HAV Ab. do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa.

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1 HAV Ab P do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prédiluídas a 1:50 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. IgG e IgM serão capturados pelos anticorpos anti-igg e anti-igm dos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os anticorpos IgM e IgG anti-hav capturados nos dentes reagirão com antígenos HAV. Simultaneamente, os antígenos HAV também se ligarão aos anticorpos anti-hav no ponto superior (Controle Interno). Na fileira D os antígenos HAV ligados reagirão com os anticorpos monoclonais anti-hav marcados com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com os componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Código: Versão: 456/P6 Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb II HAV Ab é um teste para a detecção semi quantitativa dos anticorpos para o vírus de hepatite A (HAV) em soro ou plasma humano. Trinta e seis testes podem ser realizados com um kit. Introdução A hepatite A é uma doença freqüente em humanos, causada pelo vírus da hepatite A (HAV). Após um período de incubação de dias, a infecção por HAV geralmente se manifesta por icterícia, devido à inflamação aguda do fígado e concentrações elevadas de bilirrubina no sangue. Não foram reportados casos de infecção crônica. A hepatite A é endêmica em todas as partes do mundo. Sua epidemiologia é acentuadamente influenciada pelo nível local de saneamento e higiene. A transmissão ocorre por via fecal-oral. Um alto nível de vírus (até 10 8 unidades infecciosas por grama) é excretado nas fezes alguns dias antes da manifestação dos sintomas clínicos ou icterícia. A disseminação do vírus é, então, facilitada através do contato direto ou através do consumo de água ou alimentos contaminados. A profilaxia bem sucedida da hepatite A é atualmente obtida por imunização passiva com imunoglobulinas anti-hav humanas. Além disso, foram recentemente desenvolvidas vacinas para HAV. Diversas causas de origem viral (ex. vírus da hepatite B e hepatite C) ou não virals podem induzir a hepatite. Conseqüentemente, o diagnóstico da infecção por HAV baseado apenas nos sintomas clínicos e na avaliação bioquímica das funções hepáticas, é muito difícil. Entretanto, o imunodiagnóstico permite a identificação do agente etiológico. O ensaio HAV Ab facilita a determinação do estado imune de indivíduos após exposição ao HAV ou vacina para hepatite A. A detecção de anticorpos anti-hav na ausência de anticorpos do tipo IgM anti-hav, indica tanto uma infecção precoce com HAV como uma vacinação bem sucedida. Em geral, um título de 10 UI/L é considerado como a concentração mínima de anticorpos anti-hav para indicar imunização do indivíduo. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (anticorpos anti-hav) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio para confirmar a validação do teste. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinzaazulados. O dente usado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior anticorpo monoclonal para hepatite A (Controle Interno). Ponto inferior anticorpos de coelho para IgG e IgM humanos. Princípio do Teste O teste ImmunoComb II HAV IgM é um ensaio imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio de imunocaptura. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior anticorpo monoclonal para HAV (Controle Interno). Ponto inferior anticorpos de coelho para IgG e IgM humanos. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: 456/P6 1

2 Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Diluente de amostra Solução de lavagem Antígeno HAV Anticorpo monoclonal anti-hav marcado com fosfatase alcalina Solução de lavagem Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano, inativado pelo calor, diluído a um título de 100 UI/L para anticorpos HAV. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-hav. Diluente de amostra 1 frasco (tampa branca) de 20 ml de diluente. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale TM para leitura dos resultados do teste. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação das amostras Tanto o soro como o plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão ajustáveis e ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 490 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos Preparando o Teste 1. Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente. 2. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 3. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 4. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 56 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição de Amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 490 µl do diluente de amostra em um microtubo. 2. Para cada microtubo, adicionar 10 µl de uma amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo fornecidos no kit. Misturar enchendo e esvaziando a solução diversas vezes. Captura de Anticorpos (Fileira A da Placa Reveladora) Nota: Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem devem ser realizadas à temperatura ambiente (22-26ºC). 3. Pipetar 25 µl de uma amostra pré-diluída. Perfurar a tampa de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar repetidamente enchendo e esvaziando a ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Colocar o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A e incubar por 2 horas a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Misturar mais três vezes (a cada 30 minutos) durante a incubação. Próximo ao final de 2 horas, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final de 2 horas, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar no mínimo 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c. Reação antígeno-anticorpo (Fileira C) 456/P6 2

3 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 5a. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 30 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira D. Misturar mais uma vez durante a incubação. Após os 30 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Ligação do Conjugado (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. Misturar mais uma vez durante a incubação. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Perfurar as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por exatamente 10 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras utilizadas, ponteiras, microtubos, papel absorvente e luvas, como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2-8ºC. Interpretação dos Resultados Validação Para confirmar o correto funcionamento do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Positivo Controle Negativo Figura 5. Validação dos testes. Resultados Inválidos Leitura e Interpretação dos Resultados Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual O nível de anticorpos anti-hav em cada amostra pode ser estimado pela comparação da intensidade de cor do ponto inferior de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit: Figura 6. CombScale 1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente de Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante à escala de cores. Ajustar a régua de modo que 100; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição de calibração da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Um ponto com intensidade maior ou igual à do ponto do cutoff (10 UI/L) indica a presença de um título de proteção de anticorpos anti-hav. Um ponto com uma coloração ligeiramente inferior à do cutoff deve ser considerada como resultado duvidoso e a amostra deve ser retestada. Um ponto com intensidade menor que a do cutoff deve ser considerado como resultado negativo. Leitura no Equipamento O refletômetro do CombScan TM (ver o Manual de Uso do Combscan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos no ImmunoComb. Ler os resultados como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, determinando a leitura do ponto inferior digitando 1 quando aparecer a mensagem pontos: 1,2,3 na tela. Valores de absorbância relativa de 350 (< 10 UI/L) ou inferiores são soronegativos para anticorpos para HAV. Valores de são duvidosos e a amostra deve ser retestada. Valores de 401 ou superiores são considerados como resultados positivos (> 10 UI/L). Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação. * Baseado na calibração usando o padrão da OMS de imunoglobulina anti-hav W1041. Limitações O kit ImmunoComb II HAV IgM é um teste de triagem. Resultados do teste que indicam que uma amostra é reativa para anticorpos para HAV não devem ser considerados como diagnóstico de infecção por hepatite A ou imunização para HAV. Os resultados dos testes devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, históricos clínicos e outros testes laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb II HAV Ab foram avaliados pela comparação com kits EIA de referência em 690 amostras: 596 amostras de doadores de sangue voluntários, 94 amostras de pacientes com infecção aguda ou passada por HAV. Os resultados destes testes estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Comparação do ImmunoComb HAV Ab com EIA de referência na determinação de anticorpos para vírus da hepatite A. EIA de ImmunoComb II HAV Ab Referência Positivo Negativo Positivo Negativo Sensibilidade 97,3% Especificidade 98,3% Concordância geral: 98,0% 456/P6 3

4 As reações cruzadas com amostras positivas de hepatites causadas por agentes, tais como o vírus da hepatite B ou C, citomegalovírus, vírus Epstein Barr, herpes simples e toxoplasma foram encontradas insignificantes. A interferência com amostras hemolisadas, lipêmicas e com bilirrubina alta foi encontrada insignificante. Amostras de pacientes com fator reumatóide (FR) e doenças autoimunes não interferem no teste. Os anticoagulantes testados, como heparina, EDTA e citrato de sódio não tiveram nenhum efeito nos resultados do teste. P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Blaine H, 1991.Hepatitis A virus. In: Viral Hepatitis (Hollinger FB Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp Decker R, Ling CM, Overby L. Frosner GG, Boggs J Serologyof transmission of hepatitis A in humans. J Infect Dis 139:74-82 Dienstag JL, Krugman S, Wong DC, Purcell RH Comparison of serological testes for antibody to hepatitis A antigenusing coded speciments from individuals infected with MS- 1 strain of hepatitis A vírus. Infect Immun 14: Duemeyer W. Van der Veen J, Koster B ELISA in hepatitisa. Lancet 1: Frosner GG, Papaevangelou G, Butter R, Iwarson S, Lindholm A, Courouce-Pauty AM Antibody against hepatitis A in seven european countries. I. Comparison of prevalence data in different age groups. Am J epidemol 110: Herrera JL serological diagnosis of viral hepatitis. S. Med. J. 87: Szmuness W, Dienstag JL, Purcell RH, Harley EJ, Stevens CE, Wong DC distribution of antibody to hepatitis A antigenin urban adult populations. N engl J Méd. 295: Zaaijer HL, Leentvaart-Kuijpers A, Rotman H and Lelie PN Hepatitis A antibody titres after infection and immunization; Implications for passive and active immunization.jméd.virol 40:22-27 Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC 456/P6 4

5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HAV Hb. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo) 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Pré-diluir 10 µl de cada amostra e controle misturando com 490 µl do diluente da amostra. 3. Dispensar 25 µl de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Captura de anticorpos A Misturar; incubar por 2 horas a 37ºC; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação antígeno anticorpo C Misturar; incubar por 30 minutos a 37ºC; absorver. Ligação do conjugado D Agitar; incubar por 20 minutos a 37ºC; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. 456/P6 5

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