Chlamydia trachomatis IgA
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- Ana Vitória Carvalhal Andrade
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1 Chlamydia trachomatis IgA Código: Versão: 411/P5 P Formato: 3 x 12 testes O kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA é um teste para a determinação semiquantitativa de anticorpos IgA para Chlamydia trachomatis, em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução As Chlamydias são bactérias gram negativas, parasitas intracelulares obrigatórias de células eucarióticas. O gênero Chlamydia inclui 4 espécies: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae e C. pecorum. As quatro espécies possuem um antígeno lipopolissacáride (LPS) gênero específico comum, além de antígenos protéicos de membrana externa espécieespecíficos. Três das espécies causam doenças em humanos, mas diferem na sua patogenicidade. A C.psittaci é um patógeno principalmente de aves, causando infecções respiratórias em humanos (psitacose). A C.pneumoniae (ou cepa TWAR) é transmitida pela via respiratória. Ela foi relacionada com pneumonia, bronquite, sinusite e mais recentemente, com doença da artéria coronariana. A Chlamydia trachomatis é o agente causador do tracoma e é uma das principais causas das doenças sexualmente transmissíveis (DST). Os tipos mais freqüentes de DST induzidas por C. trachomatis são: infecções urogenitais, especialmente a uretrite não-gonocócica (UNG) e epididimite nos homens e doença inflamatória pélvica (DIP) nas mulheres. Embora geralmente assintomática, a infecção não diagnosticada nas mulheres pode levar a salpingite aguda, com alto risco de gravidez ectópica ou infertilidade tubária. Também foram reportadas conjuntivite neonatal e pneumonia, provavelmente adquirida durante a passagem através do canal de nascimento infectado. A infecção por Chalmydia pode ser diagnosticada não sorologicamente, através da urina ou por exame direto da amostra clínica (esfregaço ou extratos) ou por cultura de tecidos. As metodologias incluem amplificação de DNA e RNA, a visualização imunofluorescente (DFA) direta ou por coloração de antígenos específicos em inclusões citoplasmáticas típicas e ensaio imunoenzimático (EIA) para detectar antígenos extraídos de swabs. Estes acessos não-sorológicos, com exceção da análise de urina, envolvem coleta invasiva dolorosa de amostras clínicas. Além disso, as infecções do trato genital superior e do trato respiratório inferior são geralmente inacessíveis aos swabs e não detectáveis na urina. A detecção sorológica de anticorpos para Chlamydia é um meio mais conveniente e altamente sensível para diagnosticar as infecções por Chlamydia. Este método também facilita o diagnóstico em casos de acesso físico problemático. Entretanto, na maioria dos testes, a reação cruzada entre as espécies impede a interpretação clínica significativa dos resultados. O teste de microimunofluorescência (MIF), que permite a discriminação entre as espécies, requer um alto nível de habilidade para ser realizado e interpretado adequadamente. Os anticorpos IgA anti-c. trachomatis indicam o estado ativo em infecções agudas, crônicas ou recorrentes por Chlamydia. Eles confirmam os resultados positivos de IgG anti-c. trachomatis e podem ajudar no acompanhamento do tratamento com antibiótico. Além disso, estudos clínicos sugerem um alto grau de correlação entre o nível de IgA anti-chlamydia e a presença atual de antígenos de Chlamydia. O kit ImmunoComb Chlamydia tracomatis IgA utiliza amplamente os antígenos sorotipo L2 que reagem fortemente com outros sorotipos para a identificação e quantificação de anticorpos IgA anti-c. trachomatis. Princípio do Teste O teste ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado na superfície em duas posições: Ponto superior anticorpos de cabra para IgA humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos de C. trachomatis inativados A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-c.trachomatis, se presentes na amostra, ligam-se especificamente aos respectivos antígenos de Chlamydia no ponto inferior de cada dente do Pente (figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgA anti-c. trachomatis capturados nos pontos inferiores dos dentes e as imunoglobulinas humanas dos pontos superiores (Controle Interno), reagem com anticorpos anti-iga humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada reage com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (anticorpos IgA anti- C.trachomatis) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto inferior bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar que o kit está funcionando adequadamente e que o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas: 411/P5 1
2 Ponto superior anticorpos de cabra para IgA humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos C. trachomatis inativados Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Anticorpos de cabra anti-iga humano marcados com fosfatase alcalina Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,5 ml de plasma humano inativado pelo calor, diluído a um título de ImmunoComb de 1:8 para IgA anti- C. trachomatis. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,4 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para Chlamydia. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2-8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit. Manipulação das amostras Tanto o soro como plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 25 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26 ºC) por 3 horas. Trazer todos os componentes (Pentes, controles e amostras) à temperatura ambiente. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento apropriado do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 11 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (n 0 de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de C para uso posterior. Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 25 µl de uma amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando a ponteira com a solução repetidamente. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras e para os dois controles. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 411/P5 2
3 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 40 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao término dos 40 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 40 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 3a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras usadas, ponteiras de pipetas, papel absorvente e luvas como lixo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2-8 ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as quatro condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O sinal do ponto inferior do Controle Positivo deve ser no mínimo 30 quando medido usando o programa 91 do refletômetro CombScan TM. 3. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 4. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Se alguma destas quatro condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Figura 5. Validação dos testes. Leitura e Interpretação dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do controle positivo (Figura 6). Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do controle positivo é considerada um resultado positivo com título no ImmunoComb maior ou igual a 1:8, indicando uma infecção ativa por Chlamydia. Nenhum ponto ou um ponto com coloração menos intensa deve ser considerado um resultado negativo. Figura 6. Resultado dos Testes Leitura no Equipamento O refletômetro CombScan TM (ver o Manual do Usuário do CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, designando a leitura do ponto inferior digitando 1 quando aparecer a mensagem pontos: 1,2,3 na tela. Converter as unidades de absorbância relativas obtidas em títulos ImmunoComb de acordo com a Tabela 1. Tabela 1. Conversão de leituras de absorbância relativa para títulos do ImmunoComb e interpretação. Absorbância Títulos Interpretação Relativa ImmonoComb* < 700 < 1:8 Negativo :8 > 1103 > 1:16 Positivo, indicando infecção ativa por Chlamydia Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. * Os títulos ImmunoComb geralmente são comparáveis aos títulos MIF. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros testes laboratoriais realizados com o paciente. Características de Desempenho* O desempenho do kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA foi comparado com um procedimento de ensaio indireto de imunoperoxidase, testando um total de 316 amostras em quatro populações diferentes (Tabela 2). Estes incluíram: (I) 45 mulheres estéreis com infertilidade devido a oclusão das trompas de falópio, (II) 53 mulheres inférteis com trompas de falópio abertas bilateralmente, (III) 100 pacientes da obstetrícia, com 6 dias após o parto e (IV) 118 mulheres com presença comprovada (imunofluorescência e/ ou cultura) de antígenos de C. trachomatis em esfregaço cervical. 411/P5 3
4 Tabela 2. Detecção de C. trachomatis em quatro populações clinicamente diferentes. Comparação entre o kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA e um teste de referência. Grupo Clínico Casos Positivos (%) Teste de Referência ImmunoComb I 42,2 44,4 II 7,5 9,4 III** 6,3 7,4 IV 49,1 55,1 ** Entre as 100 mulheres do grupo III, seis deram resultado fortemente positivo em um ELISA para detecção de antígenos de Chlamídia. Entre eles, 4 (66,7%) foram identificados pelo ImmunoComb e 2 (33,3%) pelo teste de referência. A % de casos positivos do grupo III na Tabela 2 reflete o número de falso positivos entre as 94 mulheres restantes. A sensibilidade obtida usando o kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA foi ligeiramente superior à obtida com o ensaio de referência, enquanto que a especificidade com os dois kits foi semelhante ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Barnes RC Laboratory diagnosis of human chlamydial infections. Clin Microbiol Rev 2: Bjercke S, Purvis K Characteristics of women under fertility investigation with IgA/IgG seropositivity for Chlamydia trachomatis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 51: Chutivongse S, Kozuh-Novak C, Annus J, Ward M, Cates Jr W, Rowe PJ, Farley TMM. WHO task force on the prevention and management of infertility Tubal infertility: Serological relantionship to past chlamydial and gonococcal infection. Sex Transm Dis 22: Clade A, Flecken U, Petersen EE Chlamydial serology in genital infections: ImmunoComb versus Ipazyme. Infection 21:6, 384. Grayston JT Infections caused by Chlamydia pneumonia strain TWAR. Clin Infect Dis 15: Csángo PA, Sarov B, Schiotz H, Sarov I Comparison between cell culture and serology for detecting Chlamydia trachomatis in women seeking abortion. J Clin Pathol 41: Moss T, Darougar S, Woodland R, Nathan M, Dines RJ, Cathrine V Antibodies to Chlamydia species in patients attending a genitourinary clinic and the impact of antibodies to C. pneumoniae and C. psittaci on the sensitivity and the specificity of C. trachomatis serology tests. Sex Transm Dis 20: Odland JO, Änestad G, Rasmussen S, Lungren, Dalaker K Ectopic pregnancy and chlamydial serology. Int J Gynecol Obstet 43: Samra Z, Sofer Y IgA antichlamydia antibodies as a diagnostic tool for monitoring of active chlamydial infection. Eur J Epidemiol 8: Sarov I, Kleinman D, Holoman D, Potashnik G, Insler V, Cevenini R, Sarov B Specific IgG and IgA antibodies to Chlamydia trachomatis in infertile women. Int J Fertil 31: Schachter J Chlamydiae In: Balows A. Hausler WJ. Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. Pp Sellors JW, Mahony JB, Chernesky MA, Rath DJ Tubal factor infertility: an associationwith prior chlamydial infection and asymptomatic salpingitis. Fertil Steril 49: Sweet RL, Schachter J, Landers DV Chlamydial infections in obstetrics and gynecology. Clin Obstet Gynec 26: Theunissen JJH, Minderhout-Basssie W. Wagenvoort JHT, Stolz E, Michel MF, Huikeshoven FJM Chlamydia trachomatis-specific antibodies in patients with pelvic inflammatory disease: comparision with isolation in tissue culture or detection with polymerase chain reaction. Genitounn Med 70: P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel h t t p : / / w w w. o r g e n i c s. c o m Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne 411/P5 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Resumo do Procedimento de Teste As instruções abreviadas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. 2. Dispensar 25 µl de cada amostra ou controle nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 3. Colocar o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 3: Tabela 3. Resumo do Procedimento de Teste. Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 40 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. 411/P5 5
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