UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS Desenvolvimento de Marcadores Moleculares para Determinação da Origem Sexual e Racial de Produtos Cárneos Relatório final apresentado ao PIBIC CNPq. Orientada: Aline Silva Mello Cesar Orientador: Flávio Vieira Meirelles Pirassununga SP Agosto de 2005

2 RESUMO Com o aparecimento de doenças como a encefalite espongiforme bovina ( vaca louca ) e outros problemas sanitários, os países da comunidade européia e outras regiões do mundo passaram a exigir a rastreabilidade dos produtos de origem animal. Nesse sistema, várias características são importantes, como o sexo, a idade, a raça e/ou a composição racial dos animais, além de dados da cadeia produtiva. Em geral, a empresa cerftificadora dispõe das informações do animal que está sendo abatido, porém não tem condições de garantir se houve erro entre abate, desossa, processamento e a distribuição dos produtos. Existe diferenciação no custo e na qualidade dos produtos cárneos, especialmente no mercado internacional, em virtude do sexo e composição racial dos animais, no entanto, após o abate torna-se difícil e complexo determinar estas características. Pretende-se neste projeto utilizar marcadores moleculares que permitam aferir parâmetros rastreados pelo programa de certificação da carne bovina como: o sexo e a composição racial dos animais abatidos, visando a correta identificação e valorização do produto final para o consumidor. Palavras-chave: rastreabilidade, marcador molecular, carne bovina, raça e sexo. ABSTRACT Lately, beef cattle and other species have been presenting several diseases as BSE (bovine encephalopathy spongiform), among others, which have caused concern on consumers mind about food security. So, in order to guarantee food safety, consumers are demanding traceability for all food products. Several characteristics are important in a traceability system, such as, age at slaughter, breed and or racial composition, besides information on the productive chain. In general, the certification agent keeps information about the animals and the system which it came from, although cannot guarantee that the process including slaughter, processing and distribution of the products can be fool proof. Besides, there is a price differential, at least at the international

3 market, based on sex and breed composition of the animals. These characteristics are very complex and difficult for controlling. The objective of this work was the utilization of molecular markers which allow the checking up of characteristics controlled in the beef cattle traceability program, as sex and breed composition, in order to correctly identify and appraise the final product for the consumer. Key words: traceability, molecular markers, beef, breed and sex.

4 SUMÁRIO Lista de Figuras...5 Lista de Abreviaturas...6 Introdução...7 Objetivo...12 Material e Métodos...12 Resultados e Discussão...15 Conclusões...22 Referências...24

5 5 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Esquema da rastreabilidade...7 Figura 2: (A) Gado Zebu e (B) Gado europeu...8 Figura 3: Reação em cadeia da polimerase...9 Figura 4: Esquema de extração de DNA a partir de amostras de carne...13 Figura 5: Foto representativa de padrões para fêmeas e machos...16 Figura 6: Freqüência de carne de fêmeas e machos do mercado da cidade de Pirassununga...16 Figura 7: Representação mtdna Bos indicus e Bos taurus...17 Figura 8: Freqüência de mtdna das amostras obtidas na cidade de Pirassununga...18 Figura 9: Representação stdna, padrões A,B e AB...19 Figura 10: Freqüência de stdna das amostras obtidas na cidade de Pirassununga...19 Figura 11: Representação dos padrões de genótipo do marcador LHR...20 Figura 12: Freqüência dos genótipos das amostras obtidas na cidade de Pirassununga segundo o marcador do gene LHR...21 Figura 13: Associação dos resultados dos marcadores moleculares...22

6 6 LISTA DE ABREVIATURAS DNA Ácido Desoxiribonucléico EDTA Àcido Etileno Diamino Tetra Acético LHR Receptor do Hormônio Luteinizante mtdna DNA mitocondrial PCR Reaction Chain Polymerase (Reação em Cadeia da Polimerase) RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) RNA Ácido ribonucléicotaq DNA DNA polimerase isolada da bactéria Thermus aquaticus stdna DNA satélite SSCP Polimorfismo Conformacional de Fita Simples TBE Tris Borato EDTA

7 7 Introdução Com o aparecimento de doenças como a encefalopatia espongiforme bovina (vaca louca) e outros problemas sanitários, os países da comunidade européia e outras regiões do mundo passaram a exigir a rastreabilidade dos produtos de origem animal. A rastreabilidade é entendida como a capacidade de permitir, rapidamente e com confiança, o resgate do histórico de um produto e de seu processo de produção, atuando como o mecanismo fundamental na segurança alimentar da população (Figura 1). RASTREABILIDADE Campo Processamento Transporte Preparo Venda Armazenamento Figura 1: Esquema da rastreabilidade. Para o Brasil, detentor do maior rebanho bovino comercial do mundo, com mais de 180 milhões de cabeças, e índices crescentes de produtividade, é fundamental garantir a sustentabilidade do segmento. Assim, a rastreabilidade torna-se a chave para que possa alcançar e manter a competitividade nesse mercado quantitativo, altamente exigente e concorrido (VICTORELLI NETO, 2004).

8 8 Nesse sistema de rastreamento, várias características são importantes, como o sexo, a idade, a raça e/ou a composição racial dos animais, além de dados da cadeia produtiva. Em geral, a empresa certificadora dispõe das informações do animal que está sendo abatido, todavia, não tem condições de garantir que não houve erros entre o abate, desossa e a distribuição dos produtos. Neste sentido tenta-se desenvolver metodologias e técnicas que auxiliem a rastreabilidade e que certifique as características dos produtos, assim, este trabalho abrange as características de subespécie (Bos taurus e Bos indicus) e do sexo do animal originário do produto cárneo. O Brasil é um dos mais importantes centros de criação e seleção de raças zebuínas, acreditando-se possuir um rebanho com 80% de composição genética de zebuínos (RIPAMONTE, 2002). O país comercializa sua carne bovina no mercado internacional a preços significativamente mais baixos quando comparados com outros países grandes exportadores como USA, Austrália e Argentina. Uma das razões é o fato de sua carne ser na sua quase totalidade oriunda de gado zebuíno. A própria Austrália no seu sistema de classificação de carcaças penaliza aqueles com mais de 25% de sangue zebu. As raças de bovinos domésticos podem ser classificadas em dois grupos, o europeu (Bos taurus) e o zebuíno (Bos indicus). Embora a nomenclatura clássica de Lineu considere esses grupos como espécies distintas, diversos autores têm sugerido que são subespécies (MANWELL; BAKER, 1980) (Figura 2). A B Figura 2: (A) Gado Zebu e (B) Gado europeu.

9 9 Com os avanços no campo da biologia molecular e o desenvolvimento da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) no início dos anos 80, que consiste em ser uma técnica in vitro que reproduz a característica natural de replicação do DNA, e a descoberta de marcadores moleculares, têm sido possível a identificação mais precisa entre esses grupos. PCR se constitui hoje no método de rotina para isolar rapidamente seqüências específicas a partir de uma mistura complexa de seqüências genômicas ou de cdnas (Figura 3), com o desenvolvimento da técnica de PCR novos procedimentos surgiram como RFLP (do inglês, Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição ou RFLP são resultados da presença de variações nas seqüências de DNA que criam ou eliminam sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição. A principal vantagem da análise de polimosfirmos de restrição utilizando PCR-RFLP é a possível identificação de indivíduos homozigotos e heterozigotos. E ainda RFLP permite a identificação de diferenças entre indivíduos quanto ao número e posição dos sítios de restrição em uma determinada molécula de DNA. Endonucleases de restrição são enzimas que cortam a molécula de DNA de uma maneira dependente de seqüência segundo a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), (2001). Figura 3: Reação em cadeia da polimerase.

10 10 Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR. A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers). Oligonucleotídeos com 20 pares de bases são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano.o pareamento dos primers com a seqüência alvo na amostra se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional: A T C G Já foram identificados polimorfismos na seqüência do DNA mitocondrial (mtdna) entre as raças B. taurus e B. indicus, assim como em regiões menos variáveis, como RNAs transportadores (PEGORARO et al., 1995). A herança dos genes contidos na mitocôndria é exclusivamente materna nos mamíferos (GILES et al., 1980). Meirelles et al. (1999) conduziram um trabalho com a hipótese de que genes citoplasmáticos portem polimorfismos entre animais. Os resultados obtidos confirmaram que uma grande proporção do zebu americano é originado do cruzamento de fêmeas de origem taurina, portadoras de DNAmt europeu, com machos de origem do sub-continente indiano portadores de DNAmt do B. indicus. Portanto, faz-se necessária a utilização de marcadores nucleares na identificação da origem do animal. Desde a descoberta de regiões repetitivas do DNA (MIESFELD et al., 1981), loci altamente polimórficos vem sendo descritos em diversas espécies (FRIES et al., 1990). Mais recentemente, foi observado uma variação em um satélite da região centromérica que introduz um sítio de restrição em parte das seqüências de animais B. indicus (RIPAMONTE, 2001; NIJMAN et al. 1999). Atualmente diversos outros marcadores são reconhecidamente polimórficos entre animais Bos taurus e Bos indicus. O gene do receptor do hormônio lueinizante (LHR) contém um destes polimorfismos. Obtido pó SSCP (Polimorfismo conformacional de fita simples) este gene encontra-se no cromossomo 11 e o seu sequenciamento revelou uma mutação pontual na

11 11 posição 1328, traduzida por uma troca de bases nucleotídicas citosina (C) por timina (T), que foi posteriormente confirmada por digestão com a enzima de restrição HhaI ( MARSON, 2005). Com a utilização desta foram observados três genótipos TT, CT e CC, que em Nelore especificamente foi observada uma predominância do alelo T (0,755 para o T contra 0,245 para o C) (MILAZZOTTO, 2001). Outra característica avaliada num produto cárneo é o sexo do animal que o originou. No Brasil observa-se diferença quanto ao valor pago ao produtor da arroba de carne de fêmea e de macho (R$ 62,40/@ para machos e R$ 54,00/@ para fêmeas, média dos últimos 10 anos segundo Anual Pec, 2004). O Brasil abateu em % do seu rebanho total sendo 45% de fêmeas, aproximadamente 19 milhões de fêmeas (Anual Pec, 2004).) Estudos de sexagem por DNA são corriqueiros em trabalhos envolvendo embriologia e cultivo de células. Assim, por meio da utilização de marcadores genéticos do cromossomo Y e marcadores aleatórios em cromossomos não sexuais é possível determinar o sexo do animal através do produto. A amelogenina constitui a mais abundante classe de proteínas responsáveis pela formação do esmalte dos dentes. O gene da amelogenina está localizado, exclusivamente para bovinos e humanos, nos cromossomos X e Y (GIBSON et al., 1991). Existem duas classes distintas de cdna classe I e classe II que são produtos dos genes localizados no cromossomo X e Y, respectivamente (GIBSON et al.,1991,1992). Quando se amplifica uma seqüência do gene da amelogenina é possível diferenciar machos e fêmeas, ou seja, o cromossomo X e Y, ao mesmo tempo, utilizando-se apenas um par de oligonucleotídeos. Durante uma amplificação desta seqüência por PCR observa-se duas bandas bem diferenciadas, uma proveniente da amplificação do gene de classe I e outra do gene de classe II. Diferencia-se o produto da amplificação do gene da classe I (cromossomo X) e classe II (cromossomo Y) devido uma deleção de 67 pares de base (pb) no gene amelogenina classe II (RAMALHO, 2003).

12 12 A partir desta particularidade do gene da amelogenina é possível caracterizar a origem de um produto cárneo quer seja de origem de um animal macho ou fêmea, a partir do DNA extraído deste produto. Objetivos 1. Identificar a subespécie e o sexo nas amostras de carne bovina por marcadores moleculares PCR-RFLP. 2. Testar a freqüência destes marcadores em amostras de produtos cárneos obtidos no mercado da cidade de Pirassununga - SP. Material e Métodos Amostras. Foram coletadas na cidade de Pirassununga 27 amostras de músculo bovino, entre eles: (Longissimus dorsi), Lagarto (Semitendinosus) e Coxão-duro (Biceps femoris) de diferentes pontos comerciais (10 pontos de venda), e solicitada a informação quanto ao sexo destas amostras das quais o DNA foi extraído. Extração do DNA. Cerca de 0,2 g de músculo foram pesados e macerados em almofariz de 80 ml com a utilização de Nitrogênio líquido. Às amostras foram adicionados 800 µl de solução tampão proteinase K (Tris HCl (ph 8.0), EDTA, NaCl e água ultrafiltrada) e incubadas com proteinase K por 3 horas à 55ºC, seguido por precipitação de proteínas com solução de NaCl 5M. O sobrenadante foi precipitado com adição de 2 volumes de acetato de amônio 3 M e 3 volumes de etanol absoluto, e lavado com etanol 70%.Ao pellet foi adicionado 50µL de água ultrafiltrada e diluídoà 37ºC por 2 horas (Figura 4) de acordo com o protocolo descrito por Biase et al. (2002).

13 13 Digestão com Proteinase K Precipitação com NaCl 2 Adição Etanol Absoluto Amostra de DNA Figura 4: Esquema de extração de DNA a partir de amostras de carne. Quantificação do DNA. A concentração de DNA de cada amostra foi medida por espectrofotometria utilizando-se uma diluição de 5 µl de amostra : 45 µl de água ultrafiltrada. A leitura da absorbância foi realizada a 260 e 280 nm e verificada a relação de proteína/dna. Avaliação do sexo. PCR multiplex com dois pares de oligonucleotídeos, um que amplifica uma seqüência de 210 pb (primer 1), específica do cromossomo Y bovino (Bondioli et al.,1989), e outro que amplifica uma seqüência de 280 pb (primer 2), de um cromossomo autossômico (Ellis & Harpold, 1986, 1988; Ellis et al., 1988). Foram utilizados 100 ng de DNA para uma reação de 25 µl contendo 0,2 mm de cada dntp, 1,25 U de Taq DNA polimerase e 0,2 µm de cada oligonucleotídeo iniciador. A PCR foi realizada no Termociclador PTC 100 M.J.Research, (Inc. Waltham, M.A. USA) em 40 ciclos de desnaturação a 94 C por 60 segundos, anelamento a 58 C por 30 segundos e extensão a 72 C por 60 segundos. A eletroforese dos fragmentos foi realizada em gel de agarose 2,5% contendo brometo de etídeo em TBE 1X e os fragmentos amplificados foram visualizados utilizando o scanner laser Fuji FLA 3000G. As amostras foram analisadas de acordo com a presença ou ausência da banda de 210 pb característica do cromossomo Y específico. Primer 1 5 CCT CCC CTT GTT CAA ACG CCC GGA ATC ATT 3 5 TGC TTG ACT GCA GGG ACC GAG AGG TTT GGG 3

14 14 Primer 2 5 AGG TCG CGA GAT TGG TCG CTA GGT CAT GCA 3 5 AAG ACC TCG AGA GAC CCT CTT CAA CAC GT 3 Avaliação do DNA Mitocondrial (mtdna) PCR-RFLP (Reação em Cadeia da Polimerase-Polimorfismo baseado no tamanho do fragmento de restrição). Foi realizada a amplificação por PCR do mtdna utilizando-se os primers BosmtF1 5 - CCC AAC GAG GAA AAT ATA CC 3 e Bosmt R1 5 AAC CGC AAA CAA CCT CTT CC 3 que flanqueiam uma região do gene ND5 do genoma mitocondrial dos nucleotídeos ao de acordo com Anderson et al. (1982). Para reação de PCR utilizou-se 100 ng de DNA para uma reação de 25 µl, 0,2 µm de cada dntp, 1,25 U de Taq DNA polimerase e 0,2 mm de cada oligonucleotídeo iniciador (primer) em 35 ciclos de 30 segundos à 94 o C, 45 segundos à 58 o C e 45 segundos à 72 o C. O fragmento de mtdna amplificado foi digerido com a enzima de restrição Hind III e submetido a eletroforese em gel de agarose 1,5% contendo brometo de etídeo em TBE 1X. As amostras foram analisadas de acordo com a presença ou ausência do sítio de restrição da enzima Hind III, os indivíduos foram classificados como portadores de mtdna de B.taurus ou portadores de mtdna B. indicus. Avaliação da subespécie DNA satélite (stdna) por PCR-RFLP. No intuito de identificar a presença de alelos B. taurus em um animal, foi amplificada uma região satélite (stdna) denominada 1711b, localizada na porção centromérica e equivalente a 7.1% do genoma bovino (Streeck, 1981). Para reação de PCR foram utilizados 100 ng de DNA para uma reação de 25 µl, 0,2 mm de cada dntp, 1,25 U de Taq DNA polimerase e 0,2 µm de cada oligonucleotídeo iniciador (primer) em 35 ciclos de 15 segundos à 94 o C, 45 segundos à 62 o C e 60 segundos à 72 o C. Foram empregados os seguintes primers: F: 5 ATGAGGAAGGAGGCTCGGCA 3 e R: 5 TGATCCAGGGTATTCGAAGGA 3 para amplificação da 1711b. Os fragmentos resultantes foram digeridos com a enzima de restrição Msp I, que cliva em somente um sítio parte dos satélites de origem B. indicus. Após a digestão dos produtos de PCR, os fragmentos do DNA foram corados com brometo de etídeo

15 15 (0,5 µg/ml) e separados em gel de agarose 2,5% em TBE 1X e visualizado em scanner laser Fuji FLA 3000G. Avaliação da subespécie utilizando o marcador LHR por PCR-RFLP. É um marcador localizado na região codificadora do receptor do hormônio luteinizante (LHR) (SOUMANO et al., 1998) que possui alelos Bos indicus ou Bos taurus específicos. A amplificação do gene LHR foi realizada utilizando-se os primers F 5 CAAACTGACAGTCCCCCGCTTT 3 e R 5 CTCCGAGCATGACTGGAATGGC 3. Para a reação de PCR foi utilizado aproximadamente 120 ng de DNA para uma reação de 25 µl, contendo 0,2 µm de cada dntp, 0,5 U de Taq DNA polimerase e 0,2 mm de cada oligonucleotídeo iniciador em 32 ciclos de 1 minuto à 94º C, 30 segundos à 58º C e 1 minuto à 72º C. O fragmento amplificado foi digerido com a enzima de restrição HhaI e submetido a eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo em TBE 1X e avaliado utilizando o scanner de fluorescência Fuji FLA 3000G (Fuji Film). Resultados e Discussão Amostras, extração e quantificação do DNA A partir do protocolo para extração de DNA de músculo bovino obteve-se bons resultados de extração, os quais foram verificados pela leitura em espectrofotômetro a 260 nm. E ainda avaliou-se a relação DNA/proteína que resultou em média 1,65. Avaliação do sexo A partir da pesquisa realizada com os vendedores em cada ponto de venda da cidade de Pirassununga quanto ao provável sexo das amostras, verificou-se pelas informações prestadas que 100% da carne era oriunda de animais machos.

16 16 A avaliação do resultado da PCR em gel de agarose 2,5% após visualização em scanner, permitiu observar dois padrões. Um padrão representado por fêmeas onde não se observa a banda de 210 pb específico do cromossomo Y e outro padrão onde observa-se duas bandas um de um cromossomo autossômico bovino (280 pb) e outra específica do cromossomo Y (210 pb), como observa-se na figura 5. M F 280 pb 210 pb Figura 5: Foto representativa de padrões para fêmeas e machos. Diferentemente do resultado da pesquisa, as análises moleculares do DNA extraído mostraram que 41% das amostras eram proveniente de fêmeas e 59% de machos (Figura 6). Frequência de machos e fêmeas (%) Fêmea sexo Macho Figura 6: Freqüência de carne de fêmeas e machos do mercado da cidade de Pirassununga SP.

17 17 Avaliação do mtdna Os resultados foram avaliados quanto aos padrões de bandas representados em gel de agarose visualizado em scanner. Aquele que apresentou duas bandas (possui sítio de restrição para enzima Hind III), foi considerado animal com mtdna B. taurus e aquele representou apenas uma banda foi considerado com mtdna B. indicus (Figura 7). Obteve-se como resultado uma freqüência de 100% das amostras apresentando sítio de restrição da enzima Hind III, caracterizando mtdna B. taurus (Figura 8), apesar da grande maioria do rebanho brasileiro ser originário de gado zebu esperava-se encontrar grande parte das amostras de animais com mtdna B. taurus. Podendo ser explicado pelo fato de que durante a formação das raças zebuínas brasileiras, as linhas maternas de B. taurus tiveram grande participação, sendo demonstrado pela contribuição majoritária do genoma mitocondrial desta subespécie (MEIRELLES et al, 1999). φx B. indicus B. taurus Figura 7: Representação mtdna Bos indicus e Bos taurus.

18 18 Frequência de mtdna B.taurus e B. indicus (%) B. taurus B. indicus Subespécie Figura 8: Freqüência de mtdna das amostras obtidas na cidade de Pirassununga. Avaliação do stdna A amplificação do stdna das amostras apresentou 3 padrões de digestão distintos (A caracterizando animais Bos indicus, B - caracterizando animais Bos indicus e/ou Bos taurus e AB - caracterizando animais Bos indicus ou mestiços). Para animais possivelmente B. indicus, verificou-se a presença de um sítio de restrição da enzima Msp I homogeneamente distribuído em todos os fragmentos satélites, dois sítios de restrição homogeneamente distribuído em todos os fragmentos satélites ou os dois padrões de restrição heterogeneamente distribuídos (RIPAMONTE, 2002) (Figura 9). A partir das amostras avaliadas verificou-se que a maioria (55,5%) destas eram oriundas de animais com stdna padrão B (Bos indicus e/ou Bos taurus ou mestiços) (Figura 10). Porém para que se possa confirmar a origem do animal individualmente é preciso a utilização de outros marcadores moleculares. Foi observado um aumento de 20% da freqüência de alelos B na população quando comparado a Ripamonte (2002) que trabalhou com animais Bos indicus. Este aumento na freqüência é indicativo da presença de carne originada de animais Bos taurus ou mestiços.

19 19 φx ND A B AB a Figura 9: Representação stdna, padrões A,B e AB. Frequência do stdna (%) A B AB Padrões de stdna Figura 10: Freqüência de stdna das amostras obtidas na cidade de Pirassununga. Avaliação do LHR A amplificação do gene LHR das amostras e sua digestão com a enzima de restrição HhaI (reconhece o sítio de restrição GCGC, presente no alelo C, mas ausente no alelo T) apresentou 3 padrões de genótipos: TT homozigoto, que não foi digerido pela enzima, apresentando um fragmento de 303 pb; CT heterozigoto, digerido pela enzima, apresentando dois fragmentos, um de 303 pb

20 20 e outro de 155/148 pb; e CC homozigoto, que apresenta um fragmento de 155/148 pb, demonstrado na Figura pb TT CT CC Figura 11: Representação dos padrões de genótipo do marcador LHR. 50 pb marcador de peso molecular; TT (303 pb); CC (155/148 pb) e CT (303 pb e 155/148 pb). As amostras analisadas neste trabalho apresentaram maior freqüência do alelo T (0,54) em relação ao alelo C (0,46), o mesmo observado por Milazzotto (2001), porém com freqüências encontradas em animais da raça Nelore pura de 0,755 para o alelo T e 0,245 para o alelo C. A mesma autora, assume que genótipo TT é característico de animais Bos indicus, uma vez que o genótipo CC foi identificado em fêmeas de Limousin na freqüência de 100% (n=10) e por estar presente na seqüência depositada no Genbank. Diante disto, é possível dizer que as amostras de carne analisadas são em sua maioria provenientes de animais mestiços onde se encontrou maior número de indivíduos heterozigotos (CT) (Figura 12).

21 21 Frequência do gene LHR TT CT CC Padrões de genótipo segundo gene do LHR Figura 12: Freqüência dos genótipos das amostras obtidas na cidade de Pirassununga segundo o marcador do gene LHR. Associando-se o resultado do gene do LHR ao resultado da sexagem observamos que existe uma maior freqüência do alelo C em fêmeas (0,55), caracterizando animais com composição racial maior de Bos taurus em relação aos machos (0,41), sendo uma característica de vacas leiteiras. Os resultados envolveram análise pela estimação das freqüências alélicas e genotípicas, respectivamente, por contagem dos diferentes genótipos para cada loco estudado (WEIR, 1996). Considera-se uma população em equilíbrio de Hardy-Weinberg quando as freqüências alélicas (p e q) e genotípicas (p 2, 2pq e p 2 ) permanecem constantes de uma geração a outra em acasalamentos ao acaso. A probabilidade de equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) associada às freqüências genotípicas observadas foi obtida pelo teste exato de probabilidade, o Qui-Quadrado, para cada composição racial estudada. Considerando-se como hipótese H 0 que a população encontra-se em equilíbrio HW, com probabilidade de 5%, verificou-se que a população analisada a partir das amostras de carne coletadas na cidade de Pirassununga encontra-se em equilíbrio de HW.

22 22 No. Amostra mtdna stdna Sexo LHR 1554 B.taurus AB M TT 1555 B.taurus B F CC 1556 B.taurus B F CC 1557 B.taurus B F CT 1558 B.taurus A M CT 1559 B.taurus B M TT 1560 B.taurus A + B F TT 1561 B.taurus AB + M CC 1562 B.taurus B M CT 1563 B.taurus AB + M CT 1564 B.taurus B M CC 1565 B.taurus B M TT 1566 B.taurus B F TT 1567 B.taurus AB + F CC 1568 B.taurus B F CT 1569 B.taurus B M CT 1570 B.taurus A + B M CT 1571 B.taurus A + B M TT 1572 B.taurus A + B M TT 1573 B.taurus B M CT 1574 B.taurus B F CT 1575 B.taurus B F CT 1576 B.taurus A + B M CT 1577 B.taurus A + B M CT 1578 B.taurus B M CT 1579 B.taurus B M CT 1580 B.taurus B M CT Figura 13: Associação dos resultados dos marcadores moleculares. Na figura 13 foram descritos todos os resultados dos marcadores utilizados, verificando serem bastante complementares. Conclusão Com os resultados obtidos até o momento foi verificado a viabilidade da metodologia desenvolvida, podendo esta ser considerada como um recurso auxiliar para a rastreabilidade da carne bovina.

23 23 Foi também estimado que grande parte dos produtos comercializados na região da cidade de Pirassununga, é oriundo de fêmeas e de um grupo de animais com representantes das categorias mestiços ou Bos taurus. Para maiores afirmações quanto à composição racial dos animais é preciso a associação de um maior número de marcadores moleculares ou até mesmo a utilização de técnicas como PCR em tempo real que possibilitará obter a freqüência dos alelos analisados.

24 24 REFERÊNCIAS EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA. Embrapa Pecuária Sudeste. Biologia molecular aplicada à produção animal. Editores técnicos: Luciana Correia de Almeida Regitano, Luiz Lehmanm Coutinho. Brasília: Embrapa Informação Tecnológia, p. ISBN: BIASE, F.H.; FRANCO, M.M.; GOULART, L.R.; ANTUNES, R.C. Protocol for extraction of genomic DNA from swine tissues. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v.25, 3, p , FRIES, R.; EGGEN, A.; STRNZINGER, G. The bovine genome contains polymorphic microsatellites. Genomics, Orlando, v. 8, p , GEORGES, M.; MASSEY, J.M.. Polymorphic DNA markers in Bovidae. Patent WO 92/13102, GIBSON, C. et al. Structure and expression of the bovine amelogenin gene. Biochemistry, Washington, v. 30, p ,1991. GIBSON, C. et al. Bovine amelogenin message heterogeneity: alternative splicing and Y-chromossomal gene transcription. Biochemistry, Washington, v. 31, p , GILES, R. E., BLANC, H. et al. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: , MANWELL, C.; BAKER, C.M.A. Chemical classification of cattle: 2. Phylogenetic tree and specific status of the Zebu. Animal and Blood Groups. Biochemical Genetics, Nova York, v. 11, p , MARSON, E.P. Caracterização da freqüência de heterozigose em genes ligados à precocidade sexual em novilhas de corte compostas p. 87. Tese (Doutorado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Pirassununga,2005. MEIRELLES, F.V, GARCIA, J.M. et al. The American Zebu is really Bos indicus?.genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 22 (4), p , 1999.

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