MF-0406.R-3 - MÉTODO DE DETERMNAÇÃO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS FORMADORAS DE COLÔNIAS, PELA TÉCNICA POUR PLATE

Transcrição

1 MF-0406.R-3 - MÉTODO DE DETERMNAÇÃO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS FORMADORAS DE COLÔNIAS, PELA TÉCNICA POUR PLATE Notas: Aprovado pelo Deliberação CECA nº 3 965, de 16 de janeiro de 2001, Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de OBJETIVO Definir o método de determinação de bactérias heterotróficas formadoras de colônias existentes em amostras de águas, pela técnica "Pour Plate". 2 DOCUMENTO DE REFERÊNCIA MN MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA. 3 DEFINIÇÃO Para efeito deste método adota-se a seguinte definição: Bactérias Heterotróficas - são as bactérias que, além do dióxido de carbono (CO 2 ), necessitam de um ou mais compostos orgânicos para a síntese de seu protoplasto. 4 RESUMO DA TÉCNICA Consiste na adição do meio de cultura em estado líquido e estabilizado à temperatura de 45 (±1) ºC ao inóculo da amostra. Volumes decimais adequados da amostra são inoculados em placas de Petri, em duplicatas, adicionando-se a seguir o meio de cultura agar triptona glicose extrato de levedura, previamente fundido e sua temperatura normalizada de 44 a 46 ºC. Após determinado período de incubação é feita a contagem das colônias (expressas em unidades formadoras de colônias), utilizando-se um contador de colônias tipo Quebec.

2 5 PRINCÍPIO DO MÉTODO As bactérias podem, sob determinadas condições de nutrição, temperatura e tempo de incubação, se desenvolver formando colônias que serão visualizadas em uma placa de Petri contendo meio de cultura adequado com agar. 6 APLICABILIDADE Aplicável na avaliação das condições higiênicas das águas potáveis e de piscinas e da eficiência de estações de tratamento de água na remoção de bactérias. 7 INTERFERÊNCIAS Para evitar interferências, a amostra deve ser coletada de acordo com o MN-707. O cloro residual presente na amostra pode levar a resultados falsos devendo ser neutralizado no momento da coleta. A temperatura da amostragem e o tempo decorrido entre a coleta e a análise também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve ser mantida entre 4 e 10 ºC até o início da análise, que deverá ocorrer no prazo máximo de 30 horas, preferencialmente dentro de 8 horas. 8 APARELHAGEM E MATERIAL 8.1 Os equipamentos e a vidraria necessários para a realização dos testes consistem de: Autoclave Incubadora bacteriológica regulada para 35 ± 0,5 ºC Balança com precisão de 0,1 mg Medidor de ph Contador de colônias, tipo Quebec Banho-maria regulado para 44 a 46 C Placas de Petri Frascos para água de diluição Pipetas bacteriológicas tipo Mohr de 5 e 10 ml Tubos de ensaio Estante para tubos de ensaio Bucha de algodão Gaze

3 8.2 Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro. 8.3 Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso. 9 REAGENTES E SOLUÇÕES 9.1 ÁGUA DESTILADA ESTÉRIL Água destilada autoclavada 9.2 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1 N Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH) p.a, dissolver em pequena quantidade de água destilada estéril, transferir para balão volumétrico e completar o volume a 1000 ml. Guardar em frasco apropriado. 9.3 MEIO DE CULTURA AGAR TRIPTONA GLICOSE EXTRATO DE LEVEDURA (PLATE COUNT AGAR) Poderá ser utilizado o meio de cultura pronto, encontrado no comércio sob a forma de pó desidratado, ou então preparado no laboratório a partir dos ingredientes básicos. Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 23,5 g do meio desidratado pronto ou pesar 5,0 g de triptona; 2,5 g de extrato de levedura; 1,0 g de glicose; e 15,0 g de agar. Acrescentar ml de água destilada fria, deixando em repouso durante aproximadamente 15 minutos. Aquecer agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Se necessário, ajustar o ph com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N. Distribuir volumes de 15 ml em tubos de ensaio de tamanho adequado. Tampar com bucha de algodão recoberta com gaze e esterilizar em autoclave a 121 C durante 15 minutos. 9.4 SOLUÇÃO ESTOQUE A Dissolver 34,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) p.a em 500 ml de água destilada estéril, ajustar o ph para 7,2(± 0,1) com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N e completar o volume para ml com

4 água destilada estéril. Colocar em frascos adequados e guardar na geladeira. 9.5 SOLUÇÃO ESTOQUE B Dissolver 81,1 g de cloreto de magnésio (MgCl 2.6 H 2 O) p.a em ml de água destilada estéril. Colocar em frascos adequados e guardar na geladeira. 9.6 ÁGUA DE DILUIÇÃO FOSFATADA Pipetar 1,25 ml da solução estoque A e 5,0 ml da solução estoque B e diluir em água destilada, completando o volume a ml. Distribuir em frascos de diluição quantidades que assegurem, após autoclavação a 121 ºC, durante 20 minutos, volume de 90 (±2) ml. 10 ENSAIOS 10.1 Antes de iniciar o trabalho, as bancadas devem ser desinfetadas com desinfetante que não deixe resíduo Preparar as placas de Petri em duplicatas para cada volume da amostra a ser inoculada e proceder as suas identificações com o número dado pelo laboratório Homogeneizar a amostra, no mínimo 25 vezes, agitando vigorosamente o frasco Preparar diluições da amostra em água de diluição fosfatada Com uma pipeta estéril de 1 ml e com os cuidados de assepsia, transferir 1 ml da amostra e das diluições, em duplicatas, para as placas de Petri correspondentes Após inoculação de todos os volumes requeridos da amostra e diluições, e no espaço de tempo inferior a 20 minutos, entreabrir cada placa e acrescentar 15 ml do agar triptona glicose extrato de levedura, previamente fundido e estabilizado em banho-maria (44 a 46 ºC), tendo o cuidado de flambar a boca do tubo antes de verter o meio às placas Homogeneizar o inóculo com o meio contido na placa, com movimentos circulares moderados, para evitar a projeção do conteúdo para fora da placa.

5 10.8 Após a solidificação do meio, incubar as placas a 35 (±0,5) ºC, em posição invertida, durante 48 (±3) horas. Para águas engarrafadas, as placas deverão ser incubadas, na mesma temperatura, por período de 72 (±4) horas Após a incubação, selecionar as placas em duplicatas que tenham entre 30 e 300 colônias e efetuar a contagem nessas placas com o auxílio de um contador de colônias tipo Quebec. Se todas as diluições apresentarem contagens inferiores a 30, contar as placas em duplicatas correspondentes à menor diluição. 11 RESULTADO 11.1 Calcular a média aritmética das contagens e multiplicar o resultado pela diluição utilizada nessas placas Se todas as placas de todas as diluições inoculadas tiverem mais de 300 colônias, considerar o resultado como maior que trezentos (> 300). Caso haja necessidade de contagem exata, solicitar nova amostra Se, porém, de todas as diluições inoculações, nenhuma placa apresentar colônia, considerar o resultado como menor que um (< 1) multiplicado pela diluição correspondente Expressar o resultado em unidades formadoras de colônias de bactérias heterotróficas por mililitro (u.f.c./ml). 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater. 16th. ed., Washington, D.C., U.S.A. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Microbiological methods for monitoring the environment. Water and wastes. EPA - 600/ , Cincinnati, Dec