Contagem Padrão em Placas. Profa. Leila Larisa Medeiros Marques

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1 Contagem Padrão em Placas Profa. Leila Larisa Medeiros Marques

2 1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padrão de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis. Aplica-se a amostras de matérias-primas, água e alimentos. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em ágar padrão para contagem seguida de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar padrão para contagem (PCA); Solução salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.

3 2) Meio de Cultura 2.1) Ágar Padrão para Contagem (PCA): a) Composição: Triptona Extrato de Levedura Glicose Ágar Água destilada 5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml Dissolver os componentes em água destilada. O ph final deste meio deve ser 7,0 ± 0,2 Aquecer até completa dissolução Esterilizar em autoclave a 121 o C/15 min. Observações: na forma desidratada, proceder conforme instruções do fabricante.

4 Ágar padrão para contagem (PCA) desidratado Pesar o ágar padrão para contagem de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução do ágar. Verificar a necessidade de ajuste de ph, conforme norma específica do laboratório. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Esterilizar a 121 ± 1ºC por 15 minutos. Identificar e armazenar adequadamente.

5 2.2) Solução Diluente: Solução salina peptonada 0,1% (Diluente): Pesar separadamente os seguintes componentes: Cloreto de sódio - 8,5 g Peptona - 1,0 g Água destilada/deionizada ml ph 7,0 ± 0,2 Transferir para recipiente adequado. Agitar com auxílio de bastão de vidro até dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de ph, conforme norma específica do laboratório. Distribuir de forma a garantir o volume desejado após a autoclavação. Identificar e datar. Autoclavar a 121 ± 1ºC por 15 minutos. Armazenar adequadamente.

6 Obs. MEIOS DE CULTURA: Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes fabricantes podem apresentar pequenas diferenças em suas composições. Observar atentamente a quantidade necessária de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilização em cada caso. Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulação, comparando-a com aquela indicada neste manual. Às vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substância. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-se à peptona de caseína obtida por digestão tríptica ou pancreática.

7 Grupo de risco de componentes de meio de cultura (Instrução Normativa 62 de 2003): N = nocivo; I = irritante; T = tóxico; H = hidropoluente; P = perigoso para o meio ambiente; C = corrosivo; O = oxidante; F = inflamável; E = explosivo; M = mutagênico; Co = comburente.

8 3. Metodologia e Técnicas de Análise 3.1. Técnica de análise: a) Retirar assepticamente 25g ou 25 ml da amostra e preparar diluições sucessivas; b) Pipetar alíquotas de 1 ml de cada diluição para placas de Petri (100 x 20 mm) esterilizadas, fazendo de cada diluição placas em duplicata; c) Adicionar a cada placa 15 a 20 ml de ágar padrão para contagem, previamente fundido e resfriado à temperatura de 44 a 46 o C; d) Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de oito (cerca de 10 vezes) e deixar a temperatura ambiente até a completa solidificação do ágar; e) Após a solidificação, incubar as placas em posição invertida a o C/48 horas. Obs.: Leitura: - Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colônias; - Amostras de água: Placas que contenham entre 30 e 300 colônias.

9 Diluições Seriadas: AMOSTRA DE ALIMENTO 225 ML DE DILUENTE (ÁGUA PEPTONADA) Homogeneizar Diluição 10-1 ou 1/10 ou 0,10 1 ml 1 ml 1 ml Diluição 10-2 ou 1/100 ou 0,010 As diluições seriadas devem ser realizadas para a partir delas se fazer a inoculação nos meios de cultura; É feita pelo menos uma inoculação de cada diluição 9 ml diluente Diluição 10-3 ou 1/1000 ou 0, ml diluente Diluição 10-4 ou 1/10000 ou 0,00010 Com o alimento diluído, fica mais fácil encontrar uma placa ideal para se fazer a contagem de microrganismos

10 Inoculação: semeadura pour plate A partir das diluições seriadas: ml 1 ml 1 ml 1 ml MEIO MEIO MEIO MEIO Após inoculação, inverter as placas e incubar em estufa ESTUFA 37 o C 24/48 h

11 Passos da Técnica de Semeadura da Amostra em Profundidade

12 3.2. Resultado: Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem, somente as placas da mesma diluição que apresentarem de 25 a 250 colônias ou 30 a 300, conforme amostra; Multiplicar a média aritmética das mesmas pelo respectivo fator de diluição e expressar o resultado em Unidades Formadoras de Colônia /1,0 g de amostra (UFC/g) Exemplo: Placa 10-1 : Acima de 1000 UFC (unidades formadoras de colônia) Placa 10-2 : 250 UFC Placa 10-3 : 23 UFC Placa 10-4 : 0 UFC A melhor placa para se obter o resultado desta contagem é a placa da diluição Resultado: 250 x 10 2 = 250 x 100 = UFC/g ou ml Expressar o resultado sempre em exponencial: 2,5 x 10 4 UFC/g de alimento.

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14 4) Significado nos Alimentos Esta contagem detecta em um alimento, o número de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas presentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada; A contagem padrão em placas (CPP) tem sido usada como indicador da qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéia sobre seu tempo útil de conservação.

15 Sua presença em grande número indica: Matérias-primas excessivamente contaminadas; Limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas; Higiene inadequada na produção; Condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas circunstâncias. OBS 1.: Estudar a aula de microrganismos indicadoresmesófilos!!!!!!!!!! OBS2.: Para expressão dos resultados, consultar a IN62, 2003 (anexo IV- procedimento para contagem de colônias).