CMV IgG. Figura 1. Princípio do Teste
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- Luiz Azambuja Barbosa
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1 CMV IgG P Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prédiluídas na proporção de 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-cmv, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos CMV no ponto inferior dos dentes do Pente (figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgG anti-cmv capturados nos pontos Inferiores dos dentes e a imunoglobulina humana dos pontos superiores (Controle interno) reagirão com anticorpos anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Código: Versão: 460/P7 Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb II CMV IgG é um teste para a detecção quantitativa de anticorpos IgG para Citomegalovirus (CMV), em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O Citomegalovírus é um membro da família Herpesviridae. Ele é um vírus com altas taxas de infecção durante os primeiros anos de vida. Pelo menos 80% da população adulta, pelo mundo todo, apresenta anticorpos contra o CMV. A infecção pelo CMV pode ser adquirida através de infecção congênita, no momento do nascimento, ou mais tarde na vida através de transmissão por transfusão sanguínea, derivados do sangue, saliva e outros fluidos corporais. A infecção por Citomegalovirus é principalmente assintomática. Entretanto, ocasionalmente podem ocorrer febre persistente, pneumonite, enterite, mononucleose e hepatite. Em duas circunstâncias a infecção por CMV pode causar complicações severas, por exemplo, na infecção primária durante o início da gravidez, levando a anormalidades congênitas no feto; e na infecção em pacientes imunodeficientes, como os receptores de órgãos ou de transplantes de medula óssea e portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Em pacientes transplantados, o CMV é a causa mais comum de mortalidade por infecção. Nos pacientes com AIDS, as doenças comumente induzidas por CMV afetam os pulmões, intestinos e sistema nervoso central. Uma complicação séria, a retinite, pode causar cegueira. A triagem de anticorpos para CMV IgG é útil para estabelecer a exposição prévia ao CMV. A determinação semanal ou quinzenal do nível de IgG anti-cmv também permite o diagnóstico de infecção aguda através da demonstração de um aumento significativo do título de anticorpos. Princípio do Teste O teste ImmunoComb II CMV IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado em duas posições: Ponto superior imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos CMV inativados A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo uma solução reagente pronta para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-cmv) e um Controle Negativo, para serem usados em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto inferior bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos CMV inativados Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Diluente de amostra Anticorpos de cabra anti-igg humana, marcados com fosfatase alcalina 460/P7 1
2 Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado, nas instruções do Teste. Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano inativado pelo calor, diluído para um cutoff de 1 UI/mL de anticorpos IgG para CMV. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano reconstituído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para CMV. Diluente de amostra 1 frasco (tampa transparente) de 5 ml. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale TM para a leitura dos resultados do teste. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental para laboratório. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma humano Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2-8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação de Amostras Tanto o soro como plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após o descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou tiras de cavidades de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 60 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição das amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µl do diluente de amostra em um microtubo ou cavidade de microtitulação. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µl da amostra ou do Controle Positivo ou Negativo fornecido no kit. Misturar enchendo e esvaziando a solução diversas vezes. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 3. Pipetar 25 µl de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e para os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente das cavidades pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a 460/P7 2
3 cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras usadas, ponteiras de pipetas, cavidades de microtitulação ou microtubos, papel absorvente e luvas, como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles, diluente de amostra e instruções de uso à caixa do kit. Armazenar de 2-8 ºC. Resultado dos Testes Validação Para confirmar o correto funcionamento do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle nterno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Figura 5. Validação dos testes Leitura e Interpretação dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do controle positivo (Figura 6). Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgG anti- CMV. Nenhum ponto ou um ponto com coloração menos intensa que o controle positivo é indicativo para ausência de anticorpos IgG para CMV (resultado negativo). Figura 6. Resultado dos Testes Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual O nível de IgG anti-cmv em cada amostra pode ser avaliado pela comparação da intensidade da cor do ponto inferior em cada dente com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit. Isto é realizado como segue: 1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do Controle Positivo sob a intensidade de cor similar ao da escala. Ajustar a régua de modo que 1; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade de cor similar da escala. Marcar a concentração (em UI/mL) que aparecer acima daquela janela como nível aproximado de anticorpos IgG anti-cmv para aquela amostra. Leitura no Equipamento Figura 7. CombScale O refletômetro CombScan TM (ver o Manual do Usuário do CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, determinando a leitura do ponto inferior digitando 1 quando aparecer a mensagem pontos: 1,2,3 na tela. Converter as unidades de absorbância relativas obtidas em valores de título de acordo com a Tabela 1. Tabela 1. Conversão de leituras de absorbâncias relativas em títulos de IgG Absorbância Relativa Título (UI/mL) < Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A sensibilidade e especificidade do kit ImmunoComb II CMV IgG foram avaliadas em um painel de 554 amostras de soro, em 460/P7 3
4 comparação com um ensaio EIA de referência. Os resultados estão resumidos na tabela 2. Tabela 2. Resultados dos testes Ensaio de ImmunoComb II CMV IgG Referência Positivo Negativo Positivo Negativo P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 99,4% Especificidade 98,2% * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Beneke JS, Tegtmeiier GE, Alter HJ, Luetgemeyer RB, Solomon R, Bayer WL Relation of titers of antibodies to CMV in blood donors to the transmission of cytomegalovirus infection. J Infect Dis 150: Corey L Herpesviruses. In: Sherris JC, ed. Medical Microbiology, An Introduction to Infectious Diseases. Elsevier, New York, pp Doerr HW, Braun R, Munk K Human cytomegalovirus infection: recent developments in diagnosis and epidemiology. Clin Wochenschr 63: Edmond EE, Hart HF Diagnosis of cytomegalovirus infection. In: Young H, McMillan A, eds. Immunological Diagnosis of Sexually Transmitted Diseases. Marcel Dekker, New York, pp Forbes BA Acquisition of cytomegalovirus infection: un update. Clin Microbiol Rev 2: Hodinka RL, Friedman HM Human cytomegalovirus infection. In: Balows A, Hausler WJ, Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology. Fifth Edition. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp Rasmussen L, Kelsail D, Nelson R, Carney W, Hirsh M, Winston D, Preiksaitis J, Merigan TC Virus specific IgG and IgM antibodies in normal and immunosuppressed subjects infected with cytomegalovirus. J Infect Dis 145: Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC 460/P7 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos de Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II CMV IgG. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. 2. Pré-diluir 10 µl de cada amostra e controle com 100 µl de diluente de amostra. 3. Dispensar 25 µl de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento do Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 30 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incube por 10 minutos. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. 460/P7 5
CMV IgM. do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa.
CMV IgM P do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prétratadas com anti-igg
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B ligarão especificamente aos peptídios sintéticos nos pontos inferior e/ou intermediário nos dentes do pente (Figura 1). Simultaneamente, as imunoglobulinas presentes nas amostras serão capturadas pelos
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