HBsAg 90. Figura 1. Princípio do Teste
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- Leonor Nathalia Amaro Galvão
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1 P Princípio do Teste O teste ImmunoComb II HBsAg é um ensaio imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio sanduíche. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior soro albumina bovina biotinilado (Controle Interno). Ponto inferior anticorpos monoclonais para HbsAg. HBsAg 90 A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades. As fileiras de B-F contêm reagentes necessários para o ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Para iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são adicionados nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. Seguindo esta etapa, adicionar 20 µl de diluente de amostra nas cavidades da fileira A. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. O HBsAg, se presente na amostra, será capturado pelos anticorpos anti-hbs no ponto inferior dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, o HBsAg capturado nos dentes reagirá com anticorpos anti-hbs biotinilados. Na fileira D, o complexo anticorpo / antígeno biotinilado nos pontos inferiores dos dentes, e a soro albumina bovina biotinilada dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com avidina marcada com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados serão removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Código: Versão: 454/P5 Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb II HBsAg 90 é um teste para a determinação qualitativa do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HbsAg) em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O vírus da hepatite B (HBV) pertence a uma nova família de vírus de DNA, chamada Hepadnaviridae. Ele apresenta um hepatotropismo evidente e um único meio de replicação através do mecanismo de transcrição reversa. O viríon completo ou partícula de Dane, consiste em uma molécula de DNA circular protegida por um capsídeo nuclear / antígeno de core (HBcAg), e envolvido por uma lipoproteína de envelope, que é o antígeno de superfície (HBsAg). O HBsAg também é encontrado no soro como partículas ou filamentos esféricos, incompletos e não infecciosos. Um pequeno componente do nucleocapsídeo do HBV, o antígeno HBe (HBeAg), também é detectável no sangue durante a fase replicativa do vírus. O vírus da hepatite B é um vírus amplamente presente, com distribuição global. As principais vias de transmissão do vírus são: horizontal, através de contaminação sexual ou parenteral; e vertical, com a transmissão pré-natal da mãe infectada para o feto. As conseqüências clínicas da infecção por HBV variam de totalmente imperceptíveis (70% dos casos) a hepatite aguda com icterícia. A maioria dos pacientes se recupera totalmente dentro de seis meses após o início da doença. Uma pequena proporção da população infectada (< 1,5%) pode desenvolver hepatite fulminante, freqüentemente com resultado fatal. Em uma proporção substancial (até 10%) dos pacientes adultos, o HBV pode persistir, progredindo eventualmente para hepatite crônica com desenvolvimento de cirrose e hepatocarcinoma. Os portadores de hepatite B crônica (200 milhões ao redor do mundo) formam o principal reservatório do vírus e contribuem para a disseminação da doença. Em um caso típico de infecção aguda por HBV, o HBsAg, freqüentemente acompanhado por HBeAg, aparece no sangue entre 2 e 6 semanas antes da manifestação dos sintomas ou evidência bioquímica da hepatite e, atinge o nível máximo durante a fase aguda da doença. A persistência de HBsAg no soro por mais de 6 meses reflete o estado crônico do hospedeiro do HBV. Portanto, a triagem para HBsAg permite a identificação de pacientes infectados com HBV e auxilia no diagnóstico e prognóstico da doença. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (HBsAg) e um Controle Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar somente um ponto superior. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior soro albumina bovina biotinilado (Controle Interno). Ponto inferior anticorpos monoclonais para HbsAg. Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras 454/P5 1
2 O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste, exceto a fileira A. Um frasco contendo diluente de amostra, que é fornecido com o kit, é imediatamente adicionado na fileira A antes do uso. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Vazia Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Solução de lavagem Anticorpo de cabra biotinilado para HBsAg Avidina modificada conjugada a fosfatase alcalina Solução de lavagem Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Preparando o Teste Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando indicado nas instruções de uso. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 54 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 1,5 ml de plasma humano diluído inativado pelo calor, negativo para HbsAg, enriquecido com 50 ng/ml de HBsAg recombinante. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 1,5 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para HBsAg. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Diluente de Amostra 1 frasco (tampa branca) de 2 ml de diluente de amostra. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para HBsAg, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2-8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação de Amostras Tanto o soro com plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 100 µl e 20 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Figura 4. Quebrando o Pente Preparando os Componentes Incubar o diluente de amostra, Solução Controle Positivo, Solução Controle Negativo e as amostras a serem testadas a 37ºC por 15 minutos. Instruções do Teste Nota: Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem devem ser realizadas à temperatura ambiente (22 26ºC). O protocolo descrito abaixo resulta em um limite de detecção de 0.4 a 0.5 ng/ml. Captura do Antígeno (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 100 µl de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Adicionar nesta cavidade 20 µl de diluente de amostra e misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um Controle Positivo e um Controle Negativo fornecido no kit. 3. Para bons resultados: Incubar a Placa Reveladora com as amostras e o diluente por um tempo adicional de 15 minutos a 37ºC. 4. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Incubar o Pente na fileira A por 60 minutos a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Após 30 minutos de incubação misturar como na etapa 4a. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Próximo ao final dos 60 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 60 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir o Pente vigorosamente nas cavidades e deixar pelo 454/P5 2
3 menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 4c. Ligação do anti-hbs biotinilado (Fileira C) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 4a. Incubar a Placa Reveladora com o pente por 10 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar a cobertura da fileira D. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 10 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Ligação de Avidina modificada/fosfatase Alcalina (Fileira D) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 5 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 5 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira E) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 10 minutos exatos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 10. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, papel absorvente e luvas usadas, como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso a caixa original do kit. Armazenar de 2-8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Positivo Controle Negativo Figura 5. Validação dos testes. Resultados Inválidos Interpretação dos Resultados Qualquer ponto inferior no dente de uma amostra é considerado como resultado positivo, sendo irrelevante sua intensidade. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Resultados positivos do teste ImmunoComb II HbsAg 90 indicarão a presença de antígeno de superfície da hepatite B. Entretanto, como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb II HbsAg 90 foram avaliadas em 203 amostras séricas, em comparação com o sistema Axsym Abbott como ensaio de referência. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resultados dos testes Ensaio de ImmunoComb II HbsAg 90 Referência Positivo Negativo Positivo Negativo 0 90 As seguintes características agregadas ao desempenho foram calculadas:: Sensibilidade 99% Especificidade 100% * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Follet EAC Diagnosis of hepatitis B infection. In: Hugh Y Mc Millan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. Pgs Herrera JL Serological Diagnosis of viral hapatitis. S Med J:87: Hollinger FB Hepatits B vírus. In: Viral Hepatitis (Hollinger FB, Purcel RH, Robinson WS, Gerin JL. Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp Kiyasu PK, Caldwell SH Diagnosis and treatment of the major hepatotropic viruses. Am J Méd Sci 306: Krugman S. Overby LR, Mushavar IK, Ling C-M, Frosner GG, Deinhart F Viral hepatitis, type B: studies on natural history and prevention re-examined. N Engl J. Méd 300: Ogra PL, Beutner KR, Hepatitis viruses. In: Milgrom F. Abeyounis CJ, Kano K. eds. Principles of immunological diagnosis in medicine. Lea & Febiger, Philadelphia, pp Robinson WS Hepadnavindae and their replication. In: Viral hepatitis (Hollinger FB, Purcell, RHRobinson WS, Gerin JL. Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp Swenson PD Hepatitis viruses. In: Balows A. Hauster WJ. Hemmann KL, Isenberg HD. Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC 454/P5 3
4 P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m 454/P5 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HbsAg 90. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo) 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Dispensar 100 µl de cada amostra e controle nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 3. Adicionar 20 µl de diluente de amostra nas cavidades da fileira A e misturar. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Captura de Antígeno A Misturar; incubar por 60 minutos a 37ºC (misturar após 30 minutos); absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação de anti-hbs biotinilado C Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC; absorver. Ligação da avidina modificada / D Misturar; incubar por 5 minutos a 37ºC; absorver. fosfatase alcalina Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação da cor F Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC. Reação de parada E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre 451/P9 5
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