Helicobacter pylori IgG
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- Madalena Tavares Henriques
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1 Helicobacter pylori IgG B Princípio do Teste O teste ImmunoComb II Helicobacter pylori IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado em duas posições: Ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos de H. pylori inativados A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prédiluídas 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos para H. pylori, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos H. pylori no ponto inferior dos dentes do Pente (figura 1). Simultaneamente, as imunoglobulinas presentes nas amostras serão capturadas pela imunoglobulina anti-humana no ponto superior (Controle Interno). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgG anti-h. pylori capturados nos dentes reagirão com anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente. Código: Somente para Uso Diagnóstico in Vitro Formato: 3 x 12 testes Uso Pretendido O kit ImmunoComb II Helicobacter pylori IgG é um teste EIA rápido para a detecção semi-quantitativa de anticorpos IgG para Helicobacter pylori, em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução O Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativo, flagelada, curva em espiral, encontrada na mucosa gástrica e nas criptas gástricas do estômago. A bactéria é caracterizada por uma alta atividade de urease. É um patógeno primata com distribuição mundial, afetando mais de 60% da população humana em países industrializados e porcentagens mais altas em países subdesenvolvidos. O aumento na freqüência de infecções que ocorrem entre familiares, com gerações e com multidões, indica que o H. pylori é transmitido por contato direto. Atualmente é geralmente aceito que a infecção pelo H. pylori é a principal causa de gastrite tipo B ativa e crônica, e dispepsia não-ulcerosa. A bactéria tem sido também fortemente associada com úlceras pépticas gastroduodenais e com adenocarcinoma gástrico, uma das formas mais comuns de câncer em humanos. Evidências recentes tem mostrado uma ligação preferencial do H. pylori ao ácido siálico no muco de glicoproteínas e a fucose no antígeno do grupo sanguíneo Lewisb, expresso na superfície das células epiteliais gástricas do estômago. Os métodos atuais para o diagnóstico da infecção por H. pylori incluem métodos invasivos (endoscopia e biópsia gástrica), o teste não invasivo, mas radioativo, teste de sopro de uréia e a detecção sorológica. Na biópsias, os organismos podem ser detectados microscopicamente pela produção de urease e pelo isolamento através da cultura celular. Os métodos invasivos são dolorosos e necessitam de várias amostras para sensibilidade adequada, devido à distribuição desigual das colônias de H. pylori. Recentemente foram desenvolvidos testes sorológicos confiáveis. Os principais determinantes antigênicos foram detectados na urease, assim como a proteína externa imunodominante de 128kDa (CagA) e citotoxina (VacA) de cepas patogênicas de H. pylori. Estudos comparativos tem mostrado correlações positivas entre as respostas de anticorpos IgG às preparações antigênicas de H. pylori, a gravidade da gastrite, a densidade da colonização de H. pylori ou a eficácia da sua erradicação. O kit ImmunoComb II Helicobacter pylori IgG permite o monitoramento sorológico confiável da infecção por H. pylori ou a resposta à terapia. Anticorpo Conjugado anti-igg humano Substrato Chromogenico Figura 1. Princípio do Teste Formação do complexo Antígeno H.Pylori-anticorpo; 30 min Ligação do conjugado anti-igg Humano,20 min Reação enzimática de cor; 10 min O kit inclui um Controle (IgG anti-h. pylori) e um Controle, para serem inserídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle deve mostrar o ponto superior e nenhum outro ponto inferior ou um ponto inferior bem fraco. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se a amostra foi adicionada. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos H. pylori inativados Figura 2. Pente ImmunoComb II Controle Interno Antigenos H. Pylori Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante /B8/OR 1
2 Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Solução de lavagem Fileira C Anticorpos de cabra anti-igg humana, marcados com fosfatase alcalina Fileira D Solução de lavagem Fileira E Solução de lavagem Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazólio (NBT) Figura 3. Placa Reveladora Controles Controle 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano inativado pelo calor, diluído para um nível de cutoff de 20 U/mL para IgG anti- H. pylori. Controle 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-h. pylori. Diluente de amostra 1 frasco de 5 ml. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale TM para leitura dos resultados dos testes. Segurança e Precauções Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos de laboratório aceitos para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes* e Placas Reveladoras utilizadas e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. * A menos que sejam armazenados para documentação posterior. Armazenamento e Estabilidade do kit O kit é fornecido a 2-8 ºC. Durante o transporte o kit pode ser conservado a 30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas. Armazenar os componentes na embalagem original a 2-8ºC. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados a 2-8ºC. O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado a 2-8ºC. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser utilizados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias a 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão com ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou tiras de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio utilizando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente o Pente e a Placa Reveladora. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 25 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a 2 8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição das Amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µl de diluente de amostra em um microtubo ou cavidade de microtitulação. 2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µl da amostra ou do Controle ou Controle /B8/OR 2
3 fornecidos com o kit. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 3. Pipetar 25 µl de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras e para os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: inserir e retirar o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B utilizando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual das pontas dos dentes com papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: retirar e inserir o Pente vigorosamente nas cavidades por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos, retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle Interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Controle Figura 5. Validação do Teste Resultados Inválidos Leitura e Interpretação dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior do dente do controle positivo (Figura 6). Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgG para H. pylori. Um ponto com coloração menos intensa que o controle positivo é considerado como resultado negativo. Figura 6. Resultados do Teste Leitura Visual dos Resultados O nível de IgG anti-h. pylori em cada amostra pode ser avaliado pela comparação entre a intensidade de cor do ponto inferior de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit. Esta comparação se dá como a seguir: (Figura 7) 1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do Controle sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que 20; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade mais semelhante da escala de cor. Marcar o valor que aparecer acima da janela como sendo o título aproximado de anticorpos IgG para H. pylori para a amostra correspondente. Orgenics CombScale Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar a 2 8ºC. Calibrar o CombScal Figura 7. CombScale Anti-Helicobacter pylori IgG Low Medium High C+ Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e para demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O Controle deve produzir um ponto superior (Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, sem afetar a interpretação dos resultados. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros testes laboratoriais realizados para o paciente /B8/OR 3
4 Características de Desempenho* O desempenho do kit ImmunoComb II Helicobacter pylori foi avaliado pela comparação com kits EIA de referência em 339 amostras. Os resultados estão demonstrados na tabela 1. Tabela 1. Comparação do ImmunoComb II Helicobacter pylori com EIA de referência EIA Referência ImmunoComb II Helicobacter pylori Sensibilidade 92,1% Especificidade 80,75% Repetibilidade 10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de várias partes de um lote de produção. Um soro positivo par Helicobacter pylori foi testado 12 vezes em cada pente. Em todos os casos foram detectadas amostras positivas para Helicobacter pylori. Reprodutibilidade Três amostras positivas para Helicobacter pylori foram testadas em pentes retirados de 3 lotes diferentes de produção. Em todos os casos foram detectadas as amostras positivas. Reação Cruzada A reação cruzada encontrada foi insignificante com amostras positivas de Antígeno de Superfície da Hepatite B, vírus da Hepatite C e HIV 1&2. Interferência Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina acima de 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol acima de 281,6 mg/dl); triglicérides (381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (acima de 20 mg/dl). Bibliografia Blaser MJ Helicobacter pylori: Microbiology of a slow bacterial infection. Trends Microbiol 1: Borén T, Falk P, Roth KA, et l Attachment of Helicobacter pylori to human gastric epithelium mediated by blood group antigens. Science 262: Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Nati Ac Sc, USA 90: De Giacomo C, Lisato L, Negrini R, et al Serum immune response to Helicobacter pylori in children: Epidemiologic and clinical applications. J. Pediatrics 119: Halter F, Hurlimann S. Inauen W Pathophysiology and clinical relevance of Helicobacter pylori. Yale J Biol Méd 65: Kosunen TU, Seppälä K, Sarna S, Sipponen P Diagnostic value of decreasing IgG, IgA, and IgM antibody titres after eradication of Helicobacter Pylori. Lancet 339: Kreuning J, Lindeman, Biemond I, Lamers CBHW Relation between IgG and IgA antibody titres against Helicobacter pylori in serum and severity of gastritis in asymptomatic subjects. J Clin Pathol 47: Parsonnet J. Friedman GD, Vandersteen DP, et al Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: Talley NJ, Newell DG, Ormand JE, et al Seriodiagnosis of Helicobacter pylori. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assays. J Clin Microbiol 29: Telford JL, Covacci A, Ghiara P, Montecucco C, Rappuoli R Unravelling the pathogenic role of Helicobacter pylori in peptic ulcer; potential new therapies and vaccines. Trends Biotechnol 12: The Eurogast Study Group (D. Forman, et al) An international association between elicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet 341: Version: /B8/OR (05/2010) Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) astec@prodimol.com.br Registro ANVISA nº Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo Soares - CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B8/OR (05/2010) /B8/OR 4
5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 horas a temperature ambiente ou 30 minutos a 37 C Aspirar e pré-diluir amostras e controles Adicionar amostras e controles Pré-diluídos na filira A. Misturar. Remover o pente da embalagem. Inserir e agitar o Pente na fileira A. Incubação Abrir a fileira B. Absorver o líquido residual do Pente Inserir e agitar o Pente na fileira B. Incubação. Após misturar/agitar e incubar nas colunas C, D E. Reação de cor na fileira F 9 10 Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb Helicobacter pylori IgG. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Trazer todos os reagntes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26º C. 2. Pré-diluir 10 µl de cada amostra e controle com 100 µl de diluente de amostra. 3. Dispensar 25 µl de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste 1 Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 30 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. Dobrando e quebrando o Pente. 2 Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre /B8/OR 5
Helicobacter pylori IgG
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