HAV IgM. Somente para Uso Diagnóstico in Vitro. Uso Pretendido. Introdução. Conteúdo do Kit. Princípio do Teste

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1 HAV IgM B A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são pré-diluídas a 1:50 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. O IgM humano será capturado pelos anticorpos anti-igm nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os anticorpos anti-hav IgM capturados nos dentes reagirão com antígenos HAV. Simultaneamente, os antígenos HAV também se ligarão aos anticorpos anti-hav no ponto superior ( Interno). Na fileira D, os antígenos HAV ligados reagirão com os anticorpos monoclonais anti-hav marcados com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície dos dentes do Captura Anticorpos; 2 horas / 37 C anti - IgM humano Anticorpos IgM humanos HAV Reação HAV / anti-hav; 30 min / 37 C Código: Somente para Uso Diagnóstico in Vitro Formato: 3 x 12 testes Uso Pretendido O kit ImmunoComb II HAV IgM é um teste EIA rápido para a determinação qualitativa de anticorpos IgM para o vírus de hepatite A (HAV) em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes om um kit. Introdução A hepatite A é uma doença freqüente em humanos, causada pelo vírus da hepatite A (HAV). Após um período de incubação de dias, a infecção por HAV geralmente se manifesta por icterícia, devido à inflamação aguda do fígado e concentrações elevadas de bilirrubina no sangue. Não foram reportados casos de infecção crônica. A hepatite A é endêmica em todas as partes do mundo. Sua epidemiologia é acentuadamente influenciada pelo nível local de saneamento e higiene. A transmissão ocorre por via fecal-oral. Altos níveis de vírus (até 10 8 unidades infecciosas por grama) são excretados nas fezes alguns dias antes da manifestação dos sintomas clínicos ou icterícia. A disseminação do vírus é, então, facilitada através do contato direto ou através do consumo de água ou alimentos contaminados. A profilaxia bem sucedida da hepatite A é atualmente obtida por imunização passiva com imunoglobulinas anti-hav humanas. Além disso, foram recentemente desenvolvidas vacinas para HAV. Diversas causas de origem viral (ex. vírus da hepatite B e hepatite C) ou não viral podem induzir a hepatite. Conseqüentemente, o diagnóstico da infecção por HAV baseado apenas nos sintomas clínicos e na avaliação bioquímica das funções hepáticas, é muito difícil. Entretanto, o imunodiagnóstico permite a identificação do agente etiológico. Anticorpos IgM para HAV são produzidos no estágio inicial da infecção por HAV e persistem durante a fase aguda da doença. A detecção do anti-hav IgM usando o kit ImmunoComb II HAV IgM permite um diagnóstico confiável de infecção aguda de HAV. Princípio do Teste O teste ImmunoComb II HAV IgM é um ensaio imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio de imunocaptura. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior anticorpo monoclonal para o vírus da hepatite A ( Interno). Ponto inferior anticorpos de coelho para IgM humano. Conjugado anti - HAV Substrato cromogênico Figura 1. Princípio do Teste Ligação conjugado Anti-HAV; 20 min / 37 C Reação Enzimática De cor; 10 min / 37 C O kit inclui um Positivo (anti-hav IgM) e um Negativo, para serem inserídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente usado com o Negativo deve mostrar o ponto superior e/ ou nenhum ponto inferior ou um ponto bem fraco. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior anticorpo monoclonal para o vírus da hepatite A ( Interno). Ponto inferior anticorpos de coelho para o IgM humano Figura 2. Pente ImmunoComb II Interno IgM Anti humanos Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada /B9/OR 1

2 O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Solução de lavagem Fileira C Antígeno HAV Fileira D Anticorpo monoclonal anti-hav marcado com fosfatase alcalina Fileira E Solução de lavagem Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazólio (NBT) abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 10 μl, 25 μl e 490 μl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos Preparando o Teste Trazer todos os componentes, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a 37 0 C. Figura 3. Placa Reveladora Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano inativado pelo calor, contendo anticorpos IgM para HAV. Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para HAV. Diluente da amostra 1 frasco de 20 ml de diluente. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes*, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. * A menos que sejam armazenados para documentação posterior. Armazenamento e Estabilidade do kit O kit é fornecido a 2-8 ºC. Durante o transporte o kit pode ser conservado a 30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas. Armazenar os componentes na embalagem original a 2-8ºC. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados a 2-8ºC. O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado a 2-8ºC. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser utilizados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias a 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37 0 C por 45 minutos. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um Pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 57 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte não utilizada do Pente para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a 2 8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição de Amostras e s 1. Para cada amostra e controle, dispensar 490 μl do diluente de amostra em um microtubo. 2. Para cada microtubo, adicionar 10 μl de uma amostra ou do Positivo ou Negativo fornecidos com o kit. Misturar enchendo e esvaziando a solução diversas vezes. Captura de Anticorpos (Fileira A da Placa Reveladora) Nota: Realizar a incubação a 37ºC. Os passos de lavagem devem ser realizados a temperatura ambiente (22 26ºC). 3. Pipetar 25 μl de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando a solução repetidamente. Descartar a ponteira da pipeta. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles /B9/OR 2

3 Misturar: Retirar e inserir o Pente das cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A e incubar por 2 horas a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final das 2 horas, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final das 2 horas, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual das pontas dos dentes, com papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual, como no passo 5c. Reação antígeno-anticorpo (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 5a. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 30 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 30 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Ligação do Conjugado (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar a cobertura da fileira E. Após 20 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserirr o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por exatamente 10 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar a 2-8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5). 1. O Positivo deve produzir dois pontos no dente do 2. O Negativo deve produzir um ponto superior ( Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior ( Interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Positivo Negativo Figura 5. Validação dos Testes Resultados Inválidos Negativo Positivo Figura 6. Resultado dos Testes Amostra Presença de anticorpos IgM para HAV Interpretação Qualitativa dos Resultados Interpretação Visual Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do Positivo (Figura 6). Um ponto com intensidade maior ou igual a do Positivo indica a presença de anticorpos IgM anti-hav. Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor que a do Positivo deve ser considerada como resultado negativo. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação. Limitações O kit ImmunoComb II HAV IgM é um teste de triagem. Os resultados do teste indicativos de que a amostra é reativa para anticorpos IgM para HAV não devem ser considerados como diagnóstico para infecção por hepatite A. Os resultados dos testes devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, históricos clínicos e outros testes laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A) Painel de Desempenho A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb II HAV IgM foram avaliadas em um painel de 627 amostras de soro. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resultados dos testes Ensaio de ImmunoComb II HAV IgM Referência Positivo Negativo Positivo Negativo Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 98,5% Especificidade 99,3% B) Soroconversão A capacidade do kit ImmunoComb II HAV IgM para detectar precocemente a soroconversão de HAV IgM foi avaliada em um painel de soroconversão com 5 membros obtidos da Boston Biomédica, Inc (Bridgewater, MA USA) de um único individuo com anti-hav IgM RIA como ensaio de referência. Ambos os testes detectaram anti-hav IgM nos soros números 3 e 4, mas não mais no soro número 5. Anti-HAV IgG foi detectado nas amostras 3 a 5. Os resultados mostram 100% de correlação com o RIA. Repetibilidade 10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de partes diferentes de um lote de produção. Um soro positivo para HAV foi testado 12 vezes em cada pente. Em todos os casos foram detectados amostras positivas para HAV IgM. Reprodutibilidade Três amostras positivas para HAV foram testadas em pentes retirados de 3 lotes diferentes de produção. Em todos os casos foram detectadas amostras positivas. Reação Cruzada A reação cruzada encontrada foi insignificante com amostras positivas de Hepatite causadas por agentes como Antígeno de Superfície da Hepatite B, vírus da Hepatite C, HIV 1&2, HAV Ab e HTLV /B9/OR 3

4 Interferência Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina acima de 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol acima de 281,6 mg/dl); triglicérides (381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (acima de 20 mg/dl). * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Blaine H Hepatitis AVirus. In:Viral Hepatitis (Hollinger FB, Pureel, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticelurst J, eds. Raven Press, New York, pp Decker R. Ling CM, Overby L, Frosner GG, Boggs J Serology of transmission of hepatitis A in humans. J Infect Dis. 139:74-82 Dienstag Jl Krugman S, Wong DC, Purcell RH Companion of serological tests for antibody to hepatitis A antigen using coded specimens from individuals infected with MS-1 strain of hepatitis A virus. IInfect Immun 14: Duermeyer W, Van der Veen J, Koster B ELISA in hepatitis A. Lancet 1: Frosner GG, Papaevangelon G, Butler R, Iwarson S, Lindholm A,Courource-Pauty AM Antibody against hepatitis A in seven european countries. I. Comparison of prevalence data in different age groups. Am J Epidemiol 110: Herrera JL serological diagnosis of viral hepatitis S Méd Ji 87: Liyasu PK, Caldwell SII Diagnosis and treatment of the major hepatotropic virusars. Am J Méd Set 306: Szmuness W, Dienstag JL, Purcell RH, Harley EJ, Stevens CE, Wong Dc, Distribution of antibodies to hepatitis A antigen in urban adult populations. N Engl J Méd 295: Zanijer IIL, Leentvaart-Kuijpers A, Rotman II and Lelie PN hepatitis A antibody titres after infection and immunization; Implications for passive and active immunization.jmédvirol 40: Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) astec@prodimol.com.br Registro ANVISA nº Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo Soares - CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B9/OR (05/2010) Version: /B9/OR (05/2010) /B9/OR 4

5 Resumo dos principais procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Aspirar e pré-diluir Adicionar amostras e Remover o Pente da Reveladora: 45 minutos a 37 C amostras e controles controles pré-diluidos embalagem. na filira A. Inserir o Pente na fileira A e misturar. Incubar a 37 C Abrir a fileira B Absorver o líquido residual do Pente Inserir o Pente e agitar na fileira B. Incubar Após misturar/agitar e incubar nas fileiras C, D E. Reação de cor na fileira F 9 10 Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HAV IgM. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo) 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Pré-diluir 10 μl de cada amostra ou controle misturando com 490 μl de diluente de amostra. 3. Dispensar 25 μl de cada amostra ou controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento do Teste 1 Etapa Fileira Proceder como a seguir Captura de anticorpo A Misturar; incubar 2 horas a 37ºC; absorver Lavagem B Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Reação antígeno-anticorpo C Misturar; incubar 30 minutos a 37ºC; absorver. Ligação do conjugado D Agitar; incubar 20 minutos a 37ºC; absorver. Lavagem E Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar 10 minutos a 37ºC. Reação de parada E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando o /B9/OR 5