MILTEFOSINA EXERCE SUA AÇÃO LEISHMANICIDA ATRAVÉS DO RECEPTOR DE PAF

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1 Waldionê de Castro MILTEFOSINA EXERCE SUA AÇÃO LEISHMANICIDA ATRAVÉS DO RECEPTOR DE PAF Ouro Preto Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas

2 Waldionê de Castro MILTEFOSINA EXERCE SUA AÇÃO LEISHMANICIDA ATRAVÉS DO RECEPTOR DE PAF Dissertação apresentada ao Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte das exigências para obtenção do grau de Mestre. Orientadora: Professora D ra Leda Q. Vieira Ouro Preto /

3 C355m Castro, Waldionê de. Miltefosina exerce sua ação leishmanicida através do receptor de PAF [manuscrito] / Waldionê de Castro f.: il., color; graf., mapas. Orientadora: Profa. Dra. Leda Quercia Vieira. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunobiologia de protozoários. 1. Leishmaniose visceral - Teses. 2. Leishmania donovani - Teses. 3. Fator ativador de plaquetas - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br 3

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5 Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia ICB/UFMG e obteve auxílio dos seguintes órgãos financiadores: - FAPEMIG Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior - CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 5

6 DEDICATÓRIA A todos que acreditaram em mim e tinham certeza que eu era capaz, até quando eu mesmo duvidei. 6

7 AGRADECIMENTOS Agradeço a minha orientadora, Professora Leda Q.Vieira, por me aceitar em seu laboratório, mesmo não tendo nenhuma experiência com pipetas, meios, células e tantas outras coisas importantes para realização deste trabalho. Obrigado por acreditar em mim, por apostar na minha capacidade, por me incentivar a estudar novamente. Sou muito grato por todos os conselhos e orientações e ainda mais por todo carinho comigo. Obrigado por me mostrar que existem pessoas reais e verdadeiras fazendo pesquisa. Agradeço ao Professor Luis Carlos Crocco Afonso pelos conselhos, orientações e pelas discussões. Obrigado por abrir as portas de seu laboratório e me permitir conviver com todos do Lip. Agradeço a Professora Maria Norma de Melo por me receber tão bem em seu laboratório e por sempre estar disposta a tirar minhas dúvidas com muita sabedoria e humildade. Também por ter sempre me salvado quando todas as culturas de Leishmania pareciam estar quase no fim. Agradeço ao Professor Wagner Tafuri pela paciência, vontade de ajudar e pelos conselhos. Agradeço ao Professor Ricardo Gonçalves pela disposição de ensinar e colaborar em meus experimentos. Agradeço a Professora Maria de Fátima Martins Horta por compartilhar seus equipamentos. Gostaria de agradecer a todos os professores das disciplinas que cursei no NUPEB pela vontade de ensinar e dividir conosco suas experiências. Agradeço a todos os amigos que fiz em Ouro Preto, pela acolhida, pela colaboração e cumplicidade nestes dois anos.. Aos meus queridos amigos do LAGI, gostaria de agradecer a todos vocês por me receber tão bem, por me aceitar e me respeitar em todos os nossos dias de convivência. Mesmo naqueles dias em que tudo parece que vai desabar sobre nossas cabeças. Meus primeiros passos no laboratório foram guiados por Daniel Manzoni que sempre me explicou tudo com muita didática e paciência. Ele me 7

8 mostrou que na pesquisa nem tudo é transtorno obsessivo compulsivo e que repetição faz parte do protocolo. Lili, Eric, Hassan, Juan, Magda, Paulinha, Caio, Leonardo, Everton, Clarinha e aos colegas da odonto obrigado a todos vocês por fazerem do laboratório um ambiente tão alegre, divertido, engraçado e leve. É bom saber que posso contar com vocês sempre que preciso. Obrigado aos queridos Matheus e Louisa. Vocês são meu porto seguro no laboratório. Em todos os momentos vocês estiveram dispostos a me ajudar, aconselhar, explicar. Explicar outra vez e mais uma se necessário. E sempre foi! Sabe aquele ensinamento sobre determinada hora durante o experimento? Bem ainda estou tentando aprender a hora certa para fazer o certo. Obrigado Yuri pelo seu esforço em manter sempre as coisas prontas e arrumadas, pela sua calma e disposição, além da parceria inestimável. Aos meus amados e queridos pais, Waldir e Alva, por todo carinho e amor incondicionais. Vocês nunca mediram esforços para realizar vontades e desejos. Vocês sempre fizeram além das necessidades. Obrigado por tudo que me ensinaram através de seus exemplos e espero conseguir retribuir toda esta dedicação. Ao meu irmão e toda a "tropinha de elite" pelas palavras de incentivo e por me dar tanta alegria e amor. A todos os familiares que sempre torceram para "tudo dar certo". Aos meus queridos amigos Breno, Cris, Jana e Túlio que souberam esperar, entenderam minhas prioridades e mantiveram sua confiança em mim. 8

9 Resumo A leishmaniose visceral, que pode ser causada pela Leishmania donovani, L. infantum e L. chagasi, é considerada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) um dos seis principais problemas de saúde pública mundial, sendo fatal se não for tratada. A miltefosina (hexadecilfosfocolina), que primeiramente foi utilizada como tratamento em pacientes com câncer, vem sendo utilizada como uma droga oral efetiva na leishmaniose visceral. Existe uma semelhança estrutural entre a miltefosina e o fator de ativação de plaquetas (PAF). O PAF age ligando-se ao receptor de PAF (PAFR) presente nas células alvo. O mecanismo pelo qual a droga atua ainda não está bem estabelecido, nossa hipótese é que devido à semelhança estrutural entre PAF e a droga, a miltefosina utilize o receptor de PAF para se ligar à célula. Para testar esta hipótese utilizamos camundongos selvagens e deficientes no PAFR (PAFR-KO). Inicialmente verificamos que macrófagos de camundongos selvagens e de PAFR-KO apresentaram perfil de infecção semelhante quando infectados com L. donovani. Em seguida iniciamos os experimentos com infecções in vitro que revelaram que macrófagos de camundongos selvagens tratados com miltefosina eram mais eficientes no controle do crescimento dos parasitos que macrófagos de camundongos PAFR-KO. Entretanto, o tratamento com miltefosina não provocou a produção de quantidades significativas de óxido nítrico (NO), o que pode indicar um mecanismo citotóxico independente de NO. Ao avaliar a ação da droga sobre a atividade da enzima arginase percebemos que somente com a droga não há alteração da atividade da enzima, mas em associação com IFN-γ e LPS ocorre diminuição de sua atividade. Verificamos que a infecção in vivo com L. donovani não apresentou diferenças na suscetibilidade entre camundongos selvagens e PAFR-KO. Em experimentos in vivo, tratamos camundongos selvagens e PAFR- KO oralmente a partir do 14º dia após a infecção com L. donovani, durante sete dias consecutivos, em doses de 10 e 20mg/kg/dia. Nossos dados mostram que o tratamento de camundongos selvagens levou a uma redução na carga parasitária no fígado e baço destes animais. Interessantemente, camundongos PAFR-KO apresentaram maior carga parasitária nestes órgãos. Nossos resultados indicam que parte da ação leishmanicida da miltefosina é mediada pelo PAFR. Palavras-chave: Leishmaniose visceral Leishmania donovani miltefosina PAF. 9

10 Abstract Visceral leishmaniasis,that can be caused by Leishmania donovani, L. infantum and L. chagasi, is considered by the World Health Organization (WHO) one of six major public health problems worldwide and is fatal if untreated. Miltefosine (hexadecylphosphocolina), which was first used as treatment in patients with cancer, has been used as an effective oral drug in visceral leishmaniasis. There is a structural similarity between miltefosine and platelet activating factor (PAF). PAF acts by binding to the PAF receptor (PAFR) present in target cells. The mechanism by which the drug works is not well established, our hypothesis is that due to structural similarities between PAF and the drug, miltefosine uses the PAF receptor to bind to the cell. To test this hypothesis, we used wild type mice and mice deficient in PAFR (PAFR-KO). Initially we found that macrophages from wild type mice and PAFR-KO showed a similar profile of infection when infected with L. donovani. The in vitro infection experiments revealed that macrophages from wild type mice treated with miltefosine were more effective in controlling the growth of the parasites than macrophages from PAFR-KO mice. However, treatment with miltefosine did not induce the production of significant amounts of nitric oxide (NO), which may indicate a cytotoxic mechanism independent of NO. When assessing the effect of miltefosine on the activity of the enzyme arginase, our data showed that the treatment with the drug only did not alter the enzyme activity, but in combination with IFN-γ and LPS was capable of downregulate its activity. We found that the in vivo infection with L. donovani showed no differences in susceptibility between wild-type mice and PAFR-KO. We treated wild type mice and PAFR-KO orally from day 14 after infection with L. donovani for seven consecutive days at doses of 10 and 20mg/kg/day. Our data revealed that treatment of wild type mice led to a reduction in parasite load in the liver and spleen of these animals. Interestingly, PAFR-KO mice showed a higher parasite load in these organs. Our results indicate that part of the antileishmanial activity of miltefosine is mediated by the PAFR. Key words: Visceral leishmaniasis L. donovani miltefosina PAF 10

11 LISTAS DE FIGURAS Figura 1: Distribuição mundial da forma tegumentar de leishmaniose...16 Figura 2: Distribuição mundial da forma visceral de leishmaniose...16 Figura 3: Fórmula estrutural da miltefosina...22 Figura 4: Metabolismo da L-arginina...26 Figura 5: Miltefosina tem uma semelhança estrutural com o fator de ativação plaquetário (PAF)...26 Figura 6: Modelagem de demonstração da ligação da miltefosina e PAF ao receptor de PAF

12 LISTA DE GRÁFICOS 4.1 Macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO não apresentam diferenças na infecção por L. donovani A miltefosina apresentou menor efeito em macrófagos de camundongos PAFR-KO em relação a macrófagos de camundongos BALB/c selvagens infectados com L. donovani Verificação da atividade da arginase e produção de NO por macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO Curso de infecção com L. donovani em camundongos PAFR-KO e selvagens Curso de infecção com L. donovani em camundongos PAFR-KO e selvagens tratados com miltefosina

13 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS BSA: Soro albumina bovina C: Graus Celsius CO 2 : Gás carbônico g: Gravidade g: Grama H 2 SO 4 : Ácido sulfúrico IFN: Interferon Ig: Imunoglobulina IL-#: Interleucina inos: Óxido nítrico sintase indutível L: Litro LC: Leishmaniose cutânea LDC: Leishmaniose cutânea difusa LMC: Leishmaniose mucocutânea LPS: Lipopolissacarídeo LV: Leishmaniose visceral m: Metro µ: micro M: Molar RNAm: Ácido ribonucléico mensageiro NaCl: Cloreto de sódio NaHCO 3 : Bicarbonato de sódio NO: Óxido nítrico PAF: Fator de ativação plaquetário PBS: Salina tamponada com fosfato 0,1 M, ph 7,3 (Phosphate Buffered Saline) rpm: Rotações por minuto SBF: Soro bovino fetal STAT: Transdutores de sinal e ativadores de transcrição (Signal Transducers and Activators of the Transcription) TNF: Fator de necrose tumoral U: Unidades 13

14 SUMÁRIO Conteúdo 1 - INTRODUÇÃO...15 LEISHMANIOSES...15 LEISHMANIOSE VISCERAL MODELOS EXPERIMENTAIS...19 TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA...20 MILTEFOSINA...22 O FATOR DE ATIVAÇÃO DE PLAQUETAS (PAF) OBJETIVOS OBJETIVO GERAL: OBJETIVOS ESPECÍFICOS: MATERIAL E MÉTODOS ANIMAIS PARASITOS INFECÇÃO DE CAMUNDONGOS POR LEISHMANIA QUANTIFICAÇÃO DE PARASITOS OBTENÇÃO E INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS DOSAGEM DA ATIVIDADE DA ENZIMA ARGINASE DOSAGEM DE NITRITO ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS Macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO não apresentam diferenças na infecção por L. donovani A miltefosina apresentou menor efeito em macrófagos de camundongos PAFR-KO em relação a macrófagos de camundongos BALB/c selvagens infectados com L. donovani Verificação da atividade da arginase e produção de NO por macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO Curso de infecção com L. donovani em camundongos PAFR-KO e selvagens Curso de infecção com L. donovani em camundongos PAFR-KO e selvagens tratados com miltefosina DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS

15 1 - INTRODUÇÃO LEISHMANIOSES As Leishmanioses, causadas por protozoários parasitos do gênero Leishmania (família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida), são infecções encontradas em áreas tropicais e regiões subtropicais do mundo. Os parasitos são transmitidos por diferentes espécies de flebotomíneos (gêneros Phlebotomus e Lutzomyia), dependendo da localização no velho e no novo mundo. Dois estágios distintos de desenvolvimento do parasito são reconhecidos. As formas promastigotas, extracelulares, são encontradas e se multiplicam no trato digestório da fêmea do flebotomíneo e tem uma forma alongada e flagelo longo. Promastigotas são as formas infectantes. Estas se diferenciam em amastigotas, forma intracelular de células do sistema fagocitário mononuclear do hospedeiro vertebrado (Olivier e cols., 2005; Olivier e cols., 2005). Flebotomíneos fêmeas adquirem os parasitos quando se alimentam de sangue de hospedeiros mamíferos infectados. A queda de temperatura e aumento de ph levam à diferenciação da forma amastigota para a forma promastigota no trato digestivo do invertebrado. Assim, a infecção por Leishmania ocorre quando uma fêmea de flebotomíneo, ao realizar o repasto sanguíneo, inocula juntamente com sua saliva formas promastigotas metacíclicas de Leishmania sp (Bates, 2007). Espécies de Leishmania do velho Mundo, como L. Donovani, L. infantum e L. major, causam patologia do sul da Europa até a África, no Oriente Médio, e em todo sul da Ásia, enquanto espécies do Novo Mundo (por exemplo L. mexicana, L. Amazonensis, L. Braziliensis, L. guyanensis e L. chagasi) são encontradas em toda América do Sul e Central (Olivier e cols., 2005). 15

16 Figura 1: Distribuição mundial da forma tegumentar de leishmaniose. As áreas em vermelho sinalizam zonas endêmicas. WHO/CSR/EDC-UNAIDS Mapa: Public Health Mapping Group Communicable Diseases (CDS) World Health Organization, October Figura 2: Distribuição mundial da forma visceral de leishmaniose. As áreas em vermelho sinalizam zonas endêmicas. WHO/CSR/EDC-UNAIDS Mapa: Public Health Mapping Group Communicable Diseases (CDS) World Health Organization, October As leishmanioses tradicionalmente se dividem em três grandes grupos de acordo com aspectos clínicos: forma visceral, cutânea e mucocutânea (Evans, 1993). 16

17 A forma cutânea da doença causa ulcerações na pele no local da picada do flebotomíneo, usualmente em partes expostas do corpo como a face, pescoço, braços e pernas. A forma cutânea é causada por diversas espécies de Leishmania: L. Brazilienses, L. guyanensis, L. major, L. tropica, L. aethiopica, L. mexicana, L. panamensis, L. peruviana e L. amazonensis. Os indivíduos doentes geralmente curam-se clinicamente, mas o tempo de cura varia entre as espécies infectantes e indivíduos. A doença pode se difundir pela pele do hospedeiro, sendo então conhecida como leishmaniose cutânea difusa. Essa doença pode ser causada pelas espécies L. aethiopica, L. mexicana e L. amazonensis, porém só ocorre quando os hospedeiros têm baixa imunidade (Silveira e cols., 2004; Kedzierski e cols., 2006). Na leishmaniose mucocutânea, usualmente causada por L. brazilienses, a lesão inicial na pele pode se curar espontaneamente ou mais tarde podem desenvolver lesões com destruição parcial ou total de membranas mucosas. Indivíduos infectados e que apresentam desenvolvimento falho na resposta imunológica podem ter graves deformidades ou até mesmo morrer. A Leishmaniose Visceral Humana (LVH) é um grande problema de saúde pública mundial, estando entre as principais endemias de prioridade da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2002). Estima-se uma prevalência de 12 milhões de indivíduos infectados no Velho e Novo Mundo, sendo 500 milhões de casos anuais e 200 milhões de pessoas expostas ao risco de infecção (OMS, 2002). Cinco países merecem destaque, representando 90% dos casos, como a Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal e Sudão. No Brasil, é uma doença de caráter endêmico e zoonótico, estendo-se por todas as regiões, em especial o Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste. Predomina em zonas rurais com grande incidência em crianças (média de quatro a cinco anos de idade), mas nos últimos anos esse quadro está mudando. Tem sido verificada a urbanização da doença com ocorrência da infecção na periferia das grandes cidades como Rio de Janeiro, São Luiz, Fortaleza, Teresina, Jacobina, Santarém, Campo Grande e Belo Horizonte. Dessa forma o número de casos vem aumentado em cidades, onde o problema não era observado, concomitante ao aumento de casos de pessoas adultas infectadas e doentes (Secretaria de Vigilância em Saúde Ministério da Saúde, 2007). 17

18 A LVH é uma doença sistêmica que pode ser fatal se não tratada, sendo a Leishmania donovani e Leishmania infantum as duas espécies mais frequentemente associadas à esta forma clínica. Leishmania chagasi é geralmente citada como sinônimo de L. infantum, sendo essas duas espécies praticamente indistinguíveis, mas o nome L. chagasi é frequentemente usado na literatura da América Latina (Maurício & Stothard, 2000) As manifestações clínicas da LVH no Brasil são variadas sendo assim caracterizadas: (1) forma assintomática com cura espontânea e teste intradérmicos positivos para Leishmania sp; (2) forma subclínica ou oligossintomática, associada a manifestações inespecíficas (febrícula, tosse seca, adinamia, sudorese e hepatesplenomegalia discreta), mas sem desenvolvimento ou progressão da doença; (3) forma subclínica ou oligossintomática com evolução para a forma clássica ou manifesta; (4) forma aguda com duração inferior a dois meses, com febre alta, tosse, diarréia, hepatesplenomegalia e com elevação das globulinas do plasma IgM e IgG forma clássica (5) forma clássica ou manifesta da doença, sendo que o paciente apresenta febre diária, anorexia, emagrecimento, adinamia, sinais de desnutrição (pele seca, cabelos quebradiços, cílios longos), hepatesplenomegalia acentuada, distúrbios gastrintestinais (diarréia) e fenômenos hemorrágicos (epistaxe e gengivorragia). Desta forma pode-se notar a importância sócio-econômica da doença considerando-se a perda da força de trabalho dos pacientes adultos (casos aumentando com a urbanização) adicionados os gastos governamentais com a profilaxia e tratamento dos doentes (Gama e cols., 2004; Badaro e cols., 1986). Na Índia, a LVH é um dos maiores problemas de saúde pública no estado de Bihar, nos últimos 30 anos ou mais. Atualmente, crê-se que 28 dos 37 distritos da Índia são endêmicos. Há casos relatados nos distritos de West Bengal e Uttar Pradesh (vizinho a Bihar). Bihar, sendo o segundo mais populoso estado da Índia, além do mais pobre, responde por mortes por kala-azar ou LVH (Bhattacharya e cols., 2006). Cerca de metade dos casos da doença ocorre em crianças. As manifestações clínicas em adultos e crianças são semelhantes: febre prolongada, anorexia ou perda de apetite são os principais sintomas. Aumento do baço e do fígado, anemia moderada, panditopenia e 18

19 mudanças no cabelo podem ocorrer. Tosse e hemoptise podem ser devidas à coinfecção com o bacilo da tuberculose pulmonar. Infecções bacterianas (pneumonia, septicemia, otite, infecções do trato urinário e da pele) também são complicações comuns (Bhattacharya e cols., 2006; Bhattacharya e cols., 2006). LEISHMANIOSE VISCERAL MODELOS EXPERIMENTAIS Para estudos das leishmanioses a escolha do modelo animal deve ter como pré-requisito a correspondência deste modelo com a fisiologia humana, preocupar-se com a disponibilidade, manutenção e manuseio dos animais. (Awasthi e cols., 2004). A espécie Mesocricetus auratus, hamster sírio, pode ser um modelo adequado para a caracterização da doença, uma vez que a infecção de hamsters com L. donovani reproduz as características clínicas e patológicas da LV humana, causando até a morte do animal. Porém, não há grande disponibilidade de reagentes para as análises imunológicas o que não torna estes animais bons como modelos de desenvolvimentos de vacinas (Carrion e cols., 2006). O modelo murino de infecção por L. major definiu o paradigma Th1/Th2 de resistência/suscetibilidade à infecção por LC (Alexander & Bryson, 2005). Entretanto, os modelos de animais experimentais para estudo da LV utilizados não reproduzem com fidelidade as características observadas em seres humanos. As espécies causadoras da LV (L. donovani e L. infantum/l. chagasi) têm a capacidade de infectar camundongos e podem reproduzir a doença humana, tornando-se mais fácil a utilização desses animais como modelos de estudo da genética do hospedeiro vertebrado, do controle da infecção, além de auxiliar na determinação do desenvolvimento e regulação de suas respostas imunes (Alexander & Bryson, 2005). Camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 são hospedeiros experimentais importantes para estudos in vivo de testes vacinais da LV em testes primários; cães para testes secundários e primatas e esquilos para testes terciários (Garg & Dube, 2006). Devido à sua fácil manutenção, disponibilidade e 19

20 manuseio, além da suscetibilidade à LV os camundongos são os animais mais utilizados como modelos experimentais (Carrion e cols., 2006). Apesar disso, a LV murina causada por L. donovani não reproduz as características da LVH. Em camundongos ocorre o aumento da carga parasitária no início da infecção e depois de quatro a oito semanas eles são capazes de desenvolver uma resposta imune celular anti-leishmania eficaz e controlam a infecção. O controle é mediado pelo IFN-γ produzido por células T esplênicas e por um padrão característico de resposta Th1, com a participação da citocina IL-12. A ação do IFN-γ medeia o aumento da regulação da óxido nítrico sintase indutível (inos), levando à produção do NO. Este é um mecanismo crítico no controle da infecção, no qual macrófagos estão envolvidos no controle da replicação de parasitos em camundongos. Desse modo, o modelo murino de infecção por L. donovani é um bom modelo de replicação precoce de parasitos seguido do controle imunológico da infecção subclínica, mas não há modelo murino para a progressão da doença observada na LV humana (Melby e cols., 2001). TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA Em 1912, no Brasil, Gaspar de Oliveira Vianna observou que o tártaro emético (Sb (III)) era eficaz na terapêutica da LTA, porém devido aos seus efeitos tóxicos e graves efeitos colaterais, estes antimoniais trivalentes foram substituídos por compostos estibiados pentavalentes (Rath e cols., 2003). Até hoje o antimonial é usado, principalmente na sua forma pentavalente, a N-metil glucamina (Glucantime). No Brasil, é a droga de primeira escolha para o tratamento dessa doença e foi padronizada pela OMS na dose de 10 a 20 mg Sb(V)/kg/dia, onde SB(V) significa antimônio pentavalente (Anonymous2007; LIMA, 2007). O tratamento com antimoniais, embora seja na maioria das vezes efetivo e indicado, apresentando taxa de cura que varia de 60 a 100%, possui algumas desvantagens como alto custo, difícil administração e alta toxicidade, podendo desencadear vários efeitos colaterais, como artralgia, mialgia, cefaléias, 20

21 distúrbios gastrointestinais, alterações eletrocardiográficas, renais, hepáticas, pancreáticas, erupção cutânea, herpes-zóster e outros. Por isso, muitas vezes, esta droga é contra-indicada para cardiopatas, nefropatas, pessoas idosas e grávidas (Mayrink e cols., 2006) O mecanismo de ação dos antimoniais baseia-se na interferência no metabolismo bioenergético das formas amastigotas de Leishmania, onde ocorre bloqueio e inibição seletiva de diferentes proteínas do parasito, principalmente enzimas envolvidas na glicólise e na oxidação de ácidos graxos, resultando numa diminuição da produção de ATP e GTP (Chan-Bacab & Pena- Rodriguez, 2001). As drogas de segunda escolha para o tratamento da LVH são a anfotericina B e a pentamidina. Elas são utilizadas principalmente quando não ocorre resposta satisfatória com o uso do antimonial pentavalente. Em infecções causadas por fungos, o mecanismo de ação da anfotericina B está relacionado com a sua ligação aos esteróides da membrana fúngica. Como a membrana da Leishmania apresenta ergosterol, esta droga reduz a permeabilidade celular do parasito, ocorrendo perda de cátions, principalmente K +, levando à morte da célula (Ordonez-Gutierrez e cols., 2007). Existem vários relatos que usam alternativas quimioterápicas, por exemplo, as anfotericinas B associadas a moléculas de colesterol ou associadas a lipossomas capazes de alcançarem os órgãos infectados com grande eficácia. A pentamidina interfere com o transporte de aminoácidos, compete com poliaminas pelos ácidos nucléicos e pode também preferencialmente ligar-se ao DNA do cinetoplasto (PAULA & SAMPAIO, 2003). O uso prolongado de antimoniais pode levar a efeitos colaterais, tais como febre, náuseas, vômitos, mialgias, taquipinéia, hipopotassemia, insuficiência renal, leucopenia e astenia. Na Índia, relatam-se 50 a 60% de casos de resistência ao tratamento por antimoniais (Bhattacharya e cols., 2006). 21

22 MILTEFOSINA A miltefosina (1-0-hexadecilfosfocolina) (HPC) surgiu como nova promessa de tratamento da leishmaniose visceral humana, dada à ineficácia crescente dos tratamentos convencionais. Essa droga é uma alquilfosfocolina que foi originalmente desenvolvida para o tratamento de metástase cutânea em carcinomas mamários (Hilgard e cols., 1993) (Verma & Dey, 2004). Figura 3: Fórmula estrutural da miltefosina (Fonte: Posteriormente foi testada, com sucesso, no tratamento da LVH através de uma iniciativa da OMS reunindo um laboratório farmacêutico alemão e o Ministério da Saúde da Índia. Em estudo de fase III com adultos, realizado na Índia, a miltefosina, ministrada por via oral, curou 282 de 291 pacientes adultos (Sundar e cols., 2002). Subsequentemente, um estudo envolvendo crianças mostrou 94% de eficácia (Bhattacharya e cols., 2004). Efeitos colaterais foram observados em 3% dos pacientes incluindo distúrbios gastrintestinais e aumentos significativos dos níveis sorológicos de aminotransferase e creatinina. interessante notar que este é um tratamento por via oral, que evita as injeções e grande parte dos efeitos colaterais do tratamento convencional. Do seu mecanismo de ação, sobre leishmanias, sabe-se que primariamente interfere com a membrana celular, podendo ou não interagir com o DNA. Modula a composição lipídica, a permeabilidade e fluidez da membrana, É 22

23 assim como o metabolismo de fosfolipídios e a transdução do sinal proliferativo. Também induz morte celular por apoptose (More e cols., 2003) (Prasad e cols., 2004). Em formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) donovani a miltefosina foi capaz de induzir o processo de morte celular por apoptose atuando no citoplasma, núcleo e membrana das células, promovendo seu encolhimento, fragmentação do ácido desoxi-ribonucléico (DNA) e exposição da fosfatidilserina (Paris e cols., 2004). Ainda, pode induzir a morte das formas amastigotas de L. donovani a partir de seu efeito imune-modulador sobre macrófagos e linfócitos T. São observadas ações como co-estimulação de eventos relacionados à liberação de citocinas, incluindo expressão de RNAm de interferon (IFN-γ) e fator estimulador de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF); secreção de IFN-γ e fator de necrose tumoral α (TNF-α); expressão de receptores de citocinas na superfície de células e moléculas classe II do complexo principal de histocompatibilidade e induzindo ou incrementando a explosão respiratória e a liberação de óxido nítrico por macrófagos (Sundar e cols., 1998; Jha e cols., 1999; Murray & Delph-Etienne, 2000). Na tentativa de se determinar a eficácia e o mecanismo de ação da miltefosina, vários experimentos foram realizados. Croft et al (1987) foram os primeiros pesquisadores a relatar a ação leishmanicida das alquilfosfocolinas e derivados. Neste trabalho, os pesquisadores testaram a ação da miltefosina contra formas amastigotas de L. donovani em camundongos BALB/c. Posteriormente, Kuhlencord et al (1992) demonstraram ótima ação da droga em camundongos BALB/c infectados com L. donovani e Leishmania (Leishmania) infantum tratados por via oral e os resultados obtidos através de quantificação de parasitos em macrófagos e em órgãos (fígado, baço e medula óssea), após quatro semanas de tratamento, foram superiores aos do antimonial. Outra pesquisa demonstrou que as alquilfosfocolinas, incluindo a miltefosina, são ativas contra L. donovani em culturas de macrófagos in vitro e em camundongos scid e BALB/c (Escobar e cols., 2001). Estas duas linhagens de camundongos quando tratadas com 30mg/kg de miltefosina por cinco dias, apresentaram 95% de inibição do crescimento de parasitos durante a segunda 23

24 semana após a infecção. Em doses menores da droga ocorreu uma inibição do crescimento dos parasitos de uma maneira dose dependente sem diferenças entre camundongos scid e BALB/c. Estes experimentos sugerem um efeito da miltefosina independente da imunidade adquirida, uma vez que camundongos scid são deficientes em células T e B. Yardley et al pesquisaram a ação da miltefosina em macrófagos infectados com formas amastigotas de diferentes espécies de Leishmania causadoras da leishmaniose visceral (L. donovani) e leishmaniose cutânea (Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Leishmania) mexicana e Leishmania (Viannia) lainsoni). Foi observada uma grande variação nas concentrações de miltefosina necessárias para matar 50 % das formas amastigotas dessas diferentes espécies. As espécies de maior sensibilidade à ação da droga foram L. donovani e L. lainsoni. Isso demonstra uma notável diferença na sensibilidade in vitro das espécies de Leishmania à miltefosina (Yardley e cols., 2005). A eficácia clínica da miltefosina para Leishmaniose cutânea do novo mundo foi investigada em estudos conduzidos na América Central e América do sul. A taxa de cura variou de uma espécie para outra, com a L. panamensis apresentando taxa de cura de 82%, L. mexicana apresentando 60 % e a L. braziliensis comtaxa de cura de 33 %. Soto et al relataram taxa de cura de 88% dos pacientes na Bolívia infectados por L. braziliensis. Estes dados mostram que a taxa de cura a Leishmaniose cutânea após tratamento com miltefosina varia entre as espécies de Leishmania e também dentro da mesma espécie proveniente de áreas endêmicas diferentes (Soto e cols., 2008; Soto e cols., 2004). No Brasil, um estudo avaliou a eficácia e a segurança do uso da miltefosina e de antimonial pentavalente Sb (V) no tratamento de pacientes com LC causada por L. braziliensis na Bahia. Um total de 90 pacientes foi incluído no estudo, 60 foram selecionadas para receber miltefosina e 30 para receber Sb (V). Seis meses após o tratamento a taxa de cura definitiva foi de 53,3% no grupo de Sb (V) e 75% no grupo da miltefosina. Miltefosina foi mais eficaz que o Sb (V) na faixa etária de anos de idade em relação ao grupo de 2-12 anos, respectivamente. Este estudo demonstrou que a terapia com miltefosina foi mais 24

25 eficaz e seguro do que o padrão Sb (V) para o tratamento da LC (Machado e cols., 2010). A eliminação da miltefosina é muito lenta, sendo ainda detectável no plasma humano de pacientes com Leishmaniose cutânea em amostras colhidas de cinco a seis meses após o final do tratamento e sua presença em concentrações sub-terapêuticas no sangue depois do tratamento podem aumentar sua eficácia, porém contribuem para seleção de parasitos resistentes (Dorlo e cols., 2008). Apesar de sua eficácia comprovada por diferentes estudos, o mecanismo de ação da droga ainda não está totalmente esclarecido. Há relatos de que a miltefosina necessita de IFN-γ para sua ação leishmanicida. Esta ação foi significativamente comprometida em macrófagos de camundongos deficientes na produção de IFN-γ. A miltefosina mostrou-se capaz de restaurar a resposta de macrófagos ao IFN-γ por aumentar a expressão dos receptores de IFN-γ na superfície celular e de promover a fosforilação de STAT-1 e reduzir a ativação de SHP-1. Além disso, a droga induziu a fosforilação da quinase p38map necessária para a indução da proteína óxido nítrico sintase indutível (inos). Assim a miltefosina aumentou a expressão de inos e a produção de NO (Wadhone e cols., 2009). Ainda não foi relacionado a ação da miltefosina em macrófagos e o metabolismo da L-arginina. O metabolismo da L-arginina, feito pelas enzimas arginase e inos, é importante para o entendimento da suscetibilidade observada em camundongos BALB/c infectados L. major. Enquanto a expressão de arginase é induzida por IL-4 e IL-10 e favorece a replicação do parasito e, portanto, a susceptibilidade à infecção por L. major, a expressão de inos é disparada por IFN-γ e favorece a eliminação do parasito e assim a resistência à infecção (Corraliza e cols., 1995; Modolell e cols., 1995; Iniesta e cols., 2005). Em infecções por L. donovani esta relação parece não ter sido descrita ainda. 25

26 Metabolismo da L-Arginina ARGINASE I IL-4 L- Arginina IFN-γ TNF-α INOS URÉIA L- Citrulina L- Ornitina NO Poliaminas Figura 4: Metabolismo da L-arginina. É interessante notar a semelhança estrutural entre a miltefosina e o fator de ativação de plaquetas (PAF, 1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina) (figura 4). A. Estrutura da Miltefosina B. Estrutura do PAF Figura 5: Miltefosina [A] tem uma semelhança estrutural com o fator de ativação plaquetário (PAF) [B], ambos tendo uma fosfocolina e uma cadeia hexadecil. Ambas as moléculas contém uma fosfocolina ligada a um grupo hidrofóbico. No caso da miltefosina, este grupo é uma cadeia alifática saturada 26

27 de 16 carbonos. No caso do PAF, trata-se do glicerol ligado a um grupo acetato e a uma cadeia alifática poli-carbonada, por uma ligação éter. Esta semelhança torna atraente a hipótese de que a miltefosina poderia ligar-se ao receptor de PAF. Realmente, já foram feitas modelagens demonstrando esta possível ligação (figura 5). Miltefosina PAF PAFR PAFR Figura 6: Modelagem de demonstração da ligação da miltefosina (esquerda) e PAF (direita) ao receptor de PAF. Devido à semelhança estrutural entre a miltefosina e o PAF a hipótese deste trabalho é que a droga use o receptor de PAF (PAFR) para sua ação leishmanicida. O FATOR DE ATIVAÇÃO DE PLAQUETAS (PAF) O PAF é uma molécula pró-inflamatória que medeia anafilaxia, choque endotóxico e trombose Este mediador é produzido por várias células, incluindo-se os neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, monócitos, macrófagos, células endoteliais e queratinócitos. O PAF age ligando-se ao receptor de PAF (PAFR) presente nas células alvo (Ishii & Shimizu, 2000). O receptor de PAF (PAFR) apresenta uma típica estrutura de receptor acoplado à proteína G com sete cadeias α-hélice transmembranares. PAFR é expresso tanto na membrana celular quanto na nuclear e pode ativar várias vis de sinalização intracelular (Honda e cols., 1991; Nakamura e cols., 1991; Ishii e cols., 1996) (Marrache e cols., 2002). 27

28 No camundongo, o gene para o receptor de PAF está localizado do cromossoma quatro, e é expresso em vários tecidos como o cérebro, pulmão, fígado, baço, rim, músculo esquelético, intestino delgado, macrófagos e leucócitos (Ishii & Shimizu, 2000). Recentemente, vários estudos foram feitos investigando o papel do PAF em modelos de infecção. Em um trabalho usando antígeno de Mycoplasma arthritidis a adição de PAF a culturas de células estimuladas com este antígeno ou células naïve não afetou a produção de NO. Entretanto estas células produziram TNF-α (Shio e cols., 2004). O PAF mostrou-se uma molécula chave envolvida na ativação inicial do NF-κB, que promove a resistência órgãoespecífica à Candida albicans, pela indução de TNF-α (Choi e cols., 2001). Em infecção pulmonária com Klebsiella pneumoniae camundongos deficientes para o receptor de PAF foram mais suscetíveis devido à relevância deste receptor em mediar a fagocitose desta bactéria (Soares et al., 2002). Na infecção por Trypanossoma cruzi o PAF medeia a resistência favorecendo a fagocitose e produção de óxido nítrico (Aliberti e cols., 1999; Talvani e cols., 2003). Três trabalhos abordaram o papel do PAF ou do PAFR durante a infecção por Leishmania. No primeiro, mostrou-se que a adição de PAF a macrófagos de camundongos BALB/c diminuiu a infecção in vitro com L. amazonensis, efeito aparentemente mediado por NO (Lonardoni e cols., 1994). Um segundo estudo, utilizando-se antagonistas de PAFR in vivo, mostrou que o PAFR mediaria a resistência à infecção com L. amazonensis, novamente de forma parcialmente dependente de NO (Lonardoni e cols., 2000). A inibição da NOS-2 eliminou os efeitos mediados pelo PAF, (Lonardoni e cols., 1994; Lonardoni e cols., 2000). Nosso grupo mostrou que camundongos geneticamente deficientes na expressão de PAFR (PAFR-KO) no fundo C57BL/6 são mais suscetíveis à infecção por L. amazonensis que os tipos selvagens, uma vez que suas lesões eram maiores e continham mais parasitos. Mostramos, ainda, que a produção de IFN-γ por células do baço e linfonodos dos camundongos PAFR-KO era retardada, e que níveis inferiores da quimiocina CCR5 foram encontrados em suas lesões. A expressão de RNAm da NOS2 foi menor nas lesões dos 28

29 camundongos PAFR-KO, e a expressão de arginase maior. Assim, o PAFR seria importante na resistência parcial encontrada em camundongos C57BL/6 infectados com L. amazonensis, por um mecanismo que torna o macrófago menos apto a matar o parasito (Santiago e cols., 2006a). A LVH é um grande problema de saúde pública mundial e estudos sobre novas drogas para o tratamento desta infecção são necessários. O Brasil e a Índia respondem por grande parte dos casos de leishmaniose do planeta. Ambos os países utilizam a miltefosina como um substituto de drogas antimoniais, devido à toxicidade destas e ao aparecimento de resistência ao tratamento. Estes países vêm buscando desenvolver pesquisas para melhor entender os mecanismos de ação da miltefosina. O grupo do professor Baskar Saha, do National Center for Cell Science, em Poona na Índia, tem vasta experiência no estudo de leishmaniose visceral e também desenvolve pesquisas com a miltefosina. Nossos grupos de pesquisa começaram uma colaboração a partir da sugestão do grupo indiano de que o mecanismo de ação da miltefosina poderia ser via receptor de PAF. Devido à sua semelhança estrutural com o fator de ativação plaquetário a droga pode utilizar o receptor deste fator para sua ação na eliminação das formas amastigotas de L. donovani. Os estudos propostos neste projeto são inéditos, onde o papel do PAF ou de seu receptor na infecção por L. donovani não foi ainda descrito. Este trabalho é fruto desta colaboração e demonstra que a miltefosina apresentou parte de sua ação leishmanicida através do receptor do PAF. 29

30 2 - OBJETIVOS OBJETIVO GERAL: Verificar e avaliar se a atividade leishmanicida da hexadecilfosfocolina, ou miltefosina, é mediada pelo receptor de fator de ativação plaquetário (PAF) OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Determinar o perfil de infecção com L. donovani in vitro de macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO. Comparar a função anti-leishmania da miltefosina em macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e deficientes no receptor de PAF. Determinar atividade de arginase e a produção de NO em macrófagos de camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO. Determinar o curso de infecção com L. donovani em camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO, determinando a carga parasitária no fígado, baço e medula óssea. Determinar o curso de infecção com L. donovani em camundongos BALB/c selvagens e PAFR-KO tratados com miltefosina, determinando a carga parasitária no fígado, baço e medula óssea. 30

31 3 - MATERIAL E MÉTODOS ANIMAIS Camundongos BALB/c fêmeas foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO/UFMG, Belo Horizonte,MG, Brasil) e mantidos no biotério experimental do Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Camundongos BALB/c knockout para o gene do receptor de PAF foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira (Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG). As colônias de criação dos mesmos foram mantidas em microisoladores dotados de filtro EPA e sob ventilação forçada, no biotério de criação do Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia, UFMG. Os animais experimentais foram mantidos com barreiras ambientais sob condições de temperatura e fotoperíodo controladas, e foram oferecidas ração convencional para camundongos (Labina, Purina, Paulínea, SP, Brasil) e água filtrada ad libitum. Foram utilizados de cinco camundongos por grupo, com seis a dez semanas de idade ao início de cada experimento. Todos os procedimentos realizados com os camundongos estão em acordo com os protocolos éticos. Este projeto foi submetido para avaliação e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG), sob o protocolo 150/ PARASITOS Promastigotas de Leishmania donovani (MHOM/IN/80/DD8), cedidas gentilmente pela Prof. Dra. Maria Norma de Melo, do laboratório de Leishmanioses do Departamento de Parasitologia da UFMG, foram cultivadas em Grace s Insect Medium (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 20% de soro fetal bovino inativado (SFB) (Cultilab, Campinas, SP, Brasil), 2 mm de L-glutamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA), 100 U de penicilina por ml e 100 µg de estreptomicina por ml (Gibco BLR Life 31

32 Technologies). As culturas foram mantidas em estufa BOD a 25 C, e repicadas a cada três dias, até no máximo 10 repiques. Após a décima passagem, os parasitos foram novamente isolados de baços e fígados de camundongos BALB/c, previamente infectados. Para o isolamento de parasitos para cultura os animais foram sacrificados e seus órgãos macerados em salina tamponada com fosfato 10mM em ph 7,3 (PBS), este conteúdo foi centrifugado a 50 x g a 4º C por 4 minutos. O sobrenadante foi recolhido em outro tubo e nova centrifugação feita (2.000 x g a 4º C por 15 minutos). Após a segunda centrifugação o sobrenadante foi descartado e o pellet foi suspendido em 200µL de meio Grace completo (suplementado com 20% de soro fetal bovino inativado (SFB), 2 mm de L- glutamina, 100 U de penicilina por ml e 100 µg de estreptomicina por ml) e transferido para o primeiro poço de uma placa de 96 poços (TPP, Trasadingen, Schaffhausen, Suíça). Posteriormente, foram transferidos 50µL do conteúdo do primeiro poço para o segundo poço e deste para o terceiro, e assim sucessivamente. A placa foi, então, selada e mantida em estufa BOD a 25 C. Após sete dias, formas promastigotas de Leishmania foram recuperadas da placa e mantidas em garrafas de cultura de 25 cm 3 (TPP). 3.3 INFECÇÃO DE CAMUNDONGOS POR LEISHMANIA Foram utilizadas formas estacionárias do parasito, obtidas com quatro dias de cultura. As culturas de Leishmania em fase estacionária foram centrifugadas a x g a 4º C por 15 minutos. O sobrenadante foi, então, desprezado e o sedimento suspenso em aproximadamente 1000µL de PBS. Uma alíquota foi retirada e diluída em formol tamponado e o número de parasitos foi estimado por contagem em câmara de Newbauer. A concentração foi acertada para 2x10 7 parasitos em 300 µl de PBS. A inoculação endovenosa dos parasitos foi feita com seringa contendo uma agulha de calibre 26 G½ através da veia da cauda do animal. 32

33 3.4 QUANTIFICAÇÃO DE PARASITOS A quantificação de parasitos foi realizada pela técnica de diluição limitante, em que diluições sucessivas foram feitas a partir dos homogenatos dos baços, fígados e medulas ósseas dos camundongos experimentais infectados. Primeiramente os órgãos, inteiros, foram macerados em um homogeneizador de tecidos estéril. O homogenato foi centrifugado a 50 x g por 4 minutos e o sobrenadante foi transferido para outro tubo. Esse sobrenadante foi centrifugado a 2000 x g por 15 minutos. O sedimento foi suspenso em 400 µl de meio Grace completo. Em uma placa estéril de poliestireno com 96 poços e fundo chato (TPP), foram colocados 150 µl/poço de meio de Grace completo, exceto na primeira coluna de poços, onde foi colocada 200 µl da suspensão do órgão macerado. Em seguida, foram feitas diluições sucessivas 1:4, tomando-se o cuidado de trocar o conjunto de ponteiras da pipeta multicanal a cada diluição para evitar o arraste de parasitos e um conseqüente resultado falso-positivo. As placas foram mantidas a 25 C em estufa BOD e a leit ura dos resultados foi feita de 10 dias após o início da cultura. 3.5 OBTENÇÃO E INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS Camundongos BALB/c e PAFR-KO foram injetados com 2mL de tioglicolato 3% por via intraperitoneal e após quatro dias foram eutanasiados. O peritônio foi lavado com 10 ml de PBS estéril e gelado para retirada dos macrófagos. Macrófagos foram centrifugados a 300 x g por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. As células tiveram sua concentração acertada para 1x10 6 /ml. Foram deixadas para aderir às lâminas Lab Tek chamber de 8 poços (Nalge Nunc International, Rochester, NY, EUA) por três horas. As células que não aderiram foram retiradas com três lavagens com PBS a 37 ºC. A seguir dois poços de cada placa foram estimulados com 100U/mL de IFN-γ e 100 ng de LPS e incubados em estufa a 37C em atmosfera úmida contendo 5% de CO 2 durante a noite. Após este período, realizou-se a infecção com L. donovani por quatro horas, em relação parasito:macrófago de 10:1. Os parasitos que não foram fagocitados foram lavados com PBS e os devidos poços foram novamente 33

34 estimulados com IFN-γ e LPS. O tratamento com a droga foi feito em três diferentes doses (0,2 µm, 0,8 µm e 3,2 µm) e seu efeito foi avaliado em diferentes tempos de cultura (4 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas). Os parasitos foram contados sob microscópio ótico após coloração com Panótico rápido (Panótico Rápido (Laborclin,Pinhais, Paraná, Brasil)). O número de macrófagos infectados e o número médio de parasitos por macrófago foi determinado em 300 células. Os resultados foram expressos como índice de infecção, que é a porcentagem de macrófagos infectados multiplicada pelo número médio de amastigotas por macrófago. 3.6 DOSAGEM DA ATIVIDADE DA ENZIMA ARGINASE A atividade de arginase foi mensurada a partir de lisado de macrófagos (Kropf e cols., 2005). Camundongos BALB/c e PAFR-KO foram estimulados com 2mL de tioglicolato (3%) intraperitonialmente e após 4 dias as células foram recuperadas com lavagem do peritônio com PBS gelado. As células tiveram sua concentração acertada para 1x10 6 /ml, infectadas ou não, foram lisadas com 50 µl de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) por 30 minutos em agitação. Após a lise, a arginase foi ativada com a adição de seus co-fatores: 50 µl de 10 mm MnCl 2 e 50 µl de 50 mm Tris HCl (ph 7,5) a 55ºC por 10 minutos. Em seguida a amostra obtida foi transferida para outra placa de 48 poços em duas diferentes concentrações. Em um dos poços foi feita a transferência de 55 µl da amostra sem diluição, e a partir desta foi feita uma diluição de 1:10 (5 µl de amostra + 45 µl de H 2 O destilada). Para que fosse mensurada a atividade da enzima foi adicionado às amostras o substrato 50 µl de 0,5 mm de L-arginina (Sigma Aldrich) (ph 9,7), após o que se incubaram as placas a 37ºC por 60 minutos. Em seguida a reação foi parada com a adição de 400 µl de uma mistura de ácidos (H 2 SO 4 -H 3 PO 4 -H 2 O) na proporção de: 1:3:7. Foram então adicionados 25 µl de α-isonitrosopropiofenol (Sigma Aldrich) 9% em etanol. A placa foi então incubada a 95ºC por 45 minutos. A curva padrão foi feita a partir de uréia (Sigma Aldrich) 1 mg/ml diluída sucessivamente 1:2. Após os 45 minutos de incubação a 95ºC, 100 µl de cada amostra foram transferidos para uma placa de 96 poços e foi realizada leitura em leitor de microplacas a 540 nm (Microplate 34

35 Spectrophotometer System, modelo SPECTRAmax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, California). O resultado foi expresso como unidade de atividade de arginase por pata. Cada unidade é definida como a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol uréia/minuto. 3.7 DOSAGEM DE NITRITO A quantidade de óxido nítrico produzida em culturas de macrófagos foi estimada a partir da dosagem de nitrito nos de sobrenadantes de culturas de macrófagos infectados ou não com L. donovani, tratados ou não com miltefosina, in vitro pelo método de Griess (Green e cols., 1982). Para as dosagens em sobrenadante, as amostras foram colocadas em uma placa de 96 poços (TPP), 50 µl de amostra/poço. O padrão de nitrito de sódio (250 mm) foi adicionado em duplicata e diluído 1:2 nos poços posteriores em meio RPMI. O branco consiste apenas de RPMI completo. Logo após adicionaram-se 100 µl de solução de Griess sobre as amostras, o padrão e o branco. A placa foi mantida no escuro por 10 minutos e a densidade ótica foi determinada por leitura em espectofotômero (Microplate Spectrophotometer System, modelo SPECTRAmax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, California). 3.8 MILTEFOSINA A Miltefosina (Cayman Chemical Company, Ann Arbor,MI, USA) é um sólido cristalino em pó que foi mantido refrigerado (-20ºC). Uma solução estoque de concentração 32 mm foi preparada dissolvendo o pó em PBS 1x estéril, sendo filtrada após a solubilização e mantida refrigerada a 4ºC. Nos experimentos in vitro as concentrações utilizadas foram 0,2µM, 0,8µM e 3,2µM de miltefosina, onde foi utilizado meio RPMI 1640 completo (Gibco), contendo 10% de soro bovino fetal (Nutricell, Campinas, SP, Brasil), 2 mm de L-glutamina (Sigma), 0,1% de solução de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich Co.) a 0,05 M, 100 U/mL de penicilina e 50 µg/ml de estreptomicina (Gibco) para acertar as concentrações. Nos experimentos in vivo as doses da droga com concentrações de 10mg/kg/dia e 20mg/kg/dia para cada grupo experimental foram preparadas de 35