INSTRUÇÕES PARA A ELABORAÇÃO DE TRABALHOS COMPLETOS

Transcrição

1 09 a 11 de dezembro de 2015 Auditório da Universidade UNIT Aracaju - SE INSTRUÇÕES PARA A ELABORAÇÃO DE TRABALHOS COMPLETOS PESQUISA DE SALMONELLA SSP EM ÁGUA TRATADA: ESTUDO COMPARATIVO ENTRE METODOLOGIAS MODIFICADAS NO SMEWW e VIDAS Leticia de Alencar Pereira Rodrigues 1, Rita de Cássia Esteves Ataide 2, Maria Marlene dos Santos Cardoso 3,Ione Pinheiro dos Santos 4 1 SENAI Lauro de Freitas, Lauro de Freitas/BA, Brasil, leticiap@fieb.org.br 2 SENAI Lauro de Freitas, Lauro de Freitas/BA, Brasil, rcestev@fieb.org.br 3 SENAI Lauro de Freitas, Lauro de Freitas/BA, Brasil, marlene@fieb.org.br 4 SENAI Lauro de Freitas, Lauro de Freitas/BA, Brasil, ipinheiro@fieb.org.br ID 194 Resumo A água é um dos mais importantes veículos de enfermidades diarréicas, o que torna essencial a avaliação da sua qualidade microbiológica. As doenças de veiculação hídrica são causadas principalmente por microrganismos patogênicos de origem entérica. A presença de microrganismos entéricos patogênicos, como a Salmonella em água é um risco potencial para a saúde. Apesar da pesquisa de Salmonella spp. não ser utilizada como indicador pelas legislações vigentes para controle de qualidade da água, sua avaliação se torna importante para estudos epidemiológicos devido ao grande número de sorotipos existentes. Neste sentido, duas metodologias modificadas foram comparadasp ara a pesquisa de Salmonella sp. a fim de verificar qual a alternativa mais eficiente para detecção. Foram analisadas 15 amostras de água tratada fortificadas com Salmonella Enteritidis em 3 níveis diferentes de concentrações do microrganismo na sua fase estacionária (1 UFC/mL; 9 UFC/mL e 85 UFC/mL), usando a metodologia SMEWW (22 edição) através da filtração de 100 ml de água, divisão da membrana de 0,45 µm e transferência para o enriquecimento em Caldo Selenito Cistina e Caldo Rappaport Vassiliadis Sojae a metodologia do sistema Vitek Immuno Diagnostic Assay System (VIDAS ) - Salmonella (SLM), simultaneamente.a incubação do enriquecimento para os dois métodos foi feita em 2 tempos para avaliação: 24 e 48 h. Após 24 h e 48 h de incubação, os dois métodos apresentaram a mesma quantidade de tubos positivos na concentração de 85 UFC/mL, enquanto que com 48 h o método VIDAS -SLM apresentou um maior número de tubos positivos na concentração de 1 UFC/mL e 9 UFC/mL.Todas as amostras positivas no método VIDAS -SLM foram confirmadas no método de cultura. Os resultados indicam que o método VIDAS -SLM constitui uma promissora técnica de detecção rápida de Salmonella em amostras de água em função da sua maior sensibilidade na detecção de baixas concentrações do microrganismo alvo. Palavras-chave: Salmonella, água, metodologias. 1

2 1. INTRODUÇÃO A água pode ser contaminada no ponto de origem, durante a sua distribuição e, principalmente, nos reservatórios particulares, sejam eles de empresas ou domiciliares [1]. Dados revelam que milhões de pessoas, principalmente crianças, morrem anualmente por doenças relacionadas à água no mundo todo. No entanto, o acesso à água limpa é um direito humano básico. No Brasil, o custo gerado para o tratamento de doenças transmitidas ou causadas por águas contaminadas, segundo o Ministério da Saúde, é equivalente a US$ 2,7 bilhões por ano [2]. Salmonella é um grupo bacteriano que pode causar gastrenterites, sendo encontrada, em geral em alimentos de origem animal, como carnes, ovos, leite, água entre outros. Existem atualmente mais de sorotipos de salmonela dos quais mais da metade pertence à subespécie entérica. A bactéria é freqüentemente encontrada no trato intestinal de animais, domésticos e selvagens, sendo muito comum em frangos e ovos [3]. A Salmonella spp é de fundamental importância em saúde pública pelo fato de algumas cepas serem patogênicas ao ser humano e de representar um dos parâmetros de determinação dos padrões microbiológicos de reconhecimento mundial para alimentos [4]. No Brasil, dados epidemiológicos da ANVISA sobre surtos ocorridos entre os anos de 1999 a 2008, relataram surtos de DTAs, provocando doentes com 64 óbitos, sendo que na maior parte dos surtos, a bactéria responsável foi Salmonella spp [5]. Apesar da pesquisa de Salmonella spp. não ser utilizada como indicador pelas legislações vigentes para controle de qualidade da água, sua avaliação se torna importante para estudos epidemiológicos devido ao grande número de sorotipos existentes. A detecção de Salmonella sp é uma técnica laboratorial que pode levar até 7 dias quando a análise é realizada pela metodologia tradicional, sendo necessários 4 dias para obtenção de resultado negativo confirmatório neste método [6]. Para o controle das contaminações por Salmonella spp. se faz necessário um diagnóstico rápido e preciso. Atualmente o método mais utilizado é o microbiológico convencional, sendo uma técnica demorada e trabalhosa, sendo necessário mais de cinco dias para a emissão de um resultado, dificultando o monitoramento da contaminação bacteriológica na cadeia produtiva do alimento, e ainda desfavorecendo a adoção de medidas emergenciais para conter a liberação de lotes que possam estar contaminados. A necessidade de métodos rápidos e menos laboriosos de detecção tem levado a avanços significativos no desenvolvimento de pesquisa nesta área. [7] A importância e precisão da utilização de ensaios imunológicos para fins de diagnóstico estão na diversidade de anticorpos formados para um mesmo antígeno e que podem ser escolhidos, no caso dos anticorpos monoclonais. Esta diferenciação ocorre devido aos vários tipos de imunoglobulinas formadas [8]. O primeiro imunoensaio para Salmonella sp foi realizado em 1977 e, desde então, vários ELISA têm sido desenvolvidos, usando-se tanto anticorpos policlonais como monoclonais para detectar a maioria dos sorovares de Salmonella sp. Com o desenvolvimento da tecnologia de produção de anticorpos monoclonais, trabalhos utilizando essa metodologia surgiram mostrando uma maior sensibilidade na detecção deste microrganismo. Nove anticorpos monoclonais capazes de detectar Salmonella sp viva em alimentos foram produzidos posteriormente [9]. Não houve significância nas reações cruzadas com outras bactérias. Dois kits comerciais receberam o status de oficiais pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists), desde Em comparação com o método convencional, o tempo total é reduzido em 2 dias e a análise estatística dos dados não tem indicado diferenças significativas [10]. Porém, o principal problema relatado por todos os métodos, que não o convencional, é o aparecimento de resultados falso-positivos e/ ou falso-negativos [11]. De acordo com os mesmos autores, resultados falso-negativos no teste ELISA podem ser eliminados utilizando-se um anticorpo monoclonal de alta especificidade [9]. 2. OBJETIVO Este estudo teve por objetivo comparar dois métodos analíticos modificados, o método oficial estabelecido pelo Standard Methods for the Examination of Water and, 2012, 22 edição (SMEWW) e o método rápido com sistema de análise qualitativa imunoenzimática automatizada (VIDAS Salmonella) - AOAC MATERIAL E MÉTODOS As análises foram realizadas no Laboratório de Microbiologia do Senai Lauro de Freitas. A coleta da água para pesquisa foi da torneira com frasco estéril e preservado. A análise realizada de Salmonella sp foi avaliada em 100mL de amostra filtrada, em filtro estéril de nitrato de celulose de 0,45 µm. Foram coletados 15 amostras com 200mL de água da torneira com preservante tiossulfato de sódio. Sendo que para cada série de 5 frascos foram utilizados números de células em diluições diferentes (10-8 ; 10-9 ; ) para a fortificação da amostra. Na fortificação foi utilizada a fase estacionária de Salmonella Abaetetuba ATCC em 3 níveis diferentes de concentrações do microrganismo na sua fase estacionária (1 UFC/mL; 9 UFC/mL e 85 UFC/mL). Cada série foi filtrada duas vezes, onde 5 membranas foram colocadas em 5 caldos SX2 e as outras 5 foram divididas para colocar cada metade em Caldo Selenito-Cistina e Caldo Rappaport. No enriquecimento as amostras foram incubadas a temperatura de 42 1ºC pelos seguintes períodos 24 e 48 h. Em seguida foram seguidas as etapas dos métodos tradicional e VIDAS. 2

3 3.1 ETAPAS MÉTODO VIDAS: Após incubação, transferiu-se 0,5 ml do tubo de caldo SX2 para a barrete do kit VIDAS SLM. As barretes foram aquecidas no bloco VIDAS HEAT & GO, a 131 ± 0,5 C por 15 ± 1 min, para inativação do antígeno e logo após resfriadas a temperatura ambiente. Em seguidas foram introduzidas no suporte analítico das barretes do equipamento e os cones do kit (fase sólida) inseridos no bloco de cones, para início os ensaios pelo VIDAS com duração de 48 minutos. Após o período de incubação, os tubos com caldo SX2, foram estriados na superfície de placas de ágar Rambach, MLCB, XLD e ChromID Salmonella (SM2), que foram posteriormente incubadas de forma invertidas a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Após período de incubação foi verificado o desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella. As provas bioquímicas para confirmação foram feitas conforme metodologia tradicional. 3.2 ETAPAS MÉTODO TRADICIONAL: Após o período de incubação, os tubos com caldo Rapapport e caldo Selenito-Cistina, foram estriados na superfície de placas de ágar Rambach, MLCB, XLD e ChromID Salmonella (SM2), que foram posteriormente incubadas de forma invertidas a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Após período de incubação foi verificado o desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella. Em Rambach as colônias típicas apresentam-se de cor vermelha. Alguns sorovares podem se apresentar com coloração rosa claro, cor de pêssego ou amarelas (cor de gema). No MLCB negras, convexas, lisas e brilhantes, com bordas regulares. No XLD apresentam-se transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H 2 S podem produzir colônias grandes e brilhantes com centro preto, ou mesmo inteiramente pretas. Em ChromID Salmonella (SM2) apresentam colônias violetas/malva. Foi realizado o reisolamento de colônias típicas em ágar ChromID Salmonella (SM2). Foram selecionadas duas colônias típicas de cada placa para confirmação preliminar nos tubos de Caldo Uréia, Ágar LIA e Ágar TSI. Com o auxílio de uma alça de inoculação, foi removida uma porção da massa de células, do centro da colônia típica que foi semeada em caldo uréia e inoculada através de picada profunda, estriando na superfície inclinada do bisel dos tubos inclinados de Ágar LIA e Ágar TSI. Reação típica de Salmonella sp em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Reação atípica e, TSI, que não deve ser descartada se as demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H 2 S. Reação típica de Salmonella sp em LIA: fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H 2 S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA, que não deve ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H 2 S. No caldo Uréia a cor do meio permanece inalterada. Salmonella é urease negativa. Para o teste de reação sorológica frente ao anti-soro polivalente "O foi preparada uma suspensão com 1 ml de solução salina 0,85% diretamente no ágar TSI. Sobre a superfície da placa de Huddleson foi depositado separadamente, uma gota de solução salina 2% e uma gota do soro anti-salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentou-se a cada uma delas uma gota da suspensão obtida em ágar TSI. Com movimentos circulares, foi realizada a leitura com iluminação sobre fundo escuro em 5 a 10 minutos. Os resultados obtidos apresentaram presença de aglutinação somente na mistura cultivo + anti-soro; Todas as colônias testadas para Salmonella apresentaram reações típicas nas provas bioquímicas e reação sorológica positiva frente ao anti-soro polivalente "O". 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES Os dois métodos apresentaram a mesma quantidade de tubos positivos com 24 h incubação, enquanto que com 48 h o método VIDAS -SLM apresentou um maior número de tubos positivos na concentração de 1 UFC/mL e 9 UFC/mL (diluição 10-9 e respectivamente, da fase estacionária). Todas as amostras positivas no método VIDAS -SLM foram confirmadas conforme método tradicional. Os resultados estão na tabela 01 e 02. Tabela 01: Quantidade de tubos positivos para o método tradicional e VIDAS -SLM para o período de incubação de 24 h. Diluições da fase Número de tubos positivos estacionária Método VIDAS Método Tradicional tubos 5 tubos tubos 4 tubos tubos 1 tubos 3

4 Tabela 02: Quantidade de tubos positivos para o método tradicional e VIDAS -SLM para o período de incubação de 48 h. Diluições da fase Número de tubos positivos estacionária Método VIDAS Método Tradicional tubos 5 tubos tubos 4 tubos tubos 1 tubos Analisando os dados acima, é possível dizer que o método VIDAS -SLM é capaz de detectar contaminações com cerca de 1 UFC/mL; 9 UFC/mL e 85 UFC/mL na fase estacionária. Ou seja 100% de concordância com o método tradicional modificado. Avaliando os resultados do presente estudo pode-se afirmar que o caldo SX2 é capaz de manter as células viáveis de Salmonella por tempo superior a 24 h a 42 1ºC, em função da sua alta especificidade e inibição de flora competidora. Tabela 03: Teste de exatidão do método VIDAS -SLM na diluição 10-9 da fase estacionária em relação à fortificação dos tubos com 48 h de incubação. Teste de exatidão Salmonella sp. Sensibilidade 100% Especificidade 100% Taxa de erro falso positivo 0% Taxa de erro falso negativo 0% Conforme tabela 3, o método VIDAS para identificação de Salmonella sp produziu uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 100% em relação à fortificação após 48 h de incubação na diluição de Os dados apresentados demonstram a eficácia do método VIDAS. Não é possível fazer testes de sensibilidade e especificidade, de um método em relação ao outro, pois tratam-se de métodos modificados. Mas foi feita a comparação com a quantidade de amostras fortificadas com Salmonella. A sensibilidade (S) de um método está relacionada com a capacidade de um método de não apresentar resultados falsonegativos (FN) e, a especificidade (E), com sua capacidade de não apresentar resultados falso-positivos (FP). Sensibilidade e especificidade dos métodos foram avaliadas conforme BEUMER et al., (1991). 5. CONCLUSÕES Os resultados indicam que o método VIDAS -SLM constitui uma promissora técnica de detecção rápida de Salmonella em amostras de água em função da sua maior sensibilidade na detecção de baixas concentrações do microrganismo alvo quando a incubação do enriquecimento for durante 48 h. Além disso, possui resultados semelhantes ao tradicional quando incubado por 24 h. O método VIDAS -SLM apresentou uma correlação de resultados muito grande em relação à metodologia tradicional modificada (SMEWW) de detecção e isolamento de Salmonella spp. em água, com a vantagem de ser mais rápido e de alta sensibilidade, diminuindo o tempo do resultado de 4 para 2 dias. Para uma nova técnica ser aceita e utilizada com confiança é necessário que seja pelo menos tão boa ou superior ao método anterior. O ensaio imunológico aqui descrito parece satisfazer este requerimento, portanto, oferece a possibilidade de ser utilizado em amostras de água. 6. REFERÊNCIAS [1] Germano PML, Germano MIS. Higiene e vigilância sanitária de alimentos. São Paulo: Varela; [2] Adeodato S. O consumo consciente da água. Bio Nutr Saúde. 2006;1:2. [3] American Academy of Pediatrics. Salmonella Infections. In: Pickering LK, ed Red Book: Report of the Committee on Infectious Diseases. 27th ed. Elk Grove Village, IL: American Academy of Pediatrics; [4] Tavechio, A. T. Comparação fenotípica e genotípica entre cepas de Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo 1,4,[5],12:i:- e de Salmonella Typhimurium f. Tese (Doutorado em Ciências) - Secretaria de Estado da Saú- de de São Paulo, São Paulo, [5] BRASIL. Secretaria de Vigilância em Saúde. Coordenação de Vigilância das Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar. Analise Epidemiológica de Surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos no Brasil Disponível em:. Acesso em: 30 Ago [6] Bennett, A.R., Greenwood, D., Tennant, C., Banks, J.G., Betts, R.P. Rapid and definitive detection of Salmonella in foods by PCR. Letters in Applied Microbiology, v. 26, p ,

5 [7] Daiani P.R, Ana P B, João P M, Francielle B, Ana C M C, Alessandra B R. Detecção de Salmonella spp. em águas de lavagem de carcaças de frango utilizando o método de reação em cadeia da polimerase (PCR). Revista Saúde e Pesquisa, v. 4, n. 1, p , jan./abr ISSN [8] Harlow, E.; Lane, D. Antibodies: a laboratory manual. 2.ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory, p [9] Tapchaisri, P., Wangroongsarb, P., Panbangred, W., et al. Detection of Salmonella contamination in food samples by dot-elisa, DNA amplification and bacterial culture. Asian Pac J Allergy Immunol, v.17, n.1, p.41-51, [10] D aoust, J.Y., Sewell, A., Greco, P. Detection of Salmonella in dry foods using refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures: Interlaboratory study. J AOAC Int, v.76, n.4, p , [11] Beumer, R.R.; Brinkman, E.; Rombouts, F.M. Enzyme-linked immunoassays for the detection of Salmonella sp: a comparison with other methods. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v112, p ,