André Fioravante Guerra Enumeração de Estafilococos Coagulase Positiva e Negativa Valença, 1ª Edição, p. Disponível em:

Transcrição

1 çã André Fioravante Guerra Enumeração de Estafilococos Coagulase Positiva e Negativa Valença, 1ª Edição, p. Disponível em:

2 çã ENUMERAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA E NEGATIVA EM ALIMENTOS Estafilococos são bactérias em formato de cocos agrupados em forma de cachos, Gram positivos, anaeróbicos facultativos, mesófilos (temperatura ótima de crescimento a 36 C), catalase positivos e não formadores de esporos. Em alimentos, a espécie patogênica é S. aureus. Este quando atingem uma população acima de 10 6 cel/g de alimento, acumulam quantidade suficiente de enterotoxinas que pode causar intoxicação alimentar em seres humanos e animais. Na Tabela 1 está apresentado alguns fatores de crescimento de S. aureus e produção de enterotoxinas. Tabela 1 Condições de crescimento e produção de enterotoxinas por Staphylococcus aureus. Fator de Crescimento Crescimento microbiano Produção de enterotoxinas Temperatura ( C) (ótimo 36 C) ph 4,5 9,3 6,0 7,0 Atividade de água 0,86 0,99 0,90 0,99 Os testes confirmativos de presença Staphylococcus aureus em alimentos é de forma indireta. Este produz uma enzima chamada coagulase que tem poder de coagular o sangue ao transformar fibrinogênio em fibrina. Portanto, para diagnosticá-lo, utiliza-se plasma de coelho. Como a determinação da espécie é indireta e já há registro na literatura que outros estafilococos também podem produzir coagulase, o resultado da análise não é reportado como Staphylococcus aureus e sim estafilococos coagulase positiva. O habitat natural dos estafilococos são: pele, garganta, narinas, ferimentos, mãos etc. Portanto, para previnir sua presença nos alimentos, é necessário boas práticas de fabricação como: utilizar máscaras, toucas, ter hábito de lavar e sanitizar as mãos e não conversar durante o preparo dos alimentos.

3 ANA LISE Pesar 25 g da amostra e adicionar 225 ml de diluente apropriado, normalmente água peptonada a 0,1% estéril. Homogeneizar em stomacher e preparar mais uma diluição transferindo 1 ml diluição inicial para um tubo contendo 9 ml do mesmo diluente. Inocular em duplicata, 0,1 ml de cada diluição selecionada sobre a superfície seca de placas contendo ágar Baird-Parker. Espalhar com alça de Drigalski ou bastão do tipo hockey até completa absorção da alíquota pelo meio de cultura. Incubar as placas invertidas a 36 C por 48 horas. Após, contar placas que contenham entre 20 e 200 colônias (RDC n 12/2001) ou 15 e 300 (ISO 6888:1999). Colônias típicas (T) são pretas ou cinzas, brilhantes, convexas, medem entre 1 e 1,5 mm após 24 horas de incubação e entre 1,5 e 2,5 após 48h. São circundadas por uma zona clara. Após 24 horas de incubação, um anel opaco pode aparecer circundando as bordas das colônias. Colônias atípicas (A) são pretas ou cinzas, brilhantes ou não, de tamanhos variados, com ou sem bordas estreitas brancas, sem zona clara e anel opaco ou pouco visível. Registrar separadamente as contagens de colônias típicas e atípicas. Selecionar de 3 a 5 colônias de cada tipo (T) e/ou (A) e transferi-lo=as para tubos contendo caldo Infusão Cérebro Coração (BHI), para etapas posteriores de confirmação. Incubar em estufa a 36 C por 24 horas. Para gerar massa celular suficiente para os testes posteriores, convém transferir uma alíquota do crescimento em caldo BHI para outro contendo ágar estoque ou ágar BHI inclinado. Incubar em estufa a 36 C por 24 horas. TESTES CONFIRMATIVOS Coloração de Gram - Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram. Estafilococos são cocos Gram positivos (roxo) agrupados em cachos. Catalase - Com auxílio de uma alça microbiológica, retirar uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%. A formação de bolhas indica presença de catalase. Estafilococos são catalase positiva. Termonuclease - Fazer orifícios equidistantes com cerca de 2 mm de diâmetro no ágar para ensaio de termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA. Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 ± 1 C por 4 horas ou a 50 ± 2 C por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifícios, de um halo rosa superior a 1mm (ágar azul de toluidina) ou claro (ágar para ensaio de DNAse com verde de metila), será

4 indicativo de reação positiva para termonuclease. Staphylococcus aureus são termonuclease positivos. Teste de coagulase - transferir 0,3 ml do cultivo em BHI para um tubo estéril contendo 0,3 ml de plasma de coelho. Incubar em estufa a 36 C por 6 horas e classificar a reação como: Reação 1+ : coágulo pequeno e desorganizado; Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado; Reação 3+ : coágulo grande e organizado; Reação 4+: coagulação total do tubo. Obs - quando a reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, expressar o resultado como estafilococos coagulase positiva. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS A quantidade de colônias selecionadas (típicas e/ou atípicas) para serem confirmadas representa o total de colônias contadas. Portanto, antes do cálculo dos resultados é necessário fazer uma proporção das colônias confirmadas como coagulase positiva e negativa. 1 Passo: calcular o número de colônias típicas e atípicas: Ex. colônias típicas na diluição (10-1 ) colônias atípicas na diluição (10-1 ) Resultado: colônias típicas 100 UFC ,01g x g x = 1,0 x 10 4 UFC/g 0,1 - diluição ,1 - alíquota inoculada 0,1 x 0,1 = 0,01 colônias atípicas 150 UFC ,01g y g y = 1,5 x 10 4 UFC/g 2 Passo: calcular a proporção de colônias confirmadas no teste da coagulase: Contagem: colônias típicas 100 número de colônias selecionadas 5 colônias atípicas 150 número de colônias selecionadas 5 Confirmação: das 5 colônias típicas 3 coagulase positiva e 2 coagulase negativa das 5 colônias atípicas todas coagulase negativa 3 Passo: fazer a proporção: Estafilococos coagulase positiva 1,0 x 10 4 UFC/g N = 6,0 x 10 3 UFC/g (estaf. coag. posit.) N n = 4,0 x 10 3 UFC/g (estaf. coag.neg.) Estafilococos coagulase negativa (todas as colônias confirmadas como coag. negativa) n = 1,5 x ,0 x 10 3 => n = 1,9 x 10 4 UFC/g (estaf. coag. neg.)

5 CALCULADOR ELETRÔNICO PARA CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA E NEGATIVA Alternativamente pode-se utilizar o calculador eletrônico disponível gratuitamente no site: Download: Contagem de Estafilococos coagulase positiva e negativa. Ao preencher o formulário inicial e selecionar a classe do alimento segundo RDC n 12/2001. Preencher o formulário de entrada de produtos:

6 Preencher os campos em branco.

7 Figura 1 Contagem de estafilococos coagulase positiva e negativa em alimentos.

8 ANEXO 1 Halo de transparência devido produção de lecitinase. Figura 2 Crescimento de colônias típicas de estafilococos coagulase positiva em ágar Baird Parker. Figura 3 Coloração de Gram. Estafilococos (aum. 1200x).

9 Reação 4+ Figura 4 Teste de coagulase positiva. Estafilococos coagulase positiva. Ausência de coágulo Figura 5 Teste de coagulase negativa. Estafilococos coagulase negativa.

10 ANEXO 2 - resultados Exemplo 1: Diluição Contagem (UFC) ,1 g ml X ,1 ml 0,1x = 0,1 X = 0,1/0,1 X =0,01 g de alimento inoculado <1 UFC ,01g X g 0,01x = <1 X <1/0,01 X <100 UFC/g Exemplo 2: Diluição Contagem (UFC) ,1 g ml X ,1 ml 0,1x = 0,1 X = 0,1/0,1 X =0,01 g de alimento inoculado 95 UFC ,01g X g 0,01x = 95 X = 9500 X = 9,5 x 10 3 UFC/g Exemplo 3: Diluição Contagem (UFC) 10-1 >250 > ,01 g ml X ,1 ml 0,1x = 0,1 X = 0,1/0,1 X =0,001 g de alimento inoculado 95 UFC ,001g X g 0,001x = 95 X = X = 9,5 x 10 4 UFC/g Exemplo : Diluição Contagem (UFC) 10-1 >250 > >250 >250 0,01 g ml X ,1 ml 0,1x = 0,1 X = 0,1/0,1 X =0,001 g de alimento inoculado >250 UFC ,001g X g 0,001x >250 X > X >2,5 x 10 5 UFC/g

11 BIBLIOGRAFIA BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online Disponivel em: BRASIL. Resolução RDC n 12, de 2 de janeiro de Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA. Diário Oficial da União, BRASIL. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº 62 de 26 de agosto de Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para o Controle de produtos de Origem Animal e Água. Diário Oficial da União, FRANCO, Bernadette Dora Gombossy de Melo. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, p., il. (Biblioteca biomédica). ISBN (Broch.). FORSYTHE, S.J. Microbiologia e Segurança Alimentar. Ed. ARTMED, 2002, 424 p. HARRIGAN, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd. ed., 532 p. London: Academic Press, JAY, James M. Microbiologia de alimentos. 6.ed. Porto Alegre: Artmed, p., il. ISBN (Broch.). LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), P MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importância clinica. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana S.A. 1980, p e ISO 6888:1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium, 1ª Ed., 1999.