Anti-HBs. Figura 1. Princípio do Teste

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1 P Princípio do Teste O teste ImmunoComb II Anti-HBs é um ensaio imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio de duplo reconhecimento. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior soro albumina bovina biotinilada ( Interno). Ponto inferior HbsAg recombinante. Anti-HBs A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Para iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-hbs, se presentes na amostra, irão ligar-se ao HbsAg no ponto inferior dos dentes do Pente (figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os anticorpos anti-hbs capturados nos pontos Inferiores dos dentes reagirão com o HbsAg biotinilado. Na fileira D, o complexo antígeno biotinilado / anticorpo nos pontos inferiores dos dentes, e a soro albumina bovina biotinilada nos pontos superiores ( Interno), reagirão com estreptavidina marcada com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, componentes não ligados serão removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície dos dentes do Pente. Código: Versão: 453/P7 Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb II Anti-HBs é um teste para a detecção quantitativa de anticorpos para o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HbsAg) em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O vírus da hepatite B (HBV) pertence a uma nova família de vírus de DNA, chamada Hepadnaviridae. Ele apresenta um hepatotropismo evidente e um único meio de replicação através do mecanismo de transcrição reversa. O viríon completo ou partícula de Dane, consiste em uma molécula de DNA circular protegida por um capsídeo nuclear / antígeno de core (HBcAg), e envolvido por uma lipoproteína de envelope, que é o antígeno de superfície (HBsAg). O HBsAg também é encontrado no soro como partículas ou filamentos esféricos, incompletos e não infecciosos. Um pequeno componente do nucleocapsídeo do HBV, o antígeno HBe (HBeAg), também é detectável no sangue durante a fase replicativa do vírus. O vírus da hepatite B é um vírus amplamente presente, com distribuição global. As principais vias de transmissão do vírus são: horizontal, através de contaminação sexual ou parenteral; e vertical, com a transmissão pré-natal da mãe infectada para o feto. As conseqüências clínicas da infecção por HBV variam de totalmente imperceptíveis (70% dos casos) a hepatite aguda com icterícia. A maioria dos pacientes se recupera totalmente dentro de seis meses após o início da doença. Uma pequena proporção da população infectada (< 1,5%) pode desenvolver hepatite fulminante, freqüentemente com resultado fatal. Em uma proporção substancial (até 10%) dos pacientes adultos, o HBV pode persistir, progredindo eventualmente para hepatite crônica com desenvolvimento de cirrose e hepatocarcinoma. Os portadores de hepatite B crônica (200 milhões ao redor do mundo) formam o principal reservatório do vírus e contribuem para a disseminação da doença. Os anticorpos para HbsAg (anti-hbs) são os principais anticorpos para neutralizar o HBV, que geralmente persistem pela vida inteira e protegem contra reinfecção. O nível de anti-hbs, entretanto, serve como indicador para avaliar a recuperação da infecção por HBV, ou o sucesso da vacinação usando partículas de HbsAg. Concentrações de anticorpos 10 UI/L indicam imunidade ao HBV. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um (anti-hbs) e um, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Materiais Fornecidos Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior soro albumina bovina biotinilada ( Interno). Ponto inferior HbsAg recombinante. Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. 453/P7 1

2 Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Solução de lavagem HbsAg biotinilado Estreptavidina marcada com fosfatase alcalina Solução de lavagem Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora 1 frasco (tampa vermelha) de 1,5 ml de plasma humano inativado pelo calor, diluído para um nível de cutoff de 10 UI/mL para anti-hbs. 1 frasco (tampa verde) de 1,5 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-hbs. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Combscale TM para leitura dos resultados. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a tampa de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 53 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para HbsAg, anticorpos para o vírus hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação de Amostras Tanto o soro como o plasma podem ser tesdados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a 37 0 C. Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Nota: Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem devem ser realizadas à temperatura ambiente (22 26ºC). Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 100 µl de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um e um fornecidos no kit. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Inserir e retirar o Pente das cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 120 minutos a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Misturar um tempo adicional de 3 vezes (cada 30 minutos) durante a incubação. Próximo ao final dos 120 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 120 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do HbsAg biotinilado (fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 3a. Incubar a Placa Reveladora com o pente por /P7 2

3 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira D. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 30 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Ligação da Estreptavidina/ Fosfatase Alcalina (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 20 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 10 minutos exatos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, papel absorvente e luvas usadas, como lixo bioinfectante. Resultado Figura 6. Resultado dos Testes Amostra Anti-HBs a um título de 10 UI/L Interpretação Semi Quantitativa pela Leitura Visual O nível de anti-hbs em cada amostra pode ser avaliado pela comparação entre a intensidade da cor do ponto inferior de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecida no kit. Esta comparação se dá como a seguir: (Figura 7) 1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente de sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala de cores. Ajustar a régua de modo que 10; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Encontrar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade de cor similar da escala. Registrar o valor que aparecer na janela acima desta intensidade como o título aproximado de anti-hbs para a amostra correspondente. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2 8ºC. Calibrar o CombScale Orgenics CombScale ANTI-HBs IU/L C+ Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5): 1. O deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O deve produzir um ponto superior ( interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior ( interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Figura 5. Validação dos testes Resultados Inválidos Leitura e Interpretação dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do (Figura 6). Um ponto com intensidade maior ou igual a do indica a presença de anti-hbs a um título 10 UI/L. Um ponto com intensidade menor que a do controle positivo é considerado como resultado negativo. Figura 7. CombScale Leitura no Equipamento O refletômetro CombScan TM (ver o Manual do Usuário do CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, designando a leitura do ponto inferior digitando 1 quando aparecer a mensagem pontos: 1,2,3 na tela. Converter as unidades de absorbância relativas obtidas em valores de títulos para anti-hbs, de acordo com a Tabela 1. Tabela 1. Conversão de leituras de absorbância relativa para títulos. Absorbância Relativa Título (UI/L)* < 693 < * Baseado na calibração utilizando o soro padrão de referência 26/1/77 da OMS. Interpretação Títulos maiores ou iguais a 10 UI/L são considerados positivos, representando os níveis mínimos de anticorpos necessários para proteção imune contra infecção por HBV. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. 453/P7 3

4 Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II anti- HBs foram avaliadas em um painel de 170 amostras de soro, em comparação com dois ensaios EIA de referência. Os resultados estão resumidos na Tabela 2. Tabela 2. Resultados dos testes Ensaio de ImmunoComb II anti-hbs Referência Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 100% Especificidade 98.3% P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Follet EAC Diagnosis of hepatitis B infection. In: Hugh Y Mc Millan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. Pgs Herrera FB Hepatitis B vírus. In: Voral Hepatitis (Hollinger FB, Percel RH, Robinsons WS, Gerin JL Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp Kiyasu PK, Caldwell SH Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Méd Sci 306: Krugman S. Overby LR, Mushavar IK, Ling C-M, Frosner GG, Deinhart F Viral hepatitis, type B: studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J. Méd 300: Ogra PL, Beutner KR, Hepatitis viruses. In: Milgrom F. Abeyounis CJ, Kano K. eds. Principles of immunological diagnosis in medicine. Lea & Febiger, Philadelphia, pp Robinson WS Hepadnavindae and their replication. In: Viral hepatitis (hollinger FB, Purcell, RHRobinson WS, Gerin JL. Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp Swenson PD Hepatitis viruses. In: Balows A. Hauster WJ. Hemmann KL, Isenberg HD. Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC 453/P7 4

5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II anti-hbs. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo) 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Dispensar 100 µl de cada amostra e controle nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 3. Colocar o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 2 horas a 37ºC; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação de HbsAg biotinilado C Misturar; incubar por 30 minutos a 37 o C; absorver. Ligação de estreptavidina/ D Misturar; incubar por 20 minutos a 37 o C; fosfatase alcalina absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. 453/P6 5