CMV IgM. Somente para Uso Diagnóstico in vitro. Uso Pretendido. Introdução. Conteúdo do Kit. Princípio do Teste
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- Jónatas Aragão Santiago
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1 CMV IgM B Cada dente está sensibilizado em duas posições: Ponto superior IgM humano ( Interno) Ponto inferior antígenos CMV inativados A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são pré-tratadas com anti-igg humano (absorvente), para prevenir interferências como resultado de competição por IgG anti-cmv e pelo fator reumatóide. As amostras pré-tratadas são então incubadas nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos IgM anti-cmv, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos de CMV no ponto inferior dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgM capturados nos pontos Inferiores dos dentes, e a IgM humana dos pontos superiores ( Interno) reagirão com anticorpos anti-igm humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras (C e D), os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Formação do complexo antígeno CMV anticorpo; 30 min IgM* Código: Somente para Uso Diagnóstico in vitro Formato: 3 x 12 testes Uso Pretendido O kit ImmunoComb II CMV IgM é um teste EIA rápido para a detecção qualitativa de anticorpos IgM para o citomegalovírus (CMV), em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Conjugado anti-igm Humano Substrato cromogenico Figura 1. Princípio do Teste Ligação do conjugado anti-igm Humano; 20 min Reação enzimática colorida,10 min; *Após absorção de IgG Introdução O Citomegalovírus é um membro da família Herpesviridae. Ele é um vírus com altas taxas de infecção durante os primeiros anos de vida. Pelo menos 80% da população adulta, pelo mundo todo, apresenta anticorpos contra o CMV. A infecção pelo CMV pode ser adquirida através de infecção congênita, no momento do nascimento, ou mais tarde através de transmissão por transfusão sanguínea, derivados do sangue, saliva e outros fluidos corporais. A infecção por Citomegalovirus é principalmente assintomática. Entretanto, ocasionalmente podem ocorrer febre persistente, pneumonite, enterite, mononucleose e hepatite. Em duas circunstâncias a infecção por CMV pode causar complicações severas, por exemplo, na infecção primária durante o início da gravidez, levando a anormalidades congênitas no feto; e na infecção em pacientes imunodeficientes, como os receptores de órgãos ou de transplantes de medula óssea e portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Em pacientes transplantados, o CMV é a causa mais comum de mortalidade por infecção. Nos pacientes com AIDS, as doenças comumente induzidas por CMV afetam os pulmões, intestinos e sistema nervoso central. Uma complicação séria, a retinite, pode causar cegueira. A determinação de anticorpos IgM anti-cmv permite o diagnóstico efetivo de infecção por CMV aguda ou recente. O teste é particularmente útil no acompanhamento de mulheres grávidas que não foram expostas previamente ao CMV e, conseqüentemente, não estão protegidas contra o vírus. Adicionalmente, a determinação de anticorpos IgM específicos em recém-nascidos é útil para o diagnóstico da infecção congênita por CMV. Princípio do Teste O teste ImmunoComb II CMV IgM é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). O kit inclui um Positivo (IgM anti-cmv) e um Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto inferior bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior IgM humana ( Interno) Ponto inferior antígenos de CMV inativados Figura 2. Pente ImmunoComb II Interno Antígenos CMV Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio /B8/OR 1
2 Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra, contendo anticorpos de cabra para IgG humana Anticorpos anti-igm humana, marcados com fosfatase alcalina Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 25 μl e 100 μl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou placas de microtitulação. Figura 3. Placa Reveladora Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,4 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, contendo anticorpos IgM anti-cmv. Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,4 ml de plasma humano reconstituído, diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para CMV. Solução de absorção 1 frasco contendo 4 ml de anticorpos de cabra diluído para IgG humana. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental para laboratório. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma humano. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes*, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. * A menos que sejam armazenados para documentação posterior. Armazenamento e Estabilidade do kit O kit é fornecido de 2-8 ºC. Durante o transporte o kit pode ser conservado a 30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas. Os controles internos indicam que o kit não sofreu danos durante o transporte. Armazenar os componentes na embalagem original de 2-8ºC. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados de 2-8ºC. O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado de 2-8ºC. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser utilizados mais do que três vezes. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, Pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar em temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando indicado, nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 61 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (n 0 de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Quebrando o Pente /B8/OR 2
3 Instruções do Teste Pré-tratamento das Amostras e s 1. Para cada amostra e controle dispensar 100 μl de solução de absorção em um microtubo ou cavidade de microtitulação. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 25 μl da amostra ou do Positivo ou Negativo fornecido com o kit. Misturar enchendo e esvaziando a ponteira com a solução repetidamente. 3. Ajustar o cronômetro e incubar por 10 minutos. Adicionando as Amostras Pré-tratadas à Placa Reveladora 4. Pipetar 25 μl da amostra pré-tratada. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando a ponteira com a solução repetidamente. Descartar a ponteira. 5. Repetir o passo 4 para as outras amostras pré-tratadas e para os dois controles pré-tratados. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira da pipeta para cada amostra ou controle. 6. Ajustar o cronômetro e incubar por 10 minutos. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 7. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Depois de 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 7c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 7a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 8. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 11. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 12. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 13. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2-8 ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Negativo deve produzir um ponto superior ( interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior ( interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Positivo Negativo Resultados Invàlidos Figura 5. Validação dos testes Interpretação Qualitativa dos Resultados Interpretação Visual Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do controle positivo (Figura 6). Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos anti-igm para CMV na amostra. Nenhum ponto ou um ponto com coloração menos intensa que o controle positivo indica a ausência de anticorpos IgM anti-cmv na amostra (resultado negativo). Resultado Negativo Figura 6. Resultados Positivo Presença de anticorpos IgM para CMV Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Algumas dificuldades na interpretação dos resultados podem ser observadas nos seguintes casos: Pode ser infecção primária sem a presença de anticorpos IgM detectáveis. Anticorpos IgM podem persistir por um longo tempo e indicar reativação imunológica ligada a reinfecção. Algumas dificuldades podem também ser observadas em recém-nascidos, pacientes imunodeficientes ou em casos de transfusão sanguínea. A infecção por EBV pode causar reativação de anticorpos IgM. Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II CMV IgM foram avaliadas em vários laboratórios de referência, num total de 498 amostras em comparação com ensaios EIA de referência. Os resultados estão resumidos na tabela /B8/OR 3
4 Tabela 1. Resultados dos testes Ensaios de Referência ImmunoComb II CMV IgM Positivo Negativo Positivo Negativo Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 98,8% Especificidade 98,2% Repetibilidade 10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de partes de um lote de produção. Um soro positivo para IgM anti-cmv foi testado 12 vezes em cada pente e os resultados foram interpretados visualmente. Em todos os casos foi detectada a amostra positiva. Reprodutibilidade Duas amostras positivas para anti-cmv IgM foram testadas em pentes retirados de 3 lotes diferentes de produção. Os resultados foram interpretados visualmente. Em todos os casos foi detectado as amostras positivas. Reação Cruzada A reação cruzada encontrada foi insignificante com amostras positivas de anti-citomegalovírus IgG. A reação cruzada com amostras positivas de outras infecções herpesviridae como Varicella zoster, EBV, ANA e HSV foi considerada insignificante. Leve interferência de soro de mulheres grávidas e pacientes com fator reumatóide positivo não podem ser excluidas Interferência Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina até 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol até 281,6 mg/dl); triglicérides (até 381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (até 20 mg/dl). * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Beneke JS, Tegtmeier GE, Alter HJ, Luetgemeyer RB, Solomon R, Bayer WL., Relation of titers of antibodies to CMV in blood donors to the transmission of cytomegalovirus infection. J Infect Dis 150: Corey L Herpesviruses, In: Sherris JC, ed. Medical Microbiology, An Introduction to Infectious Diseases. Elsevier, New York, pp Doerr HW, Braun R, Munk K Human cytomegalovirus infection: recent developments in diagnosis and epidemiology. Klin Wochenschr 63: Edmond EE, Hart HF Diagnosis of cytomegalovirus infection. In: Young H, McMillan A, eds. Immunological Diagnosis of Sexually Transmitted Diseases. Marcel Dekker, New York, pp Forbes BA Acquisition of cytomegalovirus infection: an update. Clin Microbiol Rev 2: Hodinka RL, Friedman HM Human cytomegalovirus. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp Rasmussen L, Kelsail D, Nelson R, Carney W, Hirsh M, Winston D, Preiksaitis J, Merigan TC Virus-specific IgG and IgM antibodies in normal and immunosuppressed subjects infected with cytomegalovirus. J Infect Dis 145: Version: /B8/OR (05/2010) Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) astec@prodimol.com.br Registro ANVISA nº Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo Soares - CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B8/OR (05/2010) /B8/OR 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 horas à temperatura ambiente ou 20 minutos a 37 C Aspirar e pré-tratar Adicionar amostras e Remover o Pente da amostras e controles controles pré-tratados embalagem. na filira A. Misturar e incubar Inserir o Pente na fileira A e misturar. Incubar Abrir a fileira B Absorver o líquido residual do Pente Inserir o Pente e agitar na fileira B. Incubar Após misturar/agitar e incubar nas fileiras C, D e E. Reação de cor na fileira F 9 10 Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II CMV IgM. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. 2. Pré-tratar 25 μl de cada amostra ou controle misturando com 100 μl de solução de absorção e incubando por 10 minutos. 3. Dispensar 25 μl de cada amostra ou controle pré-tratados nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. Agitar e incubar por 10 minutos. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento do Teste. 1 Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 30 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando o Pente /B8/OR 5
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