Vírus linfotrópico das células T humanas, anticorpos anti-htlv-i e anti-htlv-ii.
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- Marco Custódio Olivares
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1 POP n.º: I 111 Página 1 de 8 1. Sinonímia Vírus linfotrópico das células T humanas, anticorpos anti-htlv-i e anti-htlv-ii. 2. Aplicabilidade Bioquímicos do setor de Imunologia. 3. Aplicação clínica O ensaio é um teste de triagem para detecção qualitativa de anticorpos contra os retrovírus HTLV-I e II (vírus linfotrópico das células T humanas) cuja transmissão ocorre através de contato sexual, exposição a sangue contaminado, transfusão de células ou transmissão de mãe infectada para seu filho durante a gestação ou através do aleitamento. Cerca de 99% das pessoas portadoras do HTLV-I nunca desenvolverão qualquer problema de saúde relacionado ao vírus. O HTLV-I está associado à leucemia das células T do adulto (ATL) e a paraparesia espástica tropical, conhecida também como mielopatia associada ao vírus linfotrópico de células T humanas (TSP/HAM). Esta doença é caracterizada por uma paraparesia crônica e progressiva. Os pacientes começam a se queixar de dores nos membros inferiores, na região lombar e apresentam dificuldade em defecar ou urinar. Estes sintomas são sempre progressivos e estão na região abaixo da linha do umbigo. No caso de leucemia o risco é ainda menor: um em cada portadores do HTLV-I poderá desenvolver a doença. O HTLV-II está pouco evidenciado como causa de doença; está associado à leucemia de células cabeludas. A região imunodominante do gp21 é 100% idêntica entre o genoma viral do HTLV-I e do HTLV-II, e a homologia global entre as duas proteínas gp21 é de 86%. Além disso, a homologia entre o dois peptídeos gp46 é de 65%%, portanto os reagentes raros selecionados (peptídeos sintéticos (gp46) e antígenos recombinantes (gp21)) neste ensaio são capazes de detectar simultaneamente anticorpos para HTLV-I e HTLV-II. 4. Princípio do teste O teste ARCHITECT HTLV I/II é um imunoensaio para detecção de Anticorpos anti-htlv I/II de duas etapas baseado na tecnologia de Quimiluminescência com Micropartículas () com protocolos de ensaio flexíveis, denominados Chemiflex. A presença de anti- HTLV I e HTLV-II é pesquisada na seqüência:
2 POP n.º: I 111 Página 2 de 8 Na primeira etapa do teste a amostra é adicionada ao diluente do teste. Uma alíquota da amostra pré-tratada é transferida para outra cubeta e incubada junto com as micropartículas paramagnéticas revestidas de HTLV I/II e o diluente do ensaio. Os anticorpos anti-htlv I/II presentes na amostra, ligam-se as micropartículas formando um complexo antígeno-anticorpo. Logo após é feita uma lavagem para remoção do material que não reagiu. Na segunda etapa é adicionado um conjugado composto de peptídeos sintéticos HTLV- I/HTLV-II+antígeno recombinante HTLV-I marcado com acridina. Após outro ciclo de incubação e lavagem, são adicionadas à mistura de reação as soluções pré-ativadora (prétrigger) e ativadora (trigger). Estas soluções ativam o acridina que emite sinais quimioluminescentes detectados pelo sistema ótico do equipamento. A quimiluminescência resultante é medida em unidades relativas de luz (RLUs). Há uma relação direta entre a quantidade de anti-htlv I/II presente na amostra e as RLUs detectadas no sistema ótico do ARCHITECT. A presença ou ausência de anti-htlv I/II na amostra é determinada pela comparação do sinal quimioluminescente obtido na reação com um cutoff determinado por uma curva de calibração. Se o sinal da amostra for maior do que o sinal do cutoff a amostra é considerada positiva para anti-htlv I/II. A região imunodominante do gp21 é 100% idêntica entre o genoma viral do HTLV-I e do HTLV-II, e a homologia global entre as duas proteínas gp21 é de 86%. Além disso, a homologia entre o dois peptídeos gp46 é de 65%%, portanto os reagentes raros selecionados (peptídeos sintéticos (gp46) e antígenos recombinantes (gp21)) neste ensaio são capazes de detectar simultaneamente anticorpos para HTLV-I e HTLV-II. 5. Amostra 5.1 Preparo do paciente Não é necessário jejum ou outro preparo. 5.2 Tipos de amostra Soro, incluindo coletas em tubos com gel ou plasma obtidos nos tubos relacionados: -Heparina de sódio/oxalato de potássio -Heparina de Lítio (PST) CPD -EDTA K2 CPDA-1 -Citrato de sódio ACD 5.3 Colheita Observar as precauções universais para punção venosa. Quantidade mínima de sangue: 1 ml Quantidade ideal de sangue: 5 ml 5.4 Preservação e transporte
3 POP n.º: I 111 Página 3 de 8 As amostras de plasma ou soro livres de hemácias ou em tubos com gel separador são estáveis por 14 dias refrigeradas a C ou 3 dias a C. Se as amostras forem processadas em tempos superiores, armazenar soro e plasma separados a temperaturas iguais ou menores que C. Para o transporte, observar as normas de Biossegurança. 5.5 Identificação da amostra Etiqueta com código de barras, gerado pelo sistema de gerenciamento de dados do LAC vigente. 5.6 Armazenamento Amostras são estáveis por um ano quando congeladas a 20 0 C. Após o descongelamento homogeneizar e centrifugar a x g por 10 minutos. Não foi observada diferença de resultados em amostras descongeladas e congeladas por até 6 vezes. 5.7 Amostras inadequadas Amostras inativadas, pools, hemólise grosseira (> 500 mg/dl), contaminação microbiana visível, amostras de cadáver ou de outros líquidos corporais. As amostras devem estar livres de fibrina, hemácias e outras partículas sólidas. Amostras de soro de pacientes recebendo terapia anticoagulante ou trombolítica podem conter fibrina resultante da formação incompleta do coágulo. 6. Reagentes e materiais 6.1 Micropartículas: 1 Frasco de 6,6 ml por frasco de micropartículas revestidas de peptídeo sintético HTLV-I/HTLV-II e antígeno (recombinante) HTLV-II em solução salina com tampão TRIS. Conservantes: ProClin 950 e azida sódica. 6.2 Conjugado: 1 frasco de 5,9 ml de peptídeo sintético HTLV-I/HTLV-II e antígeno (recombinante) HTLV-I marcados com acridina em tampão HEPES com estabilizantes de proteína e detergente. Conservante: ProClin Diluente do ensaio: 1 Frasco de diluente de ensaio r, contendo tampão TRIS e detergente. Conservantes: ProClin 950 e azida sódica. 6.4 Controles Controle Positivo (azul) reativo para anti-htlv I/II com S/CO de 2,07 6,20 Controle Negativo (incolor) não reativo para anti-htlv I/II com S/CO 0,00 a 0, Calibrador Calibrador 1 (verde) reativo para anti-htlv I/II. 6.6 Outros Reagentes do Sistema ARCHITECT Solução Pré-Ativadora: peróxido de hidrogênio 1,32% (p/v). Solução Ativadora: hidróxido de sódio 0,35 N. Tampão de Lavagem: solução salina em tampão fosfato. Conservantes: agentes antimicrobianos.
4 POP n.º: I 111 Página 4 de Preparo Todos os reagentes são prontos para uso exceto o tampão de lavagem. Antes do uso, misturar os controles e calibradores por inversão suave. 6.8 Estabilidade Estáveis até a data de vencimento. 6.9 Armazenamento Os reagentes, calibradores e controles ARCHITECT HTLV deverão ser armazenados entre 2 e 8 C. Conjunto de reagentes do teste deve permanecer no máximo 30 dias a bordo do aparelho. Solução Pré-Ativadora: manter a temperatura de 2-8ºC. Solução Ativadora: manter a temperatura de 2-30 C. Tampão de Lavagem: manter a temperatura de 15-30ºC. 7. Equipamentos ARCHITECTi2000, centrífuga e pipetas automáticas. 8. Calibração Homogeneizar o calibrador por inversão. Dispensar 5 gotas do calibrador em uma cubeta de amostra; Colocar a cubeta em um suporte de amostras; o calibrador será testado em triplicata. Programar a calibração conforme instruções no POPE 100 do equipamento. Quando a calibração for aceita fica armazenada no programa do equipamento e todas as outras amostras devem ser testadas sem calibração prévia. Nova calibração quando mudar o lote do kit ou quando os controles estiverem fora do intervalo esperado. 9. Procedimento (passo a passo) Antes de colocar o reagente no equipamento, ressuspender as micropartículas invertendo o frasco por 30 vezes. Certificar que houve ressuspensão completa. Colocar septos em todos os frascos. Após colocar um septo num frasco de reagente, não inverter o frasco, pois isso causará vazamento de reagente comprometendo os resultados do ensaio. Líquidos residuais poderão secar na superfície do septo, mas não devem interferir na eficácia do ensaio. Colocar o kit de reagentes no equipamento, verificar o inventário, ordenar a calibração e controles se necessário conforme instruções detalhadas no POPE 100 do equipamento. Colocar a amostra na rack de amostra.
5 POP n.º: I 111 Página 5 de 8 Caso o tubo primário não tenha nível suficiente para que a probe alcance o soro, transferir o soro para uma sample cup. Colocar a amostra na rack de amostras informando a sua posição caso não seja usado o sistema de leitura por código de barras; ou utilizar o tubo original com código de barras e introduzir a sample cup neste tubo. O volume requerido de amostra é calculado pelo sistema. Não realizar mais do que 10 replicatas do mesmo copo de amostra. Para minimizar os efeitos de evaporação, verificar a presença de volume adequado antes do procedimento. Urgência: 75 µl para o primeiro teste. Para replicatas, adicionar mais 25 µl para cada teste adicional no mesmo copo. Normal até 3 horas a bordo: 150 µl para o primeiro teste. Para replicatas, adicionar mais 25 µl para cada teste adicional no mesmo copo. Acima de 3 horas a bordo: trocar a amostra, controle ou calibrador por alíquotas novas. Pressione "RUN". O Sistema ARCHITECT i executa as etapas seguintes: Move o transportador de amostras para a fila de processamento de amostras.. Coloca uma célula de reação (RV) na faixa de processamento. Aspira e transfere a amostra para a RV. Avança a RV uma posição e transfere as micropartículas para a RV. Mistura, incuba e lava a mistura de reação. Adiciona o conjugado a RV. Mistura, incuba e lava a mistura de reação. Adiciona as soluções pre-ativadora e ativadora. Mede a emissão quimioluminescente para determinar a quantidade de anticorpos HTLV na amostra. Aspira o conteúdo da RV para os resíduos líquidos e descarta a RV nos resíduos sólidos. Calcula o resultado. Os ensaios são acompanhados por controles de resultados conhecidos e especificados na bula do controle, avaliados a cada rotina e armazenados no sistema ARCHITECT que permite monitorar estes resultados com padrão gráfico Levey-Jennings. 10. Controle de qualidade 10.1 Interno - Controles Positivo e Negativo fornecidos pelo fabricante. - Preparo: pronto para uso. - Freqüência: antes de cada rotina diária. - Enviar os resultados para o armazenamento de dados do equipamento.
6 POP n.º: I 111 Página 6 de 8 - Registrar os resultados na planilha de controles ou no programa eletrônico de qualidade vigente. Valores não aceitáveis: - Verificar possíveis problemas e repetir os controles; - Se novamente fora do esperado proceder recalibração do kit e repetir os controles; - Se novamente fora, descartar o kit e/ou controles. O sistema ARCHITECT tem capacidade de gerar uma curva Levey-Jennings para avaliação do controle de qualidade dos ensaios Externo Vide tabela PCIQ/PAEQ. 11. Resultados Os resultados são lançados como Soro não reagente ou Soro reagente. 11.1Unidades Não se aplica 11.2 Cálculos O Sistema ARCHITECT calcula a RLU de corte a partir da RLU média de três replicatas do Calibrador 1 e armazena o resultado. RLU de corte = RLU media do Calibrador x 0,25. O Sistema ARCHITECT calcula o resultado S/CO para cada amostra e controle da seguinte forma: S/CO = RLU da Amostra/RLU do Valor de Corte 11.3 Critérios de aceitação Os controles devem apresentar valores aceitáveis segundo o intervalo de confiança especificado pela bula do fabricante, para a liberação dos demais resultados. 12. Valores de referência Soro Não Reagente 13. Valores críticos Não se aplica. 14. Especificações de desempenho
7 POP n.º: I 111 Página 7 de Precisão: segundo o fabricante, o ensaio foi desenvolvido para ter imprecisão de 10% do CV total para amostras com S/CO entre 1,00 e 6,00 S/CO Sensibilidade: segundo o fabricante, a capacidade de detecção do ensaio foi de 100% (406/406), com intervalo de confiança de 95%: 99.10% - 100% em 406 amostras. Na comparação, feita pelo laboratório, frente o método ELISA houve concordância de 100% Especificidade: a especificidade foi de 99,5% entre doadores de sangue e de 99,00% entre pacientes hospitalizados Interferência: Em um de 260 amostras contendo anticorpos antinúcleo, EBV, HBV, HCV, HIV, HSV, T. gondii, anti-treponema pallidum, positivas para fator reumatóide e de indivíduos vacinados contra a gripe, doença hepática não-viral e infecção por levedura e de multíparas, os resultados obtidos foram os mesmos encontrados no método comparativo. Não foram observadas interferências em amostras e controles experimentais com altos níveis de bilirrubina (20 mg/dl), triglicérides (3000 mg/dl), proteínas ( g/dl), hemácias (0.4% v/v) ou hemoglobina ( 500 mg/dl). 15. Fontes potenciais de variabilidade Degradação e/ou contaminação de reagentes e amostras. Anticoagulante líquidos podem ter efeito de diluição resultando em concentrações mais baixas nas amostras. O sistema ARCHITECT não tem capacidade de diferenciar o tipo de amostra. As amostras devem ser testadas dentro de 3 horas após colocação no equipamento. Amostras descongeladas devem ser homogeneizadas em vertes (baixa velocidade) ou por inversão de 10 vezes e depois de centrifugadas a 1000 rpm por 10 minutos. Para obter resultados exatos, as amostras de soro e plasma não devem conter fibrina, glóbulos vermelhos e demais partículas em suspensão. Amostras de soro de pacientes em terapia anticoagulante ou trombolítica podem conter fibrina devido à formação incompleta do coágulo. Em amostras lipêmicas que após a centrifugação apresentam a camada lipídica separada na superfície, transferir a camada clarificada para outro tubo para o processamento. 16. Limitações do método Anticorpos heterófilos em soro humano podem reagir com imunoglobulinas reagentes, interferindo com imunoensaios. Pacientes expostos rotineiramente a animais ou a produtos à base de soro de animais são propensos a esta interferência e valores anômalos podem ser observados. Informações adicionais podem ser necessárias para o diagnóstico.
8 POP n.º: I 111 Página 8 de 8 Não foi estabelecida validade do teste em uso de amostras de cadáver ou fluidos biológicos (urina, saliva, sêmen, LCR e líquido amniótico). Amostras turvas devem ser previamente centrifugadas x g por 10 minutos. Amostras tratadas com calor, lipêmicas, com forte hemólise ou contaminação microbial evidente não devem ser testadas. Se os resultados do ensaio forem inconsistentes com a evidência clínica, testes adicionais são sugeridos para confirmar o resultado. 17. Interpretação dos resultados Amostras com valores S/CO 1,00 são consideradas reagentes. Amostras com valores S/CO no índice de 0,000 a 1,000, são consideradas não reagentes. 18. Biossegurança Obedecer às normas de segurança vigentes no laboratório e usar equipamentos de proteção individual. 19. Anexos Planilhas do controle de qualidade 20. Bibliografia Bula do teste.
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