Toxo IgM. Princípio do Teste. Procedimento. Introdução. Conteúdo do Kit

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1 Toxo IgM B Princípio do Teste O teste ImmunoComb Toxo IgM é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior IgM humana (Controle Interno). Ponto inferior Antígenos de Toxoplasmose inativados. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prétratadas com anti-igg humana (absorvente), para previnir interferencias como um resultado da competição pela IgG anti-toxo e pelo fator reumatóide. As amostras pré-tratadas são posteriormente incubadas com a solução nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O pente é então inserido nas cavidades da fileira A. A anti-toxo IgM, se presente nas amostras, irá ligar-se especificamente aos antígenos de Toxoplasmose nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, as IgM anti-toxo capturadas nos pontos inferiores dos dentes, e a IgM humana dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com anticorpos anti-igm humanos marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. IgM* anti-toxo Formação do complexo antígeno Toxo IgM; 20 min Código: Formato: 3 x 12 testes conjugado anti IgM humano Ligação do conjugado Anti-IgM humano 20 min Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Procedimento O kit ImmunoComb Toxo IgM é um teste para a determinação qualitativa de anticorpos IgM para Toxoplasma gondii em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com o kit. Substrato cromogênico Figura 1. Princípio do Teste Reação enzimática de cor ; 10 min *Após absorção de IgG Introdução A Toxoplasmose é uma doença sistêmica causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. Este parasita está disseminado e é capaz de infectar várias espécies de mamíferos com altas taxas de ocorrências particularmente, nos trópicos, e baixas taxas em regiões frias e áridas. Estudos sorológicos tem indicado incidências de infecções por toxoplasmose com variação de menos de 1% em adultos jovens em algumas áreas, e 90% para pessoas idosas em outros locais. As maiores rotas de transmissão para o homem sãoa a congênita e a oral, através da ingestão de alimentos contaminados. A transmissão entre pessoas por derivados de sangue contaminado ou transplante de tecidos é menos frequente, mais de maior importância clínica. A manifestação clínica mais comum da infecção é uma linfoadenopatia febril autolimitada, progredindo subclinicamente ou somente com manifestações clínicas moderadas em adultos sadios. Entretanto, a infecção em pacientes imunocomprometidos e no feto em desenvolvimento pode levar a consequências muito severas. A infecção oportunista por toxoplasmose ou reativação de uma infecção subclínica em pacientes imunocomprometidos pode causar encefalite, penumonite e miocardite, frequentemente com resultado letal. No feto infectado congenitamente, a infecção pode se propagar pelo sistema nervoso central. As consequências incluem aborto e natimorto quando a infecção acontece durante o primeiro trimestre da gravidez e danos neurológicos irreversíveis nos casos de infecção durante o segundo e terceiro trimestre. Níveis significantes de anticorpos IgM anti-toxo geralmente não persistem por mais de 1 ano após infecção primária e não são observados na reativação. Entretanto, a determinação qualitativa de anticorpos IgM para T.gondii, fornece uma rápida confirmação de uma infecção aguda ou recente. Além disso, a pesquisa de anticorpos IgM e IgG anti-t.gondii em recém nascidos, concomitante com o teste para IgG anti-t.gondii materno, permite o diagnóstico precoce da toxoplasmose congênita. O kit inclui um Controle (IgM anti-toxo) e um Controle para serem inserídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle deve mostrar 2 pontos cinzaazulados. O dente utilizado com o Controle deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior, ou um ponto bem fraco. O ponto superior deve aparecer também em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior IgM humana (Controle Interno). Ponto inferior Antígenos de T.gondii RH inativados. Figura 2. Pente ImmunoComb Controle Interno Antígenos T. gondii Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante /B12/OR 1

2 Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra, contendo anticorpos de cabra anti-igg humana Fileira B Solução de lavagem Fileira C Anticorpos de cabra anti-igm humana marcados com fosfatase alcalina. Fileira D Solução de lavagem Fileira E Solução de lavagem Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazólio (NBT) As amostras podem ser armazenadas por 7 dias a 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a -20 ºC ou inferior. Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou cavidades de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os reagentes, Placas Reveladoras, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26º C. Figura 3. Placa Reveladora Controle 1 frasco (tampa vermelha) de 0.15 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, contendo anticorpos IgM anti- Toxo. Controle 1 frasco (tampa verde) de 0.15 ml de plasma humano reconstituído, diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para Toxoplasmose. Solução absorvente 1 frasco contendo 4 ml de anticorpos de cabra diluídos contra IgG humana. Perfurador para perfurar a folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não-reativos para o antígeno de superfície de hepatite B e para anticorpos para hepatite C e para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos de laboratório aceitos para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes (a menos que sejam guardados para documentação posterior), Placas Reveladoras e outros materiais usados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazenamento e Estabilidade do Kit Kit é fornecido a 2-8º C. Durante o transporte o kit pode suportar temperaturas de <30º C por curtos períodos de tempo, não excedendo no total 48 horas. Os controles internos indicam que o kit não foi danificado durante o transporte. Armazenar o kit na embalagem original a 2-8º C. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados a 2-8º C. A performance do kit após a primeira utilização é estável até à data de validade do mesmo, quando armazenados a 2-8º C. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser usados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos ou deixar à temperatura ambiente (22-26ºC) por 3 horas. Trazer todos os componentes reagentes (pentes, solução absorvente, controles e amostras) à temperatura ambiente. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas Instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 41 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a 2-8ºC para uso posterior. ImmunoComb Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-tratamento de Amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µl da solução absorvente em um microtubo ou cavidade de microtitulação. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µl de uma amostra ou do Controle ou Controle fornecido com o kit. Misturar aspirando e dispensando a solução repetidamente /B12/OR 2

3 3. Ajustar o cronômetro e incubar por 10 minutos. Adicionando as amostras pré-tratadas à Placa Reveladora 4. Pipetar 25 µl de uma amostra pré-tratada. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar aspirando e dispensando repetidamente a solução com a ponteira. Descartar a ponteira da pipeta. 5. Repetir o passo 4 para as outras amostras e os dois controles pré-tratados. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 6. Ajustar o cronômetro e incubar por 10 minutos. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 7. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Inserir e retirar o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por exatamente 20 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 20 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 20 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual das pontas dos dentes com papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira lavagem (Fileira B) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Inserir e retirar o Pente vigorosamente nas cavidades por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem correta. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 7c. Ligação de Conjugado (Fileira C) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 7a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda lavagem (Fileira D) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente por 2 minutos, como no passo 8. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 11. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 12. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos, retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 13. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não usada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva de forma que nada possa respingar de dentro delas, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, Controles, perfurador, diluente de amostra e instruções de uso à caixa original. Armazenar entre 2 8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle deve produzir um ponto superior (Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle Interno). Caso alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Figura 5. Validação dos testes. Interpretação Qualitativa dos Resultados interpretação Visual Comparar a intensidade do ponto inferior de cada dente de amostra com o ponto inferior do dente do Controle (Figura 6). Um ponto com intensidade maior ou igual à do controle positivo indica um resultado positivo para a amostra. Nenhum ponto ou um ponto com uma intensidade menor que o controle positivo indica a ausência de anticorpos IgM anti-toxo na amostra (resultado negativo). Resultado < Controle Figura 6. Resultado do Teste Controle Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser armazenados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados ao uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb Toxo IgM foram avaliadas em um painel de 160 amostras de soro, em comparação com um teste EIA de referência. Resultados discrepantes foram testados com um ensaio por imunofluorescência indireta e um teste de aglutinação. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resultados dos Testes Resultado Inválidos Amostra Positiva Presença de anticorpos IgM para T. gondii Teste de Referência ImmunoComb Toxo IgM ** ** Inclui uma amostra positiva no teste EIA mas negativa em ambos os outros testes. Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 93,3% Especificidade 100% *Dados detalhados estão disponíveis mediante solcitação Bibliografia Desmonts G Toxoplasmose acquise de la femme enceinte. Lyon Medical 248: Krogstadt DJ, Visvervara GS, Walls KW, Smith JW Blood and tissue protozoa. In: Lennette EH, Balows A, Hausler WJ, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp Remmington JS, Krahenbuthl JL Immunology of Toxoplasma gondii. In: Nahamias AJ, O Reily RJ, eds. Immunology of Human infection, Part II. Plenum, New York, pp /B12/OR 3

4 Fabricante: Version: /B12/OR (04/2010) Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) astec@prodimol.com.br Registro ANVISA nº Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo Soares - CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B12/OR (04/2010) /B12/OR 4

5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: Aspirar as amostras e Adicionar amostras e Remover o pente da 3 horas a temperatura ambiente ou controles para pré-tratamento. controles pré-tratados na embalagem. 20 min a 37 o C. fileira A. Misturar e Incubar. Inserir o Pente na fileira A e misturar. Incubar Abrir a fileira B. Absorver o líquido Inserir o Pente e agitar na residual do Pente. fileira B. Incubar. Após misturar/agitar & incubar nas fileiras C, D e E Reação de cor na fileira F Resultados. Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb Toxo IgM. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a 22-26ºC. Pré-tratar 10 µl de cada amostra e controle com 100 µl de solução absorvente. Incubar por 10 minutos. 2. Dispensar 25 µl de cada amostra e controle pré-tratados nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. Misturar e incubar por 10 minutos. 3. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste. 1 Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar 20 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Ligação do Conjugado C Misturar; incubar 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar 10 minutos. Reação de parada E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando o Pente /B12/OR 5