HIV 1&2 CombFirm. Introdução
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1 HIV 1&2 CombFirm B Os resultados dos testes do kit ImmunoComb II HIV1& 2 CombFirm são comparáveis àqueles obtidos por Western Blot. Ao invés da necessidade de realizar dois blots demorados, a reatividade para anticorpos para o ou 2 pode ser rapidamente confirmada em um único teste simples. Princípio do Teste O teste ImmunoComb II HIV1&2 CombFirm é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada pente tem seis pares de dentes, com seis pontos de antígenos por par (3 pontos em cada dente). O dente da esquerda de cada par traz um ponto superior sensibilizado com imunoglobulina humana (Controle Interno) e os dois marcadores proteicos p24 (gag) e p31 (pol). O dente da direita tem os pontos das três proteínas derivadas de env gp41, gp120 e gp36. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F), cada fileira contendo uma solução de reagente pronta para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente, nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-hiv, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos de HIV, no dente do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, o IgG anti-hiv capturado no dente e a imunoglobulina humana do ponto superior (Controle Interno), reagirão com anticorpos anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com os componentes cromogênicos. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Formação do complexo antígeno HIV-anticorpo; 30 min Código: Utilização "In Vitro" Formato:3 x 6 tests O kit ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm é um teste confirmatório. O teste permite confirmar uma amostra de soro ou plasma humano inicialmente reativo para HIV. Podem ser realizados dezoito testes com um kit. Introdução O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovírus, identificado em 1983 como o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Foram diferenciados dois tipos, e HIV-2, com prognóstico e porcentagem de transmissão diferentes. As principais vias de transmissão do vírus HIV são: contato sexual, contaminação pelo sangue ou produtos do sangue e transmissão da mãe para o recém-nascido. O HIV infecta predominantemente os linfócitos CD4, que desempenham um papel chave no sistema imune humano. A diminuição progressiva do nível de CD4 durante o desenvolvimento da doença leva a uma condição de imunocomprometimento, facilitando as infecções oportunistas, com conseqüências fatais. O vírus HIV é formado por uma molécula RNA genômica associada com a transcriptase reversa (RT), protegida por um capsídeo e um envelope. O envelope do vírus é o alvo principal para a resposta humoral de anticorpos. Conseqüentemente, os testes de triagem de HIV, altamente sensíveis, estão baseados primeiramente na detecção de anticorpos para antígenos derivados de componentes de envelope (env). Para diferenciar reações verdadeiras de falsas, um resultado positivo em um ensaio de triagem de HIV deve ser retestado e confirmado por um teste de maior especificidade. A confirmação sorológica de uma infecção por HIV, comumente realizada usando um ensaio de Western Blot, está baseada na detecção diferencial de anticorpos direcionados contra os antígenos do HIV. O teste ImmunoComb II HIV1&2 CombFirm emprega cinco diferentes antígenos, recombinantes e sintéticos de HIV para a determinação sorológica rápida do perfil de anticorpos HIV. Dois antígenos são proteínas derivadas de pol e de gag, reativas com os dois tipos de HIV, enquanto que três antígenos são proteínas ou peptídeos derivados do env, específicos tanto para como para HIV-2. Os antígenos estão posicionados separadamente, em concentrações fixas, e livres de antígenos tissulares, que podem contaminar as preparações de antígenos dos lisados virais, comumente usados nos Western Blots. Anticorpo Anti-HIV Conjugado anti-igg Humano Substrato cromogenico Figura 1. Princípio do Teste Ligação do conjugado anti-igg Humano, 20 min Reação enzimatica colorida,10 min O kit inclui um Controle (anticorpos para e HIV-2) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o par de dentes usado com o Controle deve mostrar todos os 6 pontos cinza azulados, e aquele usado com o Controle Negativo deve mostrar apenas o ponto do Controle Interno. O ponto do Controle Interno deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 6 pares de dentes, um par para cada teste (Figura 2). Os dois dentes do par tem números idênticos. Cada par de dentes está sensibilizado com seis áreas reativas: Posição No dente esquerdo No dente direito Superior Anticorpos anti- IgG humana Glicoproteína recombinante (Controle Interno) gp120 derivada de env. Central Proteína recombinante p24 Peptídeo sintético derivada de gag (específica derivado de glicoproteína para anti- & anti-hiv-2) transmembrana gp41 de Inferior Proteína recombinante p31 derivada de pol (específica para anti- & anti-hiv-2) env. Peptídeo sintético derivado de glicoproteína transmembrana gp36 de env HIV /B12/OR 1
2 ImmunoComb II Controle Interno p24 Figure 2. Pente p31 gp120 gp41 gp36 Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F). A fileira A está dividida em 6 cavidades, enquanto as outras fileiras estão divididas em 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Anticorpos de cabra anti-igg humana, marcados com fosfatase alcalina Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Controle 1 frasco (tampa vermelha) de 0,4 ml de plasma humano diluído, positivo para anticorpos anti- e anti-hiv-2, inativado pela adição de b-propilactona e pelo calor. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,4 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para HIV. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Este kit é apenas para uso diagnóstico in vitro. Embora tenha sido inativado, trabalhar o controle positivo como potencialmente infeccioso. Todos os materiais de origem humana usados na preparação dos controles foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. As amostras podem ser armazenadas por 72 horas de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 72 horas, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipeta de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 50 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 30 minutos; ou deixar a temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando indicado, nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos pares de dentes são necessários para testar as amostras e controles. Será necessário um par para cada teste. Cada par de dentes mostra o número 34 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de pares de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). Não separar os dentes pareados. c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 50µL de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um Controle e um Negativo fornecidos com o kit. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle /B12/OR 2
3 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Próximo do final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) No final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 3a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, tirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Depois de 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após de 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos, retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do Resíduo Descartar as Placas Reveladoras utilizadas, ponteiras das pipetas, papel absorvente e luvas como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2 a 8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5): 1. O Controle deve produzir seis pontos cinza azulados no par correspondente do dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle interno) no dente esquerdo do par e nenhum outro ponto. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno) no dente esquerdo do par. Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Controle Negtivo Figura 5. Validação dos testes. Resultados Inválidos Interpretação dos Resultados O desenvolvimento exclusivo do ponto do Controle Interno indica que a amostra correspondente é negativa para a sorologia HIV. Uma amostra é considerada indeterminada quando apresenta somente um ponto circular isolado colorido de antígeno de HIV ou ambos os pontos p24 e p31 sem pontos no dente direito. Uma amostra apresentando no mínimo dois pontos circulares coloridos de antígeno de HIV, incluindo um representando o gp41 ou gp36 (veja a Figura 2), é definido como HIV positivo. Nestes casos a diferenciação entre e HIV-2 pode ser obtida como segue: A ausência de um ponto para o gp36 e presença do gp41 e/ou gp120 indica que a amostra é positiva para anticorpos. A presença de um ponto para o gp36 indica que a amostra é positiva para anticorpos HIV-2. Os padrões mais prevalentes de pontos e suas interpretações estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Interpretação dos resultados Padrões dos pontos de HIV presentes em: Interpretação Dente esquerdo Dente direito para p24 e/ou p31 gp41 Ausência de ponto gp41 e gp120 p24 e/ou p31 gp36 isolada ou com HIV-2 gp41 p24 e/ou p31 gp36, gp41 e gp120 HIV-2 isolado ou co-infecção com p24 e/ou p31 Ausência de ponto ou gp120 Indeterminado Ausência de ponto gp41 ou gp120 e/ou gp36 Ausência de ponto Ausência de ponto Negativo Importante: Qualquer ponto fracamente colorido no dente deve ser interpretado como reativo. No caso de um resultado indeterminado, coletar uma nova amostra de sangue e repetir o teste. Documentação dos Resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação. Limitações O ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm é um ensaio suplementar destinado para confirmar a presença de anticorpos para antígenos HIV, em amostras inicialmente reativas. Na ausência de critérios uniformes aceitáveis para a interpretação de perfis de anticorpos para HIV, a interpretação acima descrita deve ser considerada como uma diretriz recomendada. Todavia, a reatividade para anticorpos para /HIV-2 não deve ser considerada como único critério para o diagnóstico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) ou da infecção pelo HIV. Visto que a produção de anticorpos pode ser adiada, seguindo a exposição inicial ao HIV, ou ser suprimida devido a condições de imunocomprometimento de um paciente, um resultado negativo com este teste não deve ser considerado como evidência conclusiva que o paciente não tenha sido exposto ao ou infectado pelo HIV. Características de Desempenho* A. Estudo Multicêntrico a Um estudo multicêntrico foi realizado em 559 amostras incluindo 154 indivíduos HIV negativos, 318 pacientes positivos, 35 pacientes que foram positivos por ELISA e indeterminados (Ind.) para por Western Blot (WB), assim como 52 indivíduos que foram positivos por ELISA e negativos por WB. A população negativa incluiu mulheres grávidas, pessoas com doenças autoimunes e com infecção por hepatite. Os resultados estão demonstrados na Tabela 2. Tabela 2. Estudo Multicêntrico a Status de ImmunoComb II HIV 1 & 2 CombFirm ELISA WB Negativo Ind. Negativo Negativo Ind b 6 Negativo a Resultados preliminares b Incluindo seis WB apresentando apenas p17 ou p /B12/OR 3
4 As seguintes características de desempenho foram calculadas incluindo apenas resultados positivos ou negativos inequívocos: Sensibilidade 99,7% Especificidade 100% B. Amostras de Pacientes originários da África Um estudo foi realizado em amostras de indivíduos com origem africana. A população compreendida de 48 indivíduos HIV negativos, 51 pacientes infectados com, 84 infetados com HIV-2 e 9 co-infectados com e HIV-2. Os resultados estão demonstrados na Tabela 3. Tabela 3. Amostras de Origem Africana Status de HIV a ImmunoComb II HIV 1 & 2 CombFirm Neg. HIV 1 HIV 2 HIV Ind. Negativo HIV HIV b HIV a Por ELISA e WB b Reativo apenas com gp36 Os dados, excluindo os resultados indeterminados, apresentaram 100% de sensibilidade e especificidade para HIV. Todas as amostras positivas para, incluindo 5 amostras com subtipo O, foram corretamente identificadas. Entre as amostras positivas para HIV-2, 10 apresentaram reação cruzada contra a gp120, resultando em uma especificidade diferencial total de 93,8%. Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) astec@prodimol.com.br Registro MS Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo Soares CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B12/OR (05/2010) * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Center for Disease Control Interpretation and use of the Western Blot assay for serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus type 1 infection. MMWR 38 (S-7): 1-4. Dax EM HIV testing and stating, disease progression, and markers. Curr Opinion Infect Dis 6: Groopman JE, Chen FW, Hope JA, Andrews JM, Swift RL, Benton CV, Sullivan JL, Volberding PA, Sites DP, Landesman S, Gold J,Baker L, Craven D, Boohes FE Serological characterization of HTLV-III infection in AIDS and related disorders. J Infect Dis 153: Higgins JR, Pederson NC, Carison JR Detection and differentiation by sandwich enzyme-linked immunosorbent test for human T-cell lymphotropic virus III, lymphadenopathy-associated virus (LAV) and acquired immunodeficiency syndrome-associated retroviruslike clinical isolates. J Clin Microbiol 24: Jackson JB, Balfour HH Practical diagnostic testing for human immunodeficiency virus. Clin Microbiol Rev, 1: Lacroix M, Penney CL, Dwyer RJ, Stern MD, Bellini F, Dionne G, Tsoukas C A peptide-based microtiter ELISA kit for the detection of antibodies to and HIV-2, Fifth International Conference on AIDS. Montréal. W.B.P Gnann Jr JW, McGormick JB, Mitchell S, Nelson JA, Oldstone Synthetic peptide immunoassay distinguishes HIV type 1 and type 2 infections. Science 237: Myers RA, Patel JD, Joseph JM Identifying HIV-2-seropositive individuals by reevaluating HIV 1 indeterminate sera. J Acquir Immunedef Syndr 5: Samgadharan MG, Veronese F, Lee S, Gallo RC Immunological properties of HTLV-III antigens recognized by sera of patients with AIDS and AIDS-related complex and of asymptomatic carriers of HTLV-III infection. Cancer Res 45: 4574s-4577s. Version: /B12/OR (05/2010) /B12/OR 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 hrs, a temperature ambiente ou 30 minutos a 37 C Aspirar as amostras e controles Adicionar as amostras e controles no orifício A. Misturar. Remover o pente da embalagem. Inserir o Pente no orificio A e misturar. Incubar Abrir os orificios B Absorver o líquido acumulado nos dentes Inserir o Pente e agitar na coluna B. Incubar Após misturar/agitar & incubar nas colunas C, D E. Reação de cor na fileira F 9 10 Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 CombFirm. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo). 1. Deixe que todos os reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente e realize o teste em temperatura ambiente. 2. Dispense 50 µl de cada amostra e controle em cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misture. 3. Coloque o Pente na fileira A e continue como descrito na Tabela 1: 1 Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste. Etapa Fileira Proceda como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misture; incube por 30 minutos; absorva. Lavagem B Agite; incube por 2 minutos; absorva. Ligação do conjugado C Misture; incube por 20 minutos; absorva. Lavagem D Agite; incube por 2 minutos; absorva. Lavagem E Agite; incube por 2 minutos; absorva. Reação de cor F Misture; incube por 10 minutos. Reação de parada E Incube por 1 minuto; seque ao ar livre. Dobrando e quebrando o Pente /B12/OR 5
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