M. B. D.; SEQUEIRA, J. L.; AMüRIM, R. L.; BANDARRA, E. P.lmunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafinallmmuflophe"otyping ofcanine Iymphoma in paraffill embedded tissue I Rev. educo contin. CRMV-SP I Continuous Education Journal CRMV-SP, São Paulo, volume 4, fascículo 3, p , médio e alto grau; e quanto a imunomorfologia em: linfomas T, linfomas B e linfomas não B/não T, bem como de celularidade mista (BIT) (MOULTON; HARVEY, 1990; TESKE et al., 1994a; JONES et ai., 1997; DE MOU RA et ai., 1999; SEQUEIRA et ai., 1999). A classificação imunomorfológica dos linfomas caninos é feita através da técnica de imunoistoquímica, utilizando-se marcadores celulares específicos. Em Medicina Veterinária, esta técnica é pouco utilizada devido ao alto custo e ausência de marcadores espécie-específicos em alguns casos (MILNER et ai., 1996; FOUR NEL-FLEURY et ai., 1997; DE MOURA et ai., 1999). Até bem pouco tempo, a determinação do imunofenótipo dos linfomas em cães só era realizada utilizando-se métodos como a citometria de fluxo ou imunoistoquímica em cortes de congelação (APPELBAUM et ai., 1984; GREENLEE et ai., 1990; CANIATTI et ai., 1996; TESKE; Van HEERDE, 1996). Na verdade, a maior dificuldade para a diferenciação da linhagem celular dos linfomas em material incluído em parafina, residia na ausência de um marcador específico e eficiente para as neoplasias da linhagem B (MILNER et ai., 1996). Atualmente, com uma maior disponibilidade de anticorpos monoclonais capazes de interagir com antígenos de células linfóides humanas presentes em material fixado em formalina e incluído em parafina, muitas dificuldades diagnósticas puderam ser solucionadas (ALVES et ai., 1999; BACCHT; BACCHI, 1999). Essa realidade tomou-se verdade em Medicina Veterinária quando observou-se que vários desses anticorpos espécie-específicos para células humanas, apresentavam reatividade cruzada com outras espécies. Tal fato, especialmente nos casos de neoplasias linfóides em cães, permite a determinação do imunofenótipo dos linfomas caninos com grande sucesso (APPELBAUM et ai., 1984; TESKE et ai., 1994b; MILNER et ai., 1996; DARBES et ai., 1997; FOURNEL-FLEURY et ai., 1997). MILNER et ai. (1996); FOURNEL-FLEURY et ai. (1997), descreveram a aplicação dll-métodos imunoistoquímicos para a classificação imunofenotípica dos!infomas caninos em cortes histológicos de tecido incluído em parafina, utilizando o anticorpo policlonal anti-cd3 para marcar linfomas de células T e o anticorpo monoclonal anti-mbl (CD79a) para marcar linfomas de células B. O anticorpo policlonal anti-cd3 é um marcador de superfície celular altamente sensível e específico para a demonstração das células linfóides T. O anticorpo monoclonal anti-mb I (CD79a/clone HM57) é também um marcador de superfície celular e reage contra antígenos humanos e caninos, detectando a linhagem de células linfóides B em seus diferentes momentos de diferenciação, marcando de "blastos" a "citos", sendo, portanto, um marcador de amplo espectro e alta especificidade (AL- VES et ai., 1999; BACCHI; BACCHI, 1999). Diante do exposto, observa-se que novas técnicas têm sido desenvolvidas no intuito de colaborar no estabelecimento do diagnóstico e prognóstico das neoplasias de maneira geral. Portanto, a determinação do imunofenótipo nos linfomas caninos apresenta-se como mais um método diagnóstico e adiciona dados ao estudo do comportamento desta neoplasia na espécie em questão. Ainda, tendo em vista as semelhanças do ponto de vista epidemiológico, morfológico e imunofenotípico, permite avaliar a possibilidade da utilização dos!infomas caninos como modelo dos linfomas não-hodgkin nos seres humanos. Material e Métodos Foram classificados imunofenotipicamente 98 casos de linfoma canino existentes no arquivo do Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ-UNESP-Botucatu-S.P., no período de julho de 1969 ajulho de Cortes histológicos de três micrômetros (3mm) obtidos em micrótomo rotativo foram submetidos à técnica de imunoistoquímica (ALVES et al., 1999), utilizando-se os marcadores linfóides anti-cd3 (Dako A0452) para identificação de células T, e anti-cd79a (Dako M7051) para células B. A reação utilizou o complexo avidina-biotina-peroxidase de acordo com o princípio proposto por HSU et ai. (1981), tamoém conhecida como técnica de imunoperoxidase. Cada anticorpo foi diluído em solução de albumina bovina (BSA 1%) nas concentrações de: I:l00 para o anticorpo CD3 e 1:50 para o CD79a. Os cortes foram distendidos sobre lâminas histológicas previamente mergulhadas em solução de organosilano (3-Aminopropyl Trietoxysilane - Sigma Chemical CO - A 3648). A desparafinização dos tecidos foi obtida por banhos seqüenciais em xilol, procedendo-se então, a hidratação por passagens em álcool etílico a 100%,95%, 85% e água destilada. A recuperação antigênica foi realizada em solução de EDTA IOmMlpH8,0, previamente aquecida a 9SOC, utilizando-se panela de cozimento a vapor ("steamer" - T-falà), durante 25 minutos. Para o bloqueio da peroxidase endógena, utilizouse solução de peróxido de hidrogênio (20 volumes), diluída em água destilada na concentração de 1: I e, em seguida, banhos de TRTS ph7,4. Em seguida, as lâminas foram incubadas durante 18 horas a 4 C (overnight), em câmara úmida, com os anticorpos primários anti-cd3 (Rabbit anti-human T cell) e anti-cd79a (Mouse anti-human B cell), nas concentrações de I: 100 e 1:50, respectivamente. Após dois banhos com solução tampão de TRIS ph 7,4, as lâminas foram novamente incubadas utilizan- 72

3 DE MOURA. V. M. B. D.; SEQUEIRA, J. L.; AMORIM, R. L.; BANDARRA, E. P. Imunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafinallmmuliophe1l01)'p;"g ofcani"e lymphoma in paraffi" embedded /;ssue I Rev. educo contido CRMV SP I Continuous Education Joumal CRMV-SP, São Paulo. volume 4, fascículo 3, p , 200 I. do-se o kit LSAB (Dako-K0690), seguindo-se as instruções do fabricante. A revelação da reação foi obtida empregando-se a solução de Diaminobenzidina (DAB - Sigma Chemical CO - D5637) por quatro minutos ao abrigo da luz. Seqüencialmente, as lâminas foram contra-coradas com hematoxiiina de Meyer em banho de 10 minutos e lavagem em água destilada. Em seguida, eram desidratadas por passagens em álcool 85%, 95% e 100% e diafinizadas em xilol. A montagem das lâminas foi realizada utilizando-se resina sintética (permount - Fisher). As neoplasias que apresentaram positividade para os dois anticorpos foram classificadas como linfomas T/B e, os casos de linfomas não T/não-B não foram considerados neste estudo Linfomas T 32,6% O-!"C---_ Linfomas B Linfo",as TIB Figura 1. Freqüência de linfomas caninos quanto ao imunofenótipo. Resultados Os resultados obtidos utilizando-se a técnica de imunoistoquimica e os anticorpos anti-cd3 e anti-cd79a, para a determinação do imunofenótipo dos linfomas caninos apresentam-se na Tabela I e Figuras I a 3. Os linfomas T foram os mais freqüentes, sendo observados em 60,2% dos casos. Em seguida, apresentaram-se os linfomas B com 32,6%, e os linfomas T/B com 7,2% de freqüência. Estes valores estão apresentados nas Tabela e Figura I. As Figuras 2 e 3 representam os tipos T e B marcados pelos anticorpos CD3 e CD79a. Os linfomas do tipo T/B (celularidade mista) apresentaram positividade para ambos os anticorpos utilizados. Discussão e Conclusões Figura 2. Linfoma de células T. Reação imunoistoquíoüca positiva (coloração acastanhada) para o anticorpo anti-cd3/250x. O uso de marcadores específicos para tecido linfóide apresenta grande utilidade na prática diagnóstica, pois através da aplicação de anticorpos mono ou policlonais em tecido incluído em parafina, pode-se definir, não só o diagnóstico da Tabela 1 - Imunofenotipagem dos Iinfomas caninos. Imunolenótipo Número de Freqüência casos T 59 60,2% B 32 32,6% TIB 7 7,2% Total % Figura 3. Linfoma de células B. Reação imunoistoquímica positiva (coloração acastanhada) para o anticorpo antí-cd79a1600x. 73

4 DE MOURA. V. M. B. D.; SEQUElRA, J. L.;AMORJM, R. L.; BANDARRA, E. P.lmunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafinallmmunophenotyping ofcanine lymphomo in paraffin embedded tissue I Rev. educo contin. CRMV-SP I Continuous Education Journal CRMV-SP, São Paulo, volume 4, fascículo 3, p ,2001. neoplasia, assim como melhor caracterizá-ia do ponto de vista histogenético (ALVES et ai., 1999; BACCHI; BACCHI, 1999). A determinação do imunofenótipo é a base para a atual classificação dos linfomas na patologia humana. Em medicina veterinária esta técnica vem sendo utilizada com restrições, devido ao alto custo e ausência de marcadores espécie específicos (MILNER et ai., 1996; FOUR NEL-FLEURY et ai., 1997). Os trabalhos veterinários que utilizam esta técnica baseiam-se no princípio da reatividade cruzada que certos anticorpos possam apresentar. Diante disto, talvez, se a produção de anticorpos fosse específica para a espécie canina, os resultados pudessem refletir um padrão diferente e mais preciso (DARBES et ai., 1997). APPELBAUM et ai. (1984), estudando o imunofenótipo dos linfomas caninos, concluíram que esta neoplasia revela uma heterogenicidade que não pode ser avaliada pela histopatologia clássica. Sendo assim, o conhecimento do imunofenótipo das células neoplásicas permite uma correlação entre o comportamento clínico do tumor e sua resposta a quimioterapia. No presente estudo, o imunofenótipo de células T ocorreu na maioria dos casos (60,2%), seguidos pelos linfomas B (32,6%) e TIB (7,2%). Tal achado é contraditório com a literatura humana e veterinária, em que a prevalência imunofenotípica dos linfomas é de células B (APPELBAUM et ai., 1984; TESKE, 1994; TESKE et ai., 1994b; TESKE; Van HEERDE, 1996; FOUR NEL-FLEURY et ai., 1997). O fato de se ter trabalhado com tecido fixado em solução de formalina tamponada a 10% e incluído em parafina pode justificar tal discrepância, uma vez que vários pesquisadores utilizaram a técnica de imunoistoquímica em material congelado (APPELBAUM et ai., 1984; GREENLEE et ai., 1990; CANlATTI et ai., 1996; TESKE; Van HEERDE, 1996). Ainda, de acordo com MILNER et ai. (1996), o anticorpo utilizado para a marcação de clones de células B não é eficiente em alguns casos, apresentando marcação espúria. Em humanos do mundo ocidental, a prevalência de linfomas é de células B, porém na Ásia o perfil mais comum é o linfoma tipo T (TESKE et ai., 1994b). Essas diferenças geográficas que ocorrem na espécie humana talvez possam se refletir nos animais domésticos. De acordo com FOURNEL-FLEURY et ai. (1997), estudos de imunofenotipagem são difíceis de serem comparados devido à ausência de um consenso entre os diferentes autores, com relação à especificidade dos diferentes marcadores utilizados. Além disso, deve-se considerar a categoria citohistológica em que essas neoplasias se encaixam, ou seja, se são linfomas de baixo grau, grau intermediário ou alto grau, pois sabe-se que a maioria dos Linfomas T são de grau intermediário e baixo grau (TESKE, 1994; TESKE et ai., 1994b; FOURNEL-FLEURY et ai., 1997). No entanto, esta variável não foi avaliada no presente estudo, uma vez que a proposta dos autores foi apenas determinar o imunofenótipo dos linfomas caninos sem estabelecer qualquer relação com a morfologia celular. Diante dos resultados, concluiu-se que a técnica de imunoistoquírnica, utilizando marcadores linfóides específicos para células T e B em tecido incluído em parafina, é um método eficiente na determinação do imunofenótipo dos linfomas não-hodgk.in nos cães. Constatou-se também, que a grande maioria dos linfomas caninos são da linhagem linfóide T. É importante ressaltar que a ciência veterinária deve manter-se em contínuo avanço, utilizando novas técnicas como a de imunoistoquímica para que se possa, cada vez mais, conhecer a gênese e o comportamento de neoplasias malignas como os linfomas caninos. não-hodgk.in. SUMMARY The use of immunohistochemistry techniques to c1assify canine Iymphomas in paraffin embedded tissues was the object of this study. Anti-CD3 antibodies for T-cells and anti-cd79a antibodies for B cells were used. T-cell Iymphomas were more frequent (60.2%), followed by B-cell Iymphomas (32.6%) and TIB-cell Iymphomas (7.2%). Using the Iymphoid anti-cd3 (Dako A0452) and anti CD79a (Dako M7051) markers specific for humans, we concluded that these antibodies showed cross-reactivity with canine tissue and can be used in deterrnining the lymphoid line ofcanine Iymphomas. We also showed that the immunohistochemistry technique used in paraffin embedded tissues had exceljent results, specially with the development of new mono and polyclonal antibodies with cross reacti vity between species. Key words: dog, Iymphoma, immunohistochemistry, antibody, CD3, CD79a. 74

5 DE MOURA, V. M. B. D.; SEQUEIRA, J. L.; AMORIM. R. L.; BANDARRA, E. P.lmunofenotipagem dos linfomas caninos em tecido incluído em parafina Ilmmunophenoryping ofcanine lymphoma in paraffin embedded lissue I Rev. educo contin. CRMV-SP I Continuous Education Journal CRMV-SP, São Paulo. volume 4. fascículo 3, p REFERÊNCIAS I. ALVES, V. A. E; BACCHJ, C. E.; VASSALLO, J. Manual de imuno-histoquímica. São Paulo: Sociedade Brasileira de Patologia, p APPELBAUM, E R.; SALE, G. E.; STORB, R.; CHARRIER, K.; DEEG, H. J.; GRAHAM, T.; WULFF, J. C. Pbenotyping ofcanine Iymphoma with monoclonaj antibodies directed at cell surface antigens: c1assification, morphology, clinicaj presentation and response to chemolherapy. HematologicaJ Oncology, v. 2, n. 2, p , BACCHJ, C. E.; BACCHJ, M. M. Immunohematopalhology markers in paraffin sections. The JournaJ of Histotechnology, v. 22, n. 3, p , CANlATTI, M.; ROCCABIANCA, P.; SCANZIANI, E.; PAL TRINIERl, S.; MOORE, P. E Canine Iymphoma: Immunocytochemical analysis of fine needle aspiration biopsy. Veterinary Pathology, v. 33, n. 2, p , CAPURRO,c.; BURACCO, P.; ROSSI, L. Lymphoma in dogs. European JournaJ of Com. Animal Practice, v. 2, n. 2, p. 7 19, COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. L. Pathologic basis 01' disease Philadelphia: W B. Saunders, p DARBES, J.; MAJZOUB, M.; HERMANNS, W Evaluation of lhe cross-reactivity between human and feline or canine leucocyte antigens using commerciajly available antibodies. Brief communication. Journal of Veterinary Diagnosis and Investigation, v. 9, n. I, p , DE MOURA, V. M. B. O.; SEQUEIRA, J. L.; BANDARRA, E. P. Linfoma Canino. Rev;sta de Educação Continuada do CRMV - SP, v. 2, n. 2, p , FOURNEL-FLEURY, c.; MAGNOL, J. P.; BRICAlRE, P.; MARCHAL, T.; CHABANNE, L.; DELVERDIER, A ; BRYON, P. A ; FELMAN, P. CytohistologicaJ and immunologicaj c1assification ofcanine majignant Iymphomas: comparison with human non-hodgkin's Iymphomas. JournaJ of Comparative Pathology, v. 117, n. I, p , GREENLEE, P. G.; FILIPPA, D. A.; QUIMBY, F. W; PAT NAIK, A. K.; CALVANO, S. E.; MATUS, R. E.; KlMMEL, M.; HURVITZ, A. 1.; UEBERMAN, P. H. Lymphomas in dogs. A morphologic, immunologic, and clinicai study. Cancer, v. 66, n. 3, p , HSU, S. M.; RAlNE, L.; FANGER, H. Use of avidin-biotinperoxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: A comparison between ABC and unlabeled (PAP) procedures. Journal ofhistochemistry and Cytochentistry, n. 29, p , JONES, C. J.; HUNT, R. D.; KING, N. W Veterinary pathology Philadelphia: Williams & Wilkins, p MILNER, R. J.; PEARSON, J.; NESPIT, J. W; CLOSE, P. lmmunophenotypic c1assification ofcanine malignant Iymphoma on formalin-fixoo paraffin wax-embedded tissue by means of CD3 and CD79a cell markers. Onderstepoort JournaJ of Veterinary Research, v. 63, n. 4, p l3, MOULTüN, J. E.; HARVEY, J. W. Tumours of lhe Iymphoid and hematopoietic tissues. In: MOULTON, J. E. Thmours in domestic animais. London: University of Califomia Press, p SEQUEIRA, J. L.; FRANCO, M.; BANDARRA, E. P.; FI GUEIREDO, L. M. A.; ROCHA, N. S. Características Anatomoclínicas dos Linfomas Caninos na região de Botucatu I SP. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 5I,n.3,p , TESKE, E. Canine malignant Iymphoma: A review and comparison wilh human non-hodgkin's Iymphoma. Veterinary Quarterly, v. 16, n. 4, p I9, TESKE, E.; Van HEERDE, P. Diagnostic vajue and reproducibility of fine needle aspiration cytology in canine malignant Iymphoma. The Veterinary Quarterly, v. 18, n. 3, p , TESKE, E.; Van HEERDE, P.; RUTTEMAN, G. R.; KURZ MAN, I. O.; MOORE, P. F.; MACEWEN, E. G. Prognostic factors for treatmen! of majignant Iymphoma in dogs. Journal of lhe American Veterinary Meducal Association, v. 205, n. 12, p , 1994a. 19. TESKE, E.; WISMAN, P.; MOORE, P. E; Van HEERDE, P. Histologic c1assification and immunophenotyping of canine non-hodgkin's Iymphomas: unexpected high frequency oft celllymphomas with B cell morphology. Experimental Hematology, v. 22, n. 12, p , I994b. 20. VALLI, V. E. O. The hematopoietic system. In: JUBB, K. V. F.; KENNEDY, P. c.; PALMER, N. Pathology ofdomestic animais. 4. ed. New York: Acadernic Press, v. 3, p VONDERHAAR, M. A.; MORRISON, W. B. Lymphossarcoma. In: MORRlSON, W. B. Cancer in dogs and cats. Philadelphia: Williams & Wilkins, p