Rubéola IgG. Uso Pretendido. Conteúdo do Kit. Somente para Uso Diagnóstico in Vitro
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- João Batista Minho Gorjão
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1 B pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior Imunoglobulina humana (Controle Interno). Ponto inferior Antígenos de Rubéola inativados. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagente pronto para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Rubéola IgG Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são pré-diluídas 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Anticorpos contra o vírus da Rubéola, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos de rubéola nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os IgG anti-rubéola capturados nos pontos inferiores dos dentes, e a imunoglobulina humana dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com anticorpos anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Formação do complexo antígeno Rubéola-anticorpo 30 min Anticorpos anti-rubéola Código: Somente para Uso Diagnóstico in Vitro Formato: 3 x 12 testes Uso Pretendido O kit ImmunoComb II Rubéola IgG é um teste EIA rápido para a determinação semi-quantitativa de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com o kit. Introdução O vírus da Rubéola é um membro da família Togaviridate, encontrado principalmente em populações humanas. A transmissão se dá principalmente por aerossóis ou por contato direto, com um pico de incidência da doença na faixa etária de 5-14 anos. Em geral, a infecção se manifesta como uma doença benigna e autolimitante, caracterizada por erupção maculopapoular (sarampo), febre tênue e linfoadenopatia. Podem ocorrer ocasionalmente artralgia provisória e artrite suave. Ao contrário, a infecção primária por Rubéola contraída durante o início da gravidez, pode resultar em danos severos ao feto, natimorto ou aborto. Os sintomas de crianças com infecção congênita incluem anormalidades anatômicas e neuro-sensoriais sérias, tais como surdez, defeitos cardíacos, catarata, glaucoma e retardo mental. O retardo no crescimento e a diabete mellitus também foram associados com complicações posteriores da rubéola congênita. A vacinação em massa tem reduzido significativamente a incidência de Rubéola em todas as faixas etárias. Entretanto, 10 a 20% de jovens adultos ainda são suscetíveis ao vírus. A triagem de anticorpos IgG para o vírus da rubéola é uma ferramenta útil para o diagnóstico da doença e para a determinação do estado da imunização. Os anticorpos para o vírus aparecem à medida que a erupção diminui. Nos adultos, os anticorpos IgG geralmente, persistem por toda a vida. Conseqüentemente, um título estável de IgG anti-rubéola demonstra a exposição prévia ao vírus, enquanto um aumento quadruplicado ou maior é diagnóstico de infecção recente. Entretanto, um aumento no título de IgG na ausência de sintomas clínicos, pode também indicar reinfecção. A produção de anticorpos IgG circulantes contra o vírus da Rubéola por crianças infectadas congenitamente, geralmente persiste até 3-4 anos após o parto. A determinação seriada do nível de IgG anti-rubéola na criança, no entanto, irá ajudar na diferenciação entre Rubéola congênita (nível estável) ou Rubéola neonatal (aumento no título). Princípio do Teste O teste ImmunoComb II Rubéola IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um Conjugado anti-igg Humano Substrato cromogênico Figura 1. Princípio do Teste Ligação do conjugado anti-igg Humano, 20 min Reação enzimática de cor,10 min O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-rubéola) e um Controle Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior, ou um ponto bem claro. O ponto superior deve aparecer também em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior Imunoglobulina humana (Controle Interno). Ponto inferior Antígenos de Rubéola inativados Figura 2. Pente ImmunoComb II Controle Interno Antígenos Rubéola Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio /B9/OR 1
2 Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Anticorpos de cabra anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou cavidades de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os reagentes, Placas Reveladoras, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a temperatura de 22 26º C. Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano, inativado pelo calor, diluído para um nível de cutoff de 15 IU/mL de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para o vírus da Rubéola. Diluente da amostra 1 frasco de 5 ml. Perfurador para perfurar a folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale TM para a leitura dos resultados. Segurança e Precauções Os materiais de fonte humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não-reativos para o antígeno de superfície de hepatite B e para anticorpos para hepatite C e para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos de laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes *, Placas Reveladoras e outros materiais usados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. * A menos que sejam armazenados para documentação posterior. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. Trazer todos os outros componentes (pentes, diluente de amostra, controles e amostras) à temperatura ambiente. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado, nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 00 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. Armazenamento e Estabilidade do kit O kit é fornecido de 2-8 ºC. Durante o transporte o kit pode ser conservado a 30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas. Armazenar os componentes na embalagem original de 2-8ºC. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados de 2-8ºC. O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado de 2-8ºC. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser utilizados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. As amostras podem ser armazenadas por 72 horas de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 72 horas, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. ImmunoComb II Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição de Amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µl do diluente de amostra em um microtubo ou cavidade de microtira. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µl de uma amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo fornecido no kit. Misturar aspirando e dispensando a solução repetidamente. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 3. Pipetar 25 µl de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e /B9/OR 2
3 dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar aspirando e dispensando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Inserir e retirar o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Inserir e retirar o Pente vigorosamente das cavidades e deixar inserido por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem correta. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c. Ligação de Conjugado (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda lavagem (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente por 2 minutos, como no passo 6. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva de forma que nada possa respingar de dentro delas, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, Controles, perfurador, diluente de amostra e instruções de uso à caixa original. Armazenar entre 2 8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno). Caso alguma destas condições não seja cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Controle Resultados Negativo Posetivo Inválidos Figura 5. Validação dos testes Leitura e Interpretação dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior de cada dente de amostra com o ponto inferior do dente do Controle Positivo (Figura 6). Um ponto com intensidade maior ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola. Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor que a do Controle Positivo é considerado um resultado negativo. Resultado Negativo Figura 6. Resultados do Teste Controle Positivo Presença de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual O nível de IgG anti-rubéola em cada amostra pode ser estimado comparando-se a intensidade de cor do ponto inferior de cada dente com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit. Esta comparação se dá como a seguir: Calibrar o CombScale Orgenics CombScale For/Pour/Para/Für RUBELLA IgG IU/mL 15 C WINDOW/NUANCLER/VENTANA/FENSTER Figura 7. CombScale 1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que 15; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade mais parecida da escala de cor. Marcar a concentração (em UI/mL) que aparece acima daquela janela como sendo o nível aproximado de anticorpos IgG para vírus da rubéola para aquela amostra. * Baseado na calibração utilizando o 2º padrão Inglês para soro anti-rubéola (67/182). Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser armazenados para documentação posterior /B9/OR 3
4 Limitações Como em outros testes destinados ao uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho* A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II Rubéola IgG foram avaliadas em um painel de 223 amostras de soro, em comparação com um teste EIA de referência. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resultados dos Testes Teste de Referência ImmunoComb II Rubéola IgG Positivo Negativo Positivo Negativo 0 97 Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade 100% Especificidade 100% Repetibilidade 10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de várias partes de um lote de produção. Um soro positivo foi testado 12 vezes nestes pentes. Em todos os pentes foi observado o mesmo título de Rubéola IgG. Reprodutibilidade Três amostras foram testadas em pentes retirados de 3 diferentes lotes de produção. As amostras foram testadas em duplicata. Em todos os pentes foi observado o mesmo título de Rubéola IgG. Reação Cruzada A reação cruzada com amostras positivas para Toxoplasma e CMV foi considerada insignificante. Interferência Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina acima de 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol acima de 281,6 mg/dl); triglicérides (381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (acima de 20 mg/dl). * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Chernesky MA, Mahony JB Rubella Virus. In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Enders G Problems of Rubella diagnosis by various IgM techniques and the need for test combinations. In: Habermehl K-O, ed. Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology. Springer Verlag, Berlin, pp Evans AS, Brachman JS, eds. Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control. 3 rd edition. New York, NY: Plenum Medical Book Company, Frenkel LM, Nielsen K, Garakian A, et al. A search for persistent rubella virus infection in persons with chronic symptoms after rubella and rubella immunization and in patients with juvenile rheumatoid arthritis. Clin Infect Dis 1996; 22: Mellinger AK, Cragan JD, Atkinson WL, et al. High incidence of conjenital rubella syndrome after a rubella outbreak. Pediatr Infect Dis J 1995; 14: Fabricante: Version: /B9/OR (05/2010) Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) astec.camila@prodimol.com.br astec.tatiana@prodimol.com.br Registro ANVISA nº Resp. Técnico: Maria do P. Socorro V. Zuchi CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B9/OR (05/2010) /B9/OR 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 horas à temperatura ambiente ou 20 minutos a 37 C Aspirar e pré-diluir Adicionar amostras e Remover o Pente da amostras e controles controles pré-diluidos embalagem. na filira A. Misturar Inserir o Pente na fileira A e misturar. Incubar Abrir a fileira B Absorver o líquido residual do Pente Inserir o Pente e agitar na fileira B. Incubar Após misturar/agitar e incubar nas fileiras C, D e E. Reação de cor na fileira F 9 10 Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II Rubéola IgG. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras para a temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. 2. Pré-diluir 10 µl de cada amostra e controle com 100 µl de diluente de amostra. 3. Dispensar 25 µl de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste. 1 Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar 30 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Ligação do Conjugado C Misturar; incubar 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar 10 minutos. Reação de parada E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando o Pente /B9/OR 5
Rubéola IgM. do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa.
Rubéola IgM P do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são prétratadas com anti-igg
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