HCV. Figura 1. Princípio do Teste
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- Vagner Cavalheiro de Santarém
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1 P Princípio do Teste O teste ImmunoComb II HCV é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado em três posições: Ponto superior imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto central antígenos de core para HCV Ponto inferior antígenos não estruturais para HCV HCV A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Para iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-hcv, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos HCV nos pontos inferior e central dos dentes do Pente (figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, o IgG anti-hcv capturado nos pontos inferiores e centrais dos dentes, e a imunoglobulina humana dos pontos superiores (Controle Interno) reagirão com anticorpos anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Código: Versão: 455/P8 Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb II HCV é um teste rápido para a detecção qualitativa de anticorpos IgG para o vírus da hepatite C (HCV), em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O vírus da hepatite C foi identificado em 1989 como o agente etiológico da hepatite pós-transfusional não-a, não-b. O vírus é composto de um genoma de 10 Kb de RNA monolinear, protegido por um nucleocapsídeo e envolvido em uma membrana de lipoproteína. O genoma do HCV codifica as proteínas estruturais (core e envelope) e proteínas não-estruturais (de NS2 até NS5). Baseado nas suas características morfológicas e na sua estrutura, o vírus foi classificado como membro da família Flaviviridae. A transmissão do HCV ocorre predominantemente por via parenteral, principalmente como resultado de transfusão de sangue, exposição ao sangue e seus derivados ou contato acidental com equipamento médico contaminado. Estudos recentes indicam a possibilidade da transmissão sexual ser uma maneira adicional e potencial de disseminação. As taxas de soroprevalência entre as populações de risco variam entre 0,18 0,8% em doadores de sangue e 9% em pacientes de diálise, a 50% em usuários de drogas intravenosas e 70% em hemofílicos. A infecção por HCV consiste geralmente de um período de incubação de 5 a 12 semanas, seguido por uma doença aguda leve ou assintomática, parecida com os sintomas de infecção aguda por hepatite A ou B. Até 50% dos casos de infecção aguda progridem rapidamente para doença crônica. As manifestações clínicas da infecção crônica por HCV são geralmente leves e limitadas a astenia. Entretanto, a doença pode finalmente levar a cirrose e hepatocarcinoma. Por muito tempo o diagnóstico do HCV foi baseado na presença de níveis elevados de alanina amino transaminase (ALT), persistente por pelo menos 6 meses e na ausência de outras causas de citólise crônica. A identificação do vírus da hepatite C como o agente etiológico facilitou o diagnóstico por métodos tais como imunoensaios ou reação de polimerase em cadeia (PCR). O kit ImmunoComb II HCV é um ensaio Elisa rápido e sensível para a detecção diferencial de anticorpos anti-hcv contra proteínas virais estruturais e não-estruturais. É uma ferramenta útil para o diagnóstico rápido de indivíduos com suspeita de HCV, assim como para a triagem em bancos de sangue. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-hcv) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 3 pontos cinza azulados e o dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar apenas o ponto superior. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com três áreas reativas: Ponto superior imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto central antígenos de core HCV Ponto inferior antígenos não estruturais HCV (NS3, NS4 e NS5) Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras 455/P8 1
2 O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Anticorpos de cabra anti-igg humano, marcados com fosfatase alcalina Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, placas reveladoras, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Agitar a Placa Reveladora vigorosamente antes de cada ensaio. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,75 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, positivo para anticorpos anti-hcv. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,75 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos anti-hcv. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Embora tenha sido inativado, trabalhar o controle positivo como potencialmente infeccioso. Todos os materiais de origem humana usados na preparação dos controles foram testados e considerados não reativos para os antígenos de superfície da hepatite B, anticorpos para HIV e anticorpos para o vírus da hepatite C. Como nenhum método pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de C. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação de Amostras Tanto soro como plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 50 µl. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O pente e a placa reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para utilização de parte do pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 55 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 50 µl de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar vigorosamente a amostra enchendo e esvaziando a solução por pelo menos seis vezes. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um Controle Positivo e um Negativo fornecidos com o kit. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: Inserir e retirar o Pente das cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 10 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Agitar periodicamente durante a incubação inserindo e retirando o pente das cavidades. Próximo ao final dos 10 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 10 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 455/P8 2
3 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Depois de 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 3a. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Agitar como no passo 3b. Agitar periodicamente durante a incubação. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 10 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Enquanto isso, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras de pipetas, papel absorvente e luvas usadas, como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, poderão ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2-8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o correto funcionamento do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir três pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle interno) e nenhum outro ponto. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Figura 5. Validação dos testes. Interpretação dos Resultados O aparecimento do ponto superior isolado (Controle Interno) indica que a amostra não é reativa para anticorpos para HCV (Figura 6a). Um ponto circular central e/ ou inferior indica a presença de anticorpos para antígeno de core HCV e/ ou proteínas NS3, NS4 e NS5 respectivamente (Figura 6b). Figura 6. Resultado dos Testes Importante: Qualquer ponto inferior com coloração fraca (NS) deve ser considerado como suspeito para uma reação positiva e deve ser investigado posteriormente. Qualquer ponto central com coloração fraca (Core) deve ser considerado como suspeito para uma reação negativa. É altamente recomendável retestar. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações O kit ImmunoComb II HCV é um teste de triagem. A presença de anticorpos para HCV na amostra testada deve ser confirmada por um ensaio confirmatório. Uma vez que a produção de anticorpos para HCV pode ser retardada, a não reatividade com este teste não deve ser considerado como evidência conclusiva que o paciente não tenha sido exposto ou infectado pelo HCV. Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II HCV foram avaliadas em um painel de 1000 amostras de soro, comparando-se com um ensaio EIA de referência. Os resultados discordantes foram retestados duas vezes pelos dois ensaios, teste confirmatório e, quando possível, pelo RIBA 3.0 ORTHO. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Quantificação dos Resultados no Equipamento Ensaio de ImmunoComb II HCV Referência Positivo Negativo Positivo Negativo 5** 795 ** As cinco amostras discrepantes foram testadas pelo RIBA e confirmadas como negativas. Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 100% Especificidade 99,4% * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Choo Q-L, et al Isolation of a cdna clone derived from a blood-born non-a non-b viral hepatitis genome. Science 244: Chung HT, Lee JSK, Lok ASF Prevention of posttransfusional hepatitis B by screening for antibody to hepatitis C virus and antibody to HBcAg. Hepatology 18: Claeys H, Volckaerts A, De Beenhouwer H, Vermylen C Association of hepatitis C virus with the occurrence of hepatitis C virus core antibodies. J Med Virol 36: Cuthbert, JA Hepatitis C: Progress and Problems. Clin Microbiol Ver 7: Herrera JL Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J 87: Hollinger FB Non-A, non-b hepatitis viruses. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB, Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York. Pp /P8 3
4 Kuo G, et al An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-a non-b hepatitis. Science 244: Liang TJ, et al Viral pathogenisis of hepathocellular carcinoma in the United States. Hepatology 18: Swenson PD Hepatitis viruses. In: Manual of Clinical Microbiology (Balows A, Hausler WJ, Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds.) Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. Pp Wiber C Development and use of laboratory tests for hepatitis C infection: A Review. J Clin Immunoassay 16: Yoshikawa A et al Serodiagnosis of hepatitis C virus infection by ELISA for antibodies against the putative core protein (p20c) expressed in Escherichia coli. J Immunol Meth 148: Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m 455/P8 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HCV. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo) 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste em temperatura de 22 26ºC. 2. Dispensar 50 µl de cada amostra e controle nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 3. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela Durante as incubações nas cavidades A e C, retirar e inserir o Pente periodicamente. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste. Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 10 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 10 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. 455/E8 5
HCV. Princípio do Teste. Somente para Uso Diagnóstico in vitro. Uso Pretendido. Introdução. Conteúdo do Kit
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