DiversiLab Staphylococcus Kit

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1 DiversiLab Staphylococcus Kit 48-Test Kit BBCI Catalog Number: DL-SA01 ENGLISH biomérieux Not For Diagnostic Use. Materials supplied in the kit Rep-PCR Reagents Storage Range: -10 to -30 C Cap Color Name Volume Purple Rep-PCR MM1 864 µl Colorless Primer Mix LL 100 µl Colorless Positive Control C3 16 µl Colorless Negative Control 16 µl Additional materials required, but not supplied Bacterial DNA isolation kit (UltraClean Microbial DNA Isolation Kit) Taq DNA polymerase* (AmpliTaq DNA polymerase plus GeneAmp 10X PCR Buffer [containing 15mM MgCl 2 ] by Applied Biosystems) Thermal cycler (GeneAmp PCR System 9600 or 9700 by Applied Biosystems) Powder-free gloves, lab coat and eye protection Pipettes: µl, µl, µl, multi-channel or repeater pipette (optional) Aerosol resistant barrier pipette tips: µl, µl, µl Microcentrifuge tubes, 1.5 ml Microcentrifuge, variable speed Cooler Trays: 0.2 ml and 1.5 ml PCR tubes and caps: 0.2 ml PCR tray retainer set Rack to hold 0.2 ml and 1.5 ml tubes Vortex Intended use The DiversiLab DNA fingerprinting kits are designed to generate rep-pcr DNA fingerprints from pure-cultured microbial samples. These kits contain the reagents and buffers needed to set up PCR reactions using rep-pcr primers, starting from extracted genomic DNA from microbial isolates. Introduction The DiversiLab DNA fingerprinting kits use rep-pcr technology, which takes advantage of the non-coding repetitive sequences found interspersed throughout the genomes of all bacteria studied to date. 1,2,3 Key to the DiversiLab kit is primer sets that are complementary to these repetitive sequences. When PCR is performed using these primer sets, the DNA sequences between the repetitive elements are amplified. Thus, multiple fragments throughout the microbial genome are amplified simultaneously. Principle of the DiversiLab System The major steps involved in generating rep-pcr DNA fingerprints are as follows: Extract DNA from purified microbial cultures. Log sample information into the DiversiLab software (Internet-based). Perform rep-pcr amplification. Separate the DNA fragments using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Compare fingerprints using the statistical analysis feature of the DiversiLab software. * NOTICE: This kit should only be used with AmpliTaq DNA polymerase, a Taq DNA polymerase that may be covered by one or more patents, which has been obtained from an authorized, licensed source. Neither the offer to sell nor the sale of this kit nor these instructions constitutes an express or implied license to use AmpliTaq or other Taq DNA polymerases. Additionally, the use of a thermal cycler may require a license under one or more patents held by third parties. This kit should only be used with an authorized, licensed thermal cycler. It is the sole responsibility of the user of this kit to ensure that use of the kit does not infringe the patent rights of third parties. Thus, the user of this kit has the responsibility to obtain any requisite license from parties other than the manufacturer and seller of this kit. Information on purchasing licenses to use AmpliTaq may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com) Page 1 of 3

2 This document provides the specific procedure associated with rep-pcr amplification. Refer also to the DiversiLab Software User's Guide and the DiversiLab Instructions for Use of LabChip Devices insert. Instructions for use This kit supplies sufficient reagents for the number of tests indicated. We recommend running a negative and positive control for each rep-pcr experiment performed. Do not use the components of this kit beyond the expiration date printed on the box. Use available preventative measures to avoid contamination and cross-contamination of PCR tubes and reagents, including but not limited to the following: Separate the PCR workspace from other laboratory areas, especially those involving microbial samples or postamplification products. Clean the workspace with 10% bleach, followed by 70% ethanol. Change gloves often and use dedicated lab coats and equipment for pre- and post-pcr areas. Separate pre-pcr and post-pcr areas as much as possible. Use nuclease-free, disposable tubes and aerosolresistant pipette tips. Test limitations This kit may not produce useful fingerprints with some microbial samples. Although repetitive sequences have been found in all bacteria studied to date, it is possible that the primers supplied in this kit will not generate unique or discriminatory fingerprints with some microbial strains. The results obtained from using the DiversiLab kit may not be useful or reliable if the provided protocol is not followed exactly, or if the results are applied in a manner for which they were not intended. This product is not for diagnostic use and the results of this test should not be used to diagnose disease, or to cure, mitigate, treat, or prevent disease in a patient. Collection and preparation of samples Proper purification of genomic DNA is critical for successful rep-pcr. Kit optimization has been performed with the UltraClean Microbial DNA Isolation Kit. The UltraClean kit is available through biomérieux (Mo Bio 50 Test Kit catalog # or Mo Bio 250 Test Kit catalog # ). We recommend checking extraction consistency and DNA integrity by agarose gel electrophoresis. If a spectrophotometer is available, best results are obtained from purified genomic DNA with an A 260 /A 280 = Use 2 µl of genomic DNA at a concentration of ng/µl in the rep-pcr protocol. Procedure for the DiversiLab DNA fingerprinting kit Step 1: Set up rep-pcr Prepare a master mix 1. Allow the contents of the rep-pcr reagent box and the 10X PCR buffer to thaw completely. 2. Vortex briefly and centrifuge each reagent tube at 10,000 x g for 3 seconds. 3. In a nuclease-free 1.5 ml microcentrifuge tube, add the following amounts of reagents for each amplification to be performed: Preparation must be set up on ice or in a PCR cooler tray. We recommend adding reagents equivalent to one extra reaction for every 8-12 tests to be run (to compensate for volume loss during pipetting). The volumes of reagents provided are sufficient provided a minimum of 8 samples is run per setup. Reagent Volume/Reaction (µl) Number of Reactions Total Volume For Master Mix (µl) Rep-PCR MM N 18.0 x (N + extra) GeneAmp 10X PCR Buffer 2.5 N 2.5 x (N + extra) Primer Mix LL 2.0 N 2.0 x (N + extra) AmpliTaq DNA Polymerase* 0.5 N 0.5 x (N + extra) Total Volume 23.0 N 23.0 x (N + extra) *Taq should be the last reagent added to the master mix and should be kept cold at all times. Aliquot master mix 1. Set up a nuclease-free PCR tube for each sample and control in a cold block or ice. Label the tubes according to the job worksheet. 2. Thoroughly mix the contents of the master mix tube. Centrifuge at 10,000 x g for 5 seconds. 3. Aliquot 23 µl of the master mix into the bottom of each PCR tube Page 2 of 3

3 Add DNA to PCR tubes 1. Add 2 µl sample DNA (concentration of ng/µl), Positive Control or Negative Control to the bottom of the corresponding PCR tube. Pipette up and down several times to mix. 2. Cap the PCR tubes securely. Gently tap tubes on benchtop to bring reagents to the bottom. Return the tubes to the cold block or ice. Step 2: Perform rep-pcr amplification 1. Program the thermal cycler as shown below. Rep-PCR Protocol - reppcr45 Initial denaturation: 94 C 2 min Repeat cycle: 35 cycles Denaturation: 94 C 30 sec Annealing: 45 C 30 sec Extension: 70 C 90 sec Final extension: 70 C 3 min Hold: 4 C 2. For optimal amplification, pause the program after allowing the thermal cycler to warm to 94 C during initial denaturation. 3. Insert the PCR tubes into the preheated thermal cycler. Note: The temperature of the block will drop. 4. Resume the program after the thermal cycler temperature returns to 94 C. 5. Continue directly to DNA separation with the Caliper LabChip device, or store rep-pcr product at 4 C or -20 C. See "Instructions for Use of LabChip Devices," provided with the DNA chips and DNA Chip Reagents and Supplies. Possible sources of error Pure microbial cultures must be used. Mixed or contaminated cultures may result in inconsistent fingerprints. Contamination of microbial cultures, incomplete lysis of cells, carryover of reagents used during DNA extraction, and fluctuations during rep-pcr amplification may cause the fingerprints to be weak or absent. References 1. Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5: Versalovic J, Koeuth T, Lupski J Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J Repetitive sequence-based PCR (rep-pcr) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York. Contact information 425 River Road Athens, GA USA For technical assistance in the USA, contact biomérieux Customer Service at Outside the USA, contact your local biomérieux Representative. This article or its use is covered by one or more of the following U.S. patents: 5,523,217 and 5,691,136. Agilent is a registered trademark of Agilent Technologies, Inc. AmpliTaq and GeneAmp are registered trademarks of Applied Biosystems Corporation in the United States and/or other countries. Caliper and LabChip are registered trademarks of Caliper Life Sciences in the United States and/or other countries. DiversiLab is a trademark of biomérieux, Inc. UltraClean is a trademark of Mo Bio Laboratories, Inc. November Page 3 of 3

4 DiversiLab Staphylococcus Kit Envase para 48 pruebas Referencia de BBCI: DL-SA01 ESPAÑOL biomérieux No destinado al uso diagnóstico. Materiales suministrados en el envase Reactivos Rep-PCR Temperatura de almacenamiento: -10 a -30 C Color de la tapa Nombre Volumen Morado Rep-PCR MM1 864 µl Incoloro Primer Mix LL 100 µl Incoloro Positive Control C3 16 µl Incoloro Negative Control 16 µl Materiales adicionales necesarios pero no suministrados Envase para aislamiento de DNA bacteriano (UltraClean Microbial DNA Isolation Kit) Taq DNA polimerasa* (AmpliTaq DNA polimerasa más GeneAmp 10X PCR Buffer [que contiene 15mM de MgCl 2 ] de Applied Biosystems) Termociclador (GeneAmp PCR System 9600 o 9700 de Applied Biosystems) Guantes sin talco, batas de laboratorio y protección ocular Pipetas: Pipeta de 0,1-10 µl, µl, µl, multicanal o de repetición (opcional) Puntas de pipeta con barrera resistente a aerosoles: 0,1-10 µl, µl, µl Tubos para microcentrifugación, 1,5 ml Microcentrífuga, velocidad variable Soporte refrigerado para tubos de 0,2 ml y 1,5 ml Tubos y tapas PCR: 0,2 ml Juego de bandejas PCR Gradilla para tubos de 0,2 ml y 1,5 ml Agitador vórtex Uso previsto Los envases para determinación de la identificación genética de DNA DiversiLab están diseñados para generar identificaciones genéticas de DNA sobre producto de rep-pcr a partir de muestras microbianas de cultivos puros. Estos envases contienen los reactivos y tampones necesarios para realizar reacciones PCR utilizando cebadores rep-pcr, a partir de DNA genómico extraído de aislados microbianos. Introducción Los envases de determinación de la identificación genética de DNA DiversiLab utilizan la tecnología rep-pcr, que aprovecha las secuencias repetitivas no codificantes dispersas a lo largo de los genomas de todas las bacterias estudiadas hasta la fecha. 1,2,3 Un elemento clave del envase DiversiLab es la serie de juegos de cebadores que son complementarios a estas secuencias repetitivas. Cuando se realiza la PCR utilizando estos juegos de cebadores, se amplifican las secuencias de DNA entre los elementos repetitivos. De este modo, se amplifican simultáneamente múltiples chips a lo largo del genoma microbiano. Principio del sistema DiversiLab Los pasos principales involucrados en generar la identificación genérica de DNA rep-pcr son los siguientes: Extraer el DNA de cultivos microbianos purificados. Registrar la información de las muestras en el software DiversiLab (basado en Internet). Realizar una amplificación rep-pcr. * AVISO: Este envase sólo debe utilizarse con AmpliTaq DNA polimerasa, una Taq DNA polimerasa que puede estar cubierta por una o más patentes, que se ha obtenido de una fuente autorizada, con licencia. Ni la oferta para vender este envase, ni la venta misma, ni estas instrucciones constituyen una licencia expresa o implícita para usar AmpliTaq u otras Taq DNA polimerasas. Asimismo, la utilización de un termociclador puede requerir una licencia bajo una o más patentes pertenecientes a terceros. Este envase sólo debe utilizarse con un termociclador autorizado, con licencia. Es la exclusiva responsabilidad del usuario de este envase asegurar que la utilización del envase no infrinja los derechos de patentes de terceros. Por tanto, el usuario de este envase tiene la responsabilidad de obtener cualquier licencia requerida de terceros diferentes del fabricante y vendedor de este envase. Puede obtenerse información sobre la adquisición de licencias para utilizar AmpliTaq poniéndose en contacto con el Director de Licencias de Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com) Página 1 de 3

5 Separar los chips de DNA utilizando el equipo Agilent 2100 Bioanalyzer. Comparar las identificaciones genéticas utilizando la función de análisis estadístico del software DiversiLab. Este documento proporciona un procedimiento específico asociado con la amplificación rep-pcr. Consulte también la guía del usuario del software DiversiLab y el prospecto con instrucciones de DiversiLab para la utilización de dispositivos LabChip. Instrucciones de uso Este envase suministra suficiente cantidad de reactivos para el número de pruebas indicados. Recomendamos efectuar un control negativo y positivo por cada experimento rep-pcr realizado. No utilice los componentes de este envase después de la fecha de caducidad impresa en la caja. Utilice las medidas preventivas disponibles para evitar la contaminación cruzada de los tubos y reactivos PCR, incluidas las siguientes, sin limitarse a ellas: Separe el espacio de trabajo PCR de otras áreas del laboratorio, especialmente aquellas relacionadas con muestras microbianas o productos de amplificación posterior. Limpie el espacio de trabajo con lejía al 10%, seguido de etanol al 70%. Cámbiese los guantes con frecuencia y utilice batas de laboratorio y equipos dedicados para las áreas pre- y post-pcr. Separe las áreas pre-pcr y post-pcr tanto como sea posible. Utilice tubos desechables sin nucleasa y puntas de pipeta resistentes a aerosoles. Limitaciones de la prueba Este envase puede no producir identificaciones genéticas útiles en el caso de algunas muestras microbianas. Si se han encontrado secuencias repetitivas en todas las bacterias estudiadas hasta la fecha, es posible que los cebadores suministrados en este envase no generen huellas digitales únicas o discriminatorias en el caso de algunas cepas microbianas. Los resultados obtenidos al utilizar el envase DiversiLab pueden no resultar útiles o fiables si el protocolo recomendado no se sigue al pie de la letra, o si los resultados se aplican de una manera para la cual no fueron destinados. Este producto no sirve para uso diagnóstico y los resultados de esta prueba no deben utilizarse para diagnosticar enfermedades, ni para curar, mitigar, tratar o prevenir enfermedades en un paciente. Recolección y preparación de las muestras Una purificación correcta del DNA genómico resulta crítica para realizar una rep-pcr satisfactoria. La optimización del envase se ha realizado con el UltraClean Microbial DNA Isolation Kit. biomérieux ofrece el envase UltraClean (envase para 50 pruebas Mo Bio, referencia , o envase para 250 pruebas Mo Bio, referencia ). Recomendamos verificar la consistencia de la extracción y la integridad del DNA mediante electroforesis en gel de agarosa. Si hay un espectrofotómetro disponible, se obtienen resultados óptimos a partir de un DNA genómico purificado con un valor de A 260 /A 280 = 1,7-1,9. Utilice 2 µl de DNA genómico a una concentración de ng/µl en el protocolo rep-pcr. Procedimiento para el envase de determinación de la identificación genética de DNA DiversiLab Paso 1: Preparación de la rep-pcr Prepare la mezcla maestra 1. Permita que el contenido de la caja de reactivos de rep-pcr y del tampón 10X PCR se descongele completamente. 2. Agite brevemente en vórtex y centrifugue cada tubo de reactivo a x g durante 3 segundos. 3. En un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml libre de nucleasa, agregue las cantidades siguientes de reactivos por cada amplificación a realizar: La preparación debe realizarse sobre hielo o en un soporte refrigerado para PCR. Recomendamos agregar una cantidad de reactivos equivalente a una reacción adicional por cada 8-12 pruebas que deban realizarse (para compensar la pérdida de volumen durante el pipeteado). Los volúmenes de reactivos provistos son suficientes siempre y cuando se procese un mínimo de 8 muestras por configuración. Reactivo Volumen/reacción (µl) Número de reacción Volumen total para la mezcla maestra (µl) Rep-PCR MM1 18,0 N 18,0 x (N + adicional) GeneAmp 10X PCR Buffer 2,5 N 2,5 x (N + adicional) Primer Mix LL 2,0 N 2,0 x (N + adicional) AmpliTaq DNA Polymerase* 0,5 N 0,5 x (N + adicional) Volumen total 23,0 N 23,0 x (N + adicional) *La Taq debe ser el último reactivo agregado a la mezcla maestra y debe mantenerse fría en todo momento Página 2 de 3

6 Adición de la mezcla maestra 1. Prepare un tubo de PCR libre de nucleasa por cada muestra y control en un bloque frío o hielo. Etiquete los tubos de acuerdo con la hoja de trabajo. 2. Mezcle completamente el contenido del tubo de mezcla maestra. Centrifugue a x g durante 5 segundos. 3. Separe una alícuota de 23 µl de la mezcla maestra en el fondo de cada tubo PCR. Agregue DNA a los tubos PCR 1. Agregue 2 µl de DNA de muestra (concentración de ng/µl), Control Positivo o Control Negativo al fondo del tubo de PCR correspondiente. Pipetee arriba y abajo varias veces para mezclar. 2. Tape los tubos PCR de manera firme. Golpee delicadamente los tubos sobre la superficie de trabajo para llevar los reactivos al fondo. Vuelva a colocar los tubos en el bloque frío o hielo. Paso 2: Realizar una amplificación rep-pcr 1. Programe el termociclador tal como se indica a continuación. Protocolo Rep-PCR - reppcr45 Desnaturalización inicial: 94 C 2 min Número de ciclos: 35 ciclos Desnaturalización: 94 C 30 seg Hibridación: 45 C 30 seg Extensión: 70 C 90 seg Extensión final: 70 C 3 min Retención: 4 C 2. Para lograr una óptima amplificación, ponga el programa en pausa después de permitir que el termociclador se caliente a 94 C durante la desnaturalización inicial. 3. Inserte los tubos de PCR en el termociclador precalentado. Nota: Disminuirá la temperatura del bloque. 4. Reinicie el programa después de que la temperatura del termociclador vuelva a 94 C. 5. Continuar directamente con la separación del DNA utilizando el dispositivo Caliper, o almacene el producto rep-pcr a 4 C o -20 C. Consulte "Instrucciones para la utilización de dispositivos LabChip ", provisto con los chips de DNA y los reactivos para chips de DNA. Fuentes posibles de error Deben utilizarse cultivos microbianos puros. Una mezcla de cultivos o la presencia de cultivos contaminados pueden producir identificaciones genéticas incoherentes. La contaminación de los cultivos microbianos, una lisis incompleta de las células, una transferencia de los reactivos utilizados durante la extracción del DNA y las fluctuaciones durante la amplificación rep-pcr puede causar que las huellas genética sean débiles o ausentes. Referencias 1. Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5: Versalovic J, Koeuth T, Lupski J Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J Repetitive sequence-based PCR (rep-pcr) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York. Información de contacto 425 River Road Athens, GA USA Para obtener asistencia técnica en EE. UU., póngase en contacto con el Servicio técnico de biomérieux llamando al Fuera de EE. UU., póngase en contacto con el representante local de biomérieux. Este artículo o su uso están cubiertos por una o más de las siguientes patentes de EE. UU.: y Agilent es una marca registrada de Agilent Technologies, Inc. AmpliTaq y GeneAmp son marcas registradas de Applied Biosystems Corporation en Estados Unidos y otros países. Caliper y LabChip son marcas registradas de Caliper Life Sciences en Estados Unidos y otros países. DiversiLab es una marca comercial de biomérieux, Inc. UltraClean es una marca comercial de Mo Bio Laboratories, Inc. Noviembre de Página 3 de 3

7 DiversiLab Staphylococcus Kit Coffret pour 48 tests Référence du catalogue BBCI : DL-SA01 FRANÇAIS biomérieux Ne peut être utilisé à des fins diagnostiques. Matériaux fournis dans le kit Réactifs rep-pcr Autre matériel nécessaire, mais non fourni Température de stockage : -10 à -30 C Couleur bouchon Nom Volume Mauve Rep-PCR MM1 864 µl Incolore Primer Mix LL 100 µl Incolore Contrôle positif C3 16 µl Incolore Contrôle négatif 16 µl Kit d extraction de l ADN bactérien (Kit d extraction d ADN UltraClean ) ADN Taq polymérase* (ADN polymérase AmpliTaq avec tampon 10X PCR GeneAmp [contenant 15mM MgCl 2 ] Applied Biosystems) Thermocycleur ( type Système GeneAmp PCR 9600 ou 9700 Applied Biosystems) Gants non poudrés, blouse de laboratoire et protection des yeux Pipettes : pipette 0,1-10 µl, µl, µl, multi-canaux ou à répétition (en option) Embouts de pipette avec filtre résistant aux aérosols : 0,1-10 µl, µl, µl Microtubes à centrifuger, 1,5 ml Microcentrifugeuse à vitesse variable Plateaux de refroidissement : 0,2 ml et 1,5 ml Tubes et bouchons PCR : 0,2 ml Plateaux PCR Portoir pour contenir des tubes de 0,2 ml et 1,5 ml Vortex Utilisation Les kits d empreintes spécifiques ADN DiversiLab sont conçus pour générer des empreintes d'adn par rep-pcr à partir d échantillons microbiens de cultures pures. Ces kits contiennent les réactifs et tampons nécessaires à l exécution de réactions de PCR utilisant des amorces rep-pcr, partant d ADN génomique extrait d isolats microbiens. Introduction Les kits d empreintes d ADN DiversiLab utilisent la technologie rep-pcr, qui utilise des séquences répétitives non codantes que l on trouve disséminées dans les génomes de toutes les bactéries étudiées à ce jour. 1,2,3 Les réactifs DiversiLab contiennent des jeux d amorces complémentaires de ces séquences répétitives. Lorsque la PCR est effectuée en utilisant ces jeux d amorces, les séquences d ADN entre les éléments répétitifs sont amplifiées. Ainsi, de nombreux fragments sont amplifiés simultanément dans tout le génome microbien. Principe du système DiversiLab Les étapes principales impliquées dans la génération d empreintes d ADN rep-pcr sont les suivantes : Extraction de l ADN des cultures microbiennes purifiées. Saisie des informations sur les échantillons dans le logiciel DiversiLab (basé sur l Internet). Amplification par rep-pcr. Séparation des fragments d ADN en utilisant l Agilent 2100 Bioanalyzer. Comparaison des empreintes en utilisant la fonction d analyse statistique du logiciel DiversiLab. * NOTIFICATION : Ce kit ne doit être utilisé qu avec l ADN polymérase AmpliTaq, un ADN polymérase Taq qui peut être couvert par un ou plusieurs brevets, qui ont été obtenus auprès d une source autorisée, sous licence. Ni l offre de vente, ni la vente de ce kit ou encore ces instructions ne constituent une licence expresse ou implicite d utilisation d AmpliTaq ou autres ADN polymérases Taq. De plus, l utilisation d un thermocycleur nécessite une licence sous un ou plusieurs brevets détenus par des tiers. Ce kit ne doit être utilisé que par un thermocycleur autorisé, sous licence. Il appartient uniquement à l utilisateur de ce kit de s assurer que l utilisation du kit n enfreint pas les droits du brevet de tiers. De ce fait, l utilisateur de ce kit est responsable de l obtention de toute licence requise par des tiers autres que le fabricant ou le vendeur de ce kit. Il est possible de se procurer des informations concernant l achat de licences pour utiliser AmpliTaq en contactant le directeur des licences chez Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com) Page 1 sur 3

8 Ce document fournit la procédure spécifique associée à l amplification par rep-pcr. Se reporter au guide utilisateur du logiciel DiversiLab et au mode d emploi DiversiLab contenu dans les fiches techniques des dispositifs LabChip. Mode d emploi Ce kit fournit suffisamment de réactifs pour le nombre de tests indiqués. Nous recommandons d effectuer un contrôle négatif et positif pour chaque série de rep-pcr effectuée. Ne pas utiliser les composants de ce kit au-delà de la date d expiration indiquée sur la boîte. Prendre les mesures préventives suivantes afin d éviter la contamination croisée des tubes et réactifs PCR : Séparer l espace de travail PCR des autres zones du laboratoire, tout spécialement celles impliquant des échantillons microbiens ou des produits post-amplification. Nettoyer l espace de travail avec 10 % de Javel, suivi de 70 % d éthanol. Changer souvent de gants et utiliser du matériel ainsi que des blouses de laboratoires spéciaux pour les zones pré et post-pcr. Séparer les zones pré-pcr et post-pcr autant que possible. Utiliser des tubes sans nucléase et jetables ainsi que des embouts de pipette avec filtres résistants aux aérosols. Limites du test Ce kit peut ne pas fournir de résultats utiles avec certains échantillons microbiens. Bien que des séquences répétitives existent dans toutes les bactéries étudiées à ce jour, il est possible que les amorces fournies dans ce kit ne génèrent pas d empreintes uniques ou discriminantes avec certaines souches microbiennes. Les résultats obtenus avec l utilisation d un kit DiversiLab peuvent ne pas être utiles ou fiables si le protocole fourni n est pas parfaitement suivi. Ce produit n est pas conçu pour une utilisation diagnostique et les résultats de ce test ne doivent pas être utilisés pour diagnostiquer une maladie, ou pour soigner, limiter, traiter ou empêcher une maladie chez un patient. Prélèvement et préparation d échantillons Une purification correcte de l ADN génomique est essentielle pour une rep-pcr réussie. Le kit a été optimisé avec le kit d extraction de l ADN UltraClean. Le kit UltraClean est disponible chez biomérieux (Mo Bio 50 Test Kit référence de catalogue ou Mo Bio 250 Test Kit référence de catalogue ). Nous recommandons de vérifier la qualité de l extraction et l intégrité de l ADN par électrophorèse en gel d agarose. Si un spectrophotomètre est disponible, de meilleurs résultats sont obtenus à partir d ADN génomique purifié avec un A 260 /A 280 = 1,7-1,9. Utiliser 2 µl d ADN génomique à une concentration de 25 à 50 ng/µl dans le protocole rep-pcr. Procédure pour le kit d empreintes d'adn DiversiLab Étape 1 : rep-pcr Préparer un mélange principal 1. Laisser le contenu de la boîte de réactif rep-pcr et le tampon 10X PCR décongeler complètement. 2. Agiter brièvement au vortex et centrifuger chacun des tubes de réactif à x g pendant 3 secondes. 3. Dans un microtube à centrifuger sans nucléase de 1,5 ml, ajouter les volumes suivants de réactifs pour chaque amplification à réaliser : La préparation doit être faite sur de la glace ou dans un plateau de refroidissement PCR. Nous recommandons d ajouter des réactifs équivalents à une réaction supplémentaire tous les 8 à 12 tests à exécuter (pour compenser la perte de volume en cours de pipetage). Les volumes de réactifs fournis sont suffisants à condition qu un minimum de 8 échantillons soit réalisé par préparation. Réactif Volume/Réaction (µl) Nombre de réactions Volume total pour mélange principal (µl) Rep-PCR MM1 18,0 N 18,0 x (N + supplémentaire) Tampon 10X PCR GeneAmp 2,5 N 2,5 x (N + supplémentaire) Primer Mix LL 2,0 N 2,0 x (N + supplémentaire) ADN polymérase AmpliTaq * 0,5 N 0,5 x (N + supplémentaire) Volume total 23,0 N 23,0 x (N + supplémentaire) *LaTaq polymérase doit être le dernier réactif ajouté au mélange principal et doit être conservé au froid en permanence. Aliquoter le mélange principal 1. Préparer un tube PCR sans nucléase pour chaque échantillon et contrôle dans un bloc froid ou de la glace. Étiqueter les tubes en fonction de la feuille de travail. 2. Mélanger soigneusement le contenu du tube de mélange principal. Centrifuger à x g pendant 5 secondes. 3. Aliquoter 23 µl du mélange principal dans le fond de chaque tube PCR Page 2 sur 3

9 Ajouter l ADN aux tubes PCR 1. Ajouter 2 µl d échantillon d ADN (concentration de 25 à 50 ng/µl), de contrôle positif ou contrôle négatif au fond du tube PCR correspondant. Réaliser des cycles d aspiration-refoulement avec la pipette pour mélanger. 2. Boucher fermement les tubes PCR. Tapoter doucement les tubes sur la paillasse pour amener les réactifs au fond. Remettre les tubes dans le bloc froid ou la glace. Étape 2 : Réaliser une amplification rep-pcr 1. Programmer le thermocycleur comme indiqué ci-après. Protocole Rep-PCR - reppcr45 Dénaturation initiale : 94 C 2 min Cycle de répétition : 35 cycles Dénaturation : 94 C 30 s Renaturation : 45 C 30 s Extension : 70 C 90 s Extension finale : 70 C 3 min Pose : 4 C 2. Pour une amplification optimale, interrompre le programme après avoir laissé le thermocycleur chauffer à 94 C pendant la dénaturation initiale. 3. Insérer les tubes PCR dans le thermocycleur préchauffé. Remarque : La température du bloc va s abaisser. 4. Reprendre le programme après que la température du thermocycleur soit revenue à 94 C. 5. Passer directement à l étape de séparation des fragments d ADN avec le dispositif Caliper LabChip, ou bien stocker le produit rep-pcr à 4 C ou -20 C. voir «Mode d emploi des dispositifs LabChip», fourni avec les puces ADN et les fournitures et réactifs puce ADN. Sources d erreur possibles Les cultures microbiennes utilisées doivent être pures. Des cultures mixtes ou contaminées peuvent entraîner des résultats incohérents. La contamination des cultures microbiennes, une lyse incomplète des cellules, une contamination entre réactifs pendant l extraction de l ADN et des fluctuations pendant l amplification rep-pcr peuvent entraîner de mauvais résultats. Références 1. Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5: Versalovic J, Koeuth T, Lupski J Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J Repetitive sequence-based PCR (rep-pcr) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York. Coordonnées des contacts 425 River Road Athens, GA USA Pour toute assistance technique aux États-Unis, contacter le Service clientèle de biomérieux au En dehors des États-Unis, contacter un représentant local de biomérieux. Cet objet, ou son utilisation, est protégé par un ou plusieurs des brevets américains suivants : et Agilent est une marque déposée d Agilent Technologies, Inc. AmpliTaq et GeneAmp sont des marques déposées d Applied Biosystems Corporation aux États-Unis et/ou dans d autres pays. Caliper et LabChip sont des marques déposées de Caliper Life Sciences aux États-Unis et/ou dans d autres pays. DiversiLab est une marque commerciale de biomérieux, Inc. UltraClean est une marque commerciale de Mo Bio Laboratories, Inc. Novembre Page 3 sur 3

10 DiversiLab Staphylococcus Kit Kit di 48 test Numero di catalogo BBCI DL-SA01 ITALIANO biomérieux Non per uso diagnostico Materiali forniti nel kit Reagenti Rep-PCR Condizioni di conservazione: da -10 a -30 C Colore tappo Nome Volume Viola Rep-PCR MM1 864 µl Trasparente Primer Mix LL 100 µl Trasparente Controllo positivo C3 16 µl Trasparente Controllo negativo 16 µl Altri materiali necessari ma non forniti Kit i per l estrazione del DNA batterico (UltraClean Microbial DNA Isolation Kit) Taq DNA polimerasi* (DNA polimerasi AmpliTaq più GeneAmp 10X PCR Buffer [contenente15mm MgCl 2 ] di Applied Biosystems) Termociclatore (GeneAmp PCR System 9600 oppure 9700 di Applied Biosystems) Guanti senza talco, camice da laboratorio e protezione per gli occhi Pipette: da 0,1-10 µl, µl, µl, multicanale o pipette ripetitrici (opzionali) Punte per pipette aerosol resistenti: 0,1-10 µl, µl, µl Provette per microcentrifuga, 1,5 ml Microcentrifuga a velocità variabile Vassoi refrigeranti: da 0,2 ml e 1,5 ml Provette e tappi per PCR: 0,2 ml Vassoio portaprovette post PCR Rack supporto provette da 0,2 ml e 1,5 ml Vortex Uso previsto I kit DNA fingerprinting DiversiLab sono studiati per caratterizzare geneticamente tramite rep-pcr DNA campioni provenienti da coltura microbica pura. Tali kit contengono i reagenti ed i buffer necessari ad avviare le reazioni PCR utilizzando primer rep- PCR a partire da DNA genomico estratto da isolati microbici Introduzione I kit DiversiLab per il fingerprinting del DNA di si basano sulla tecnologia rep-pcr, che utilizza sequenze ripetitive non codificanti disperse nel genoma di tutti i batteri studiati fino ad oggi. 1,2,3 Essenziale per i kit DiversiLab sono i set di primer complementari a tali sequenze ripetitive. Utilizzando tali set di primer per eseguire la PCR, vengonolamplificate le sequenze di DNA tra gli elementi ripetitivi. Pertanto, vengono amplificati simultaneamente diversi frammenti del genoma microbico. Principi del sistema Diversilab Di seguito sono riportati i principali stepeseguiti per originare ilfingerprint del DNA con rep-pcr. Estrazione del DNA da colture microbiche purificate. Registrazione delle informazioni del campione nel software DiversiLab tramite Internet. Esecuzione dell amplificazione rep-pcr. Separazione dei frammenti di DNA utilizzando Agilent 2100 Bioanalyzer. Confronto dei fingerprint utilizzando la funzione di analisi statistica del software DiversiLab. Il presente documento fornisce la procedura specifica da utilizzare per l amplificazione rep-pcr. Consultare anche la Guida utente del software DiversiLab e le Istruzioni per l uso dei dispositivi LabChip. * ATTENZIONE: Questo kit deve essere utilizzato solamente con la DNA polimerasi AmpliTaq, una Taq DNA polimerasi che potrebbe essere protetta da uno o più brevetti, ottenuti da fonti autorizzate e con licenza. Né l offerta di vendita né la vendita del presente kit costituiscono una licenza esplicita o implicita all'uso di AmpliTaq o altri Taq DNA polimerasi. Inoltre, l uso di un termociclatore potrebbe richiedere la licenza ai sensi di eventuali brevetti detenuti da terze parti. Il presente kit deve essere utilizzato solamente con un termociclatore autorizzato e con licenza. L'utente del presente kit ha la responsabilità esclusiva dell'uso dello stesso senza incorrere in violazioni dei brevetti di terze parti. Inoltre, l utente del kit è responsabile per l ottenimento delle licenze da parti diverse dal produttore e dal rivenditore del presente kit. Contattare il Direttore delle licenze di Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com), per informazioni sul rilascio della licenza d uso di AmpliTaq Pagina 1 di 3

11 Istruzioni per l'uso Il kit fornisce una quantità di reagenti sufficiente per il numero di test indicati. Si consiglia di eseguire un controllo positivo ed un controllo negativo per ciascuna rep-pcr eseguita. Non utilizzare i componenti del kit oltre ladata di scadenza stampata sulla confezione. Utilizzare le misure di prevenzione disponibili per evitare contaminazioni e contaminazioni incrociate delle provette PCR e dei reagenti. Tali misure includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo: separazione dello spazio di lavoro riservato alla PCR dalle altre zone del laboratorio, in special modo le zone ove si trattano campioni microbici o prodotti successivi all'amplificazione. Pulizia dello spazio di lavoro con una soluzione di candeggina al 10%, seguita da una soluzione di etanolo al 70%. Cambio frequente dei guanti e utilizzo di camici di laboratorio dedicati rispettivamente alle zone pre-pcr e post-pcr. Maggior separazione possibile tra zone pre-pcr e zone post-pcr. Utilizzo di provette monouso prive di nucleasi e puntali per pipette aerosol resistenti. Limitazioni del test Il kit potrebbe non produrre fingerprint utili con alcuni campioni microbici. Anche se alcune sequenze ripetitive sono state trovate in tutti i batteri studiati ad oggi, è possibile che i primer forniti nel kit non generino fingerprint unici o discriminatori per alcuni ceppi microbici. I risultati ottenuti con l uso del kit DiversiLab potrebbero non essere utili o affidabili se non si segue alla lettera il protocollo fornito o se i risultati sono applicati in maniera non corretta. Il prodotto non è inteso per uso diagnostico. Non utilizzare i risultati dei test per diagnosticare patologie o per curare, alleviare, trattare o prevenire patologie nei pazienti. Raccolta e preparazione dei campioni Una corretta purificazione del DNA genomico è essenziale per la riuscita della rep-pcr. L ottimizzazione del kit è stata eseguita con UltraClean Microbial DNA Isolation Kit. Il kit UltraClean è disponibile da biomérieux (Mo Bio 50 Test Kit n. di catalogo oppure Mo Bio 250 Test Kit n. di catalogo ). Si consiglia di controllare la compattezza dell'estrazione e l'integrità del DNA tramite elettroforesi su gel agarosio. Nel caso fosse disponibile uno spettrofotometro, si osserva che i migliori risultati si ottengono da DNA genomico purificato con A 260 /A 280 = 1,7-1,9. Utilizzare 2 µl di DNA genomico alla concentrazione di ng/µl nel protocollo rep-pcr. Procedura da utilizzare con il DNA fingerprinting kit DiversiLab Operazione 1: preparazione della rep-pcr Preparazione della master mix 1. Lasciare sciogliere completamente il contenuto del contenitore dei reagenti rep-pcr e del buffer 10X PCR. 2. Agitare brevemente su Vortex e centrifugare ciascuna provetta dei reagenti a x g per 3 secondi. 3. Dentro una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml priva di nucleasi, aggiungere le quantità di reagenti indicate in basso per ciascuna amplificazione da eseguire. Eseguire la preparazione su ghiaccio oppure sul vassoio refrigerante per PCR. Si consiglia di aggiungere una quantità di reagente per una reazione supplementare (extra) ogni 8-12 test da eseguire per compensare il volume perduto per pipettamento. I volumi indicati dei reagenti sono sufficienti per un minimo di 8 campioni per preparazione. Reagente Volume/Reazione (µl) Numero di reazioni Volume totale per master mix (µl) Rep-PCR MM1 18,0 N 18,0 x (N + extra) Buffer GeneAmp 10X PCR 2,5 N 2,5 x (N + extra) Primer Mix LL 2,0 N 2,0 x (N + extra) AmpliTaq DNA Polimerasi* 0,5 N 0,5 x (N + extra) Volume totale 23,0 N 23,0 x (N + extra) *Aggiungere Taq come ultimo reagente alla miscela master mantenendola sempre a freddo. Aliquotare la master mix 1. Preparare per ciascun campione e per il controllo una provetta per PCR priva di nucleasi nel blocco freddo o con ghiaccio. Etichettare le provette secondo il foglio di lavoro. 2. Miscelare accuratamente i contenuti della provetta master mix. Centrifugare a x g per 5 secondi. 3. Aliquotare 23 µl di master mix sul fondo di ciascuna provetta PCR Pagina 2 di 3

12 Aggiungere il DNA alle provette PCR. 1. Aggiungere sul fondo della corrispondente provetta PCR 2 µl di DNA campione (concentrazione di ng/µl), il Controllo Positivo o il Controllo Negativo. Pipettare verso l alto e verso il basso diverse volte per miscelare. 2. Tappare bene le provette PCR. Picchiettare delicatamente le provette sul bancone per portare i reagenti sul fondo. Riportare le provette nel blocco freddo o sotto ghiaccio. Operazione 2: esecuzione dell amplificazione rep-pcr. 1. Programmare il ciclizzatore termico come illustrato di seguito. Protocollo Rep-PCR - reppcr45 Denaturazione iniziale: 94 C 2 min Ripetizione ciclo: 35 cicli Denaturazione: 94 C 30 sec Ibridazione: 45 C 30 sec Estensione: 70 C 90 sec Estensione finale: 70 C 3 min Conservazione: 4 C 2. Per ottenere un amplificazione ottimale, mettere in pausa il programma dopo che il termociclatore ha raggiunto i 94 C durante la denaturazione iniziale. 3. Inserire le provette PCR nel termociclatore preriscaldato. Nota: la temperatura del blocco scenderà. 4. Riavviare il programma dopo che la temperatura del ciclizzatore termico è ritornata a 94 C. 5. Passare direttamente alla separazione del DNA con il dispositivo Caliper LabChip oppure conservare i prodotti della rep- PCR a 4 C o - 20 C. Consultare le Istruzioni per l uso dei dispositivi LabChip forniti con i DNA chip e con i reagenti DNA Chip e le forniture. Possibili fonti di errore Utilizzare colture microbiche pure. Colture miscelate o contaminate potrebbero dare luogo a fingerprint incoerenti. La contaminazione di culture microbiche, la lisi incompleta delle cellule, la contaminazione da carry-over dei reagenti utilizzati durante l'estrazione del DNA e le fluttuazioni durante l'amplificazione rep-pcr potrebbero dare luogo a fingerprint assenti o deboli. Riferimenti 1. Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5: Versalovic J, Koeuth T, Lupski J Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J Repetitive sequence-based PCR (rep-pcr) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York. Contatti 425 River Road Athens, GA USA Per l'assistenza tecnica negli USA, rivolgersi al biomérieux Customer Service al numero Al di fuori degli USA, rivolgersi al rappresentante locale biomérieux. Questo prodotto e il suo uso sono coperti da almeno uno dei seguenti brevetti USA: e Agilent è un marchio registrato di Agilent Technologies, Inc. AmpliTaq e GeneAmp sono marchi registrati di Applied Biosystems Corporation negli Stati Uniti e/o in altri paesi. Caliper e LabChip sono marchi registrati di Caliper Life Sciences negli Stati Uniti e/o in altri paesi. DiversiLab è un marchio di biomérieux, Inc. UltraClean è un marchio di Mo Bio Laboratories, Inc. Novembre Pagina 3 di 3

13 DiversiLab Staphylococcus Kit 48 試 験 用 BBCI Catalog Number: DL-SA01 日 本 語 biomérieux 研 究 用 キット 内 容 Rep-PCR 試 薬 貯 法 : -10 ~ -30 C キャップの 色 試 薬 名 容 量 紫 色 Rep-PCR MM1 864 µl 無 色 Primer Mix LL 100 µl 無 色 陽 性 コントロール C3 16 µl 無 色 陰 性 コントロール 16 µl 付 属 していないその 他 の 必 要 器 具 細 菌 DNA 抽 出 キット(UltraClean Microbial DNA Isolation Kit) Taq DNA ポリメラーゼ*(AmpliTaq DNA polymerase plus GeneAmp 10X PCR Buffer [15mM MgCl 2 含 有 ] :Applied Biosystems 社 製 ) サーマルサイクラー(GeneAmp PCR System 9600 または 9700 :Applied Biosystems 社 製 等 ) パウダーフリー 手 袋 実 験 着 保 護 メガネ ピペット: µl, µl, µl, 可 変 式 または 連 続 分 注 ピペット( 任 意 ) エアロゾルバリアーピペットチップ:: µl, µl, µl マイクロ 遠 心 チューブ 1.5mL マイクロ 遠 心 機 可 変 スピード 型 保 冷 トレー:0.2mL および 1.5mL PCR 用 チューブおよびキャップ:0.2mL PCR トレー/リテーナセット 0.2mL および 1.5mL チューブ 立 てラック ボルテックスミキサー 用 途 DiversiLab DNA フィンガープリンティングキットは 純 培 養 微 生 物 をサンプルに 用 い rep-pcr フィンガープリントを 得 るた めに 設 計 されました これらのキットには 微 生 物 分 離 株 から 抽 出 したゲノム DNA と rep-pcr プライマーを 使 った PCR 反 応 のために 必 要 な 試 薬 及 び 緩 衝 液 が 含 まれます はじめに DiversiLab DNA フィンガープリンティングキットには 現 在 までに 研 究 済 みである 全 ての 細 菌 のゲノム 上 に 散 在 して 見 られる 非 コード 反 復 配 列 を 利 用 した rep-pcr 技 術 が 使 われています 1,2,3 DiversiLab キットの 特 徴 は これらの 反 復 配 列 に 相 補 的 な プライマーセットにあります これらのプライマーセット 使 った PCR を 行 うことで 反 復 配 列 間 の 領 域 の DNA 配 列 が 増 幅 さ れます これにより 微 生 物 のゲノムから 多 数 の 断 片 が 同 時 に 増 幅 されます DiversiLab システムの 原 理 Rep-PCR フィンガープリントを 得 るための 主 なステップ: 純 培 養 微 生 物 から DNA を 抽 出 します DiversiLab ソフトウェア(インターネット 環 境 )にサンプル 情 報 を 記 録 します Rep-PCR 増 幅 を 行 います Agilent 2100 Bioanalyzer を 使 って DNA 断 片 を 分 離 します DiversiLab ソフトウェアの 機 能 の 1 つである 統 計 分 析 を 使 ってフィンガープリントの 比 較 を 行 います * ご 注 意 : 本 キットは 許 可 およびライセンスを 受 けたサーマルサイクラーを 用 いた 上 でご 使 用 下 さい 本 キットの 使 用 が 第 三 者 の 特 許 権 を 侵 害 しないことを 請 け 負 う 責 任 は キットをご 使 用 になる 使 用 者 にあります よって 製 造 者 および 販 売 者 以 Page 1 of 4

14 外 の 団 体 から 必 要 なライセンスの 取 得 は 使 用 者 の 責 任 となります AmpliTaq を 使 用 するためのライセンスについての 情 報 は アプライドバイオシステム 社 へお 問 い 合 わせ 下 さい 本 書 では 特 に rep-pcr に 関 連 した 作 業 手 順 を 説 明 しています DiversiLab ソフトウェアユーザーガイドおよび LabChip に 添 付 されている"Instructions for Use of LabChip Devices"を 参 照 してください 使 用 方 法 キットには 規 定 の 使 用 回 数 に 対 する 十 分 量 の 試 薬 が 含 まれています rep-pcr 試 験 を 行 う 際 には 陰 性 および 陽 性 コント ロールを 測 定 することをお 勧 めします 外 箱 に 記 載 されている 有 効 期 限 を 過 ぎた 試 薬 は 使 用 しないでください 下 記 以 外 にも PCR チューブおよび 試 薬 の 汚 染 および 二 次 汚 染 を 避 けるために 可 能 な 予 防 措 置 を 行 ってください 実 験 室 では 特 に 微 生 物 サンプルまたは 増 幅 後 検 体 が 含 まれる 作 業 域 から PCR 作 業 スペースを 隔 離 してください 10%ブリーチで 作 業 スペースを 洗 浄 後 さらに 70%エタノールで 洗 浄 してください 定 期 的 に 手 袋 を 交 換 し PCR 区 域 の 前 後 で 専 用 の 器 具 および 実 験 着 を 使 用 してください 可 能 な 限 り PCR 前 後 のエリアを 分 けてください ヌクレアーゼフリーのディスポーザブルチューブおよびエアロゾル バリアーピペットチップを 使 用 してください 制 限 事 項 このキットでいくつかの 微 生 物 サンプルから 有 用 なフィンガープリントが 得 られないことがあります 現 在 までの 研 究 で 全 ての 細 菌 で 反 復 配 列 が 見 つかっていますが いくつかの 微 生 物 株 では このキットに 供 給 されているプライマーで 固 有 のまたは 識 別 可 能 なフィンガープリントが 得 られないことがあります DiversiLab キットの 操 作 方 法 に 正 確 に 従 っていなかったり 目 的 と 異 なる 適 用 で 用 いた 場 合 得 られた 結 果 が 有 用 でない または 信 頼 性 に 欠 けることがあります この 製 品 は 体 外 診 断 薬 として 使 用 できません そのため 得 られた 結 果 を 患 者 の 診 断 治 療 処 置 予 防 などに 使 用 す ることはできません サンプルの 採 取 及 び 準 備 良 好 な rep-pcr 反 応 を 得 るためには ゲノム DNA の 適 切 な 精 製 が 重 要 です 最 適 なキットは 弊 社 から 販 売 している UltraClean Microbial DNA Isolation Kit です(Mo Bio 50 テストキット( 品 番 )または Mo Bio 250 テストキット ( 品 番 )) アガロースゲル 電 気 泳 動 で DNA 抽 出 の 一 貫 性 および 完 全 性 を 確 認 することをお 勧 めします 分 光 光 度 計 を 使 用 する 場 合 は 精 製 ゲノム DNA が A 260 /A 280 = であると 最 適 な 状 態 です rep-pcr の 操 作 では ゲノム DNA 濃 度 20-50ng/µL を 2µL 使 用 します DiversiLab DNA フィンガープリンティングキットの 操 作 手 順 Step 1: rep-pcr のセットアップ Master mix の 準 備 1. rep-pcr キットに 含 まれる 各 試 薬 および 10XPCR バッファーを 完 全 に 解 凍 します 2. 各 試 薬 を 軽 くボルテックスし 10,000 x g で 3 秒 間 遠 心 分 離 します 3. 増 幅 に 使 用 する 各 試 薬 を 下 記 の 手 順 と 容 量 でヌクレアーゼフリーの 1.5 ml マイクロ 遠 心 チューブに 加 えます: 試 薬 の 準 備 は 必 ず 氷 冷 箱 または PCR クーラートレー 中 で 行 ってください 1 度 に 行 なう 測 定 は 常 に 8-12 テストとし それに 1 反 応 分 を 加 えた 試 薬 を 調 製 することをお 勧 めします(ピペット 操 作 による 試 薬 ロスを 補 正 するため) 各 試 薬 量 は 1 回 のセットアップあたりの 測 定 が 最 低 8 サンプルとした 場 合 に 十 分 な 量 が 供 給 されています 試 薬 容 量 / 反 応 (µl) 反 応 数 Master Mix の 総 容 量 (µl) Rep-PCR MM N 18.0 x (N + extra) GeneAmp 10X PCR Buffer 2.5 N 2.5 x (N + extra) Primer Mix LL 2.0 N 2.0 x (N + extra) AmpliTaq DNA Polymerase* 0.5 N 0.5 x (N + extra) 総 容 量 23.0 N 23.0 x (N + extra) *Taq は 最 後 に master mix に 加 えてください また 随 時 保 冷 するようにしてください Page 2 of 4

15 Master mix の 等 分 1. 氷 中 に 各 サンプルおよびコントロール 用 のヌクレアーゼフリーPCR チューブを 準 備 してください Rep-PCR worksheet に 従 ってチューブにラベルをしてください 2. master mix チューブの 内 容 物 を 完 全 に 混 和 し 10,000 x g で 5 秒 間 遠 心 分 離 します 3. 各 PCR チューブの 底 に master mix を 23 µl ずつ 等 分 します PCR チューブへの DNA の 添 加 1. DNA サンプル ( 濃 度 :25-50 ng/µl), 陽 性 コントロール 陰 性 コントロール 2 µl を 相 当 する PCR チューブの 底 に 加 え ピ ペットで 数 回 吸 引 排 出 を 繰 り 返 して 混 和 します 2. 安 全 のために PCR チューブにキャップをして 静 かにチューブをタップすることで 試 薬 を 底 部 に 集 め 氷 中 に 戻 します Step 2: rep-pcr 増 幅 の 実 施 1. 下 記 の 条 件 でサーマルサイクラーをプログラムします Rep-PCR プロトコール- reppcr45 初 期 変 性 : 94 C 2 min リピートサイクル: 35 cycles 変 性 : 94 C 30 sec アニーリング: 45 C 30 sec 伸 張 : 70 C 90 sec 最 終 伸 張 : 70 C 3 min 保 持 : 4 C 2. 増 幅 を 最 適 化 するために 初 期 変 性 中 にサーマルサイクラーを 94 C に 加 温 しプログラムを 一 時 停 止 にします 3. 加 温 されたサーマルサイクラーに PCR チューブを 挿 入 します Note: ブロックの 温 度 が 低 下 します 4. サーマルサイクラーが 94 C に 戻 った 後 プログラムを 再 開 します 5. Caliper LabChip device で DNA 分 離 を 直 接 続 けて 行 うか 4 C または-20 C で rep-pcr 産 物 を 保 存 します LabChip に 添 付 されている"Instructions for Use of LabChip Devices"を 参 照 してください エラーの 要 因 純 培 養 微 生 物 菌 体 を 必 ず 使 用 してください 混 合 または 汚 染 した 培 養 物 は 矛 盾 したフィンガープリントの 原 因 になりま す 菌 体 培 養 のコンタミネーション 細 胞 の 不 完 全 な 溶 解 DNA 抽 出 に 用 いた 試 薬 の 残 存 rep-pcr 増 幅 中 の 変 動 はフィンガ ープリントが 弱 くなったり 欠 損 する 原 因 となることがあります 参 考 文 献 1. Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5: Versalovic J, Koeuth T, Lupski J Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J Repetitive sequence-based PCR (rep-pcr) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York Page 3 of 4

16 お 問 合 せ シスメックス 株 式 会 社 CS センター 神 戸 市 西 区 室 谷 1 丁 目 3 番 地 の 2 TEL シスメックス ビオメリュー 株 式 会 社 東 京 都 品 川 区 大 崎 一 丁 目 2 番 2 号 大 崎 セントラルタワー8 階 TEL ( 代 表 ) この 説 明 書 およびその 使 用 は 米 国 特 許 番 号 5,523,217 5,691,136 にて 保 護 されています Agilent は Agilent Technologies Inc が 所 有 し 使 用 している 登 録 済 み 商 標 です AmpliTaq および GeneAmp は Applied Biosystems Corporation が 米 国 もしくはまた 米 国 以 外 の 国 で 使 用 している 登 録 済 み 商 標 で す Caliper および LabChip は Caliper Life Sciences が 米 国 もしくはまた 米 国 以 外 の 国 で 使 用 している 登 録 済 み 商 標 です DiversiLab biomérieux, Inc.はの 登 録 商 標 です UltraClean は Mo Bio の 登 録 商 標 です November Page 4 of 4

17 DiversiLab Staphylococcus Kit Embalagem de 48 testes Referência de Catálogo BBCI: DL-SA01 PORTUGUÊS biomérieux Não se Destina à Utilização em Diagnóstico. Materiais fornecidos na embalagem Reagentes Rep-PCR Armazenar entre: -30 e -10 C Cor da Tampa Nome Volume Roxo Rep-PCR MM1 864 µl Incolor Mistura de Primers LL 100 µl Incolor Controlo Positivo C3 16 µl Incolor Controlo Negativo 16 µl Outros materiais necessários, mas não fornecidos Embalagem de extracção de ADN bacteriano (UltraClean Microbial DNA Isolation Kit) Taq ADN polimerase* (AmpliTaq DNA polymerase e GeneAmp 10X PCR Buffer [contendo 15 mm de MgCl 2 ] da Applied Biosystems) Termociclador (GeneAmp PCR System 9600 ou 9700 da Applied Biosystems) Luvas sem pó, bata e protecção ocular Pipetas: Pipeta multicanal ou de repetição de 0,1 10 µl, µl, µl (opcional) Pontas de pipetas com filtro para barreira a aerossóis: 0,1 10 µl, µl, µl Tubos de microcentrifugação, 1,5 ml Microcentrífuga, velocidade variável Suportes de refrigeração: 0,2 ml e 1,5 ml Tubos PCR com tampas: 0,2 ml Conjunto de retenção de tabuleiros PCR Suporte com capacidade para tubos de 0,2 ml e 1,5 ml Vórtex Aplicação As embalagens de fingerprinting de ADN (impressão digital genética) DiversiLab destinam-se a criar fingerprintings de ADN por rep-pcr a partir de culturas puras de amostras microbianas. Estas embalagens contêm os reagentes e tampões necessários para preparar reacções de PCR utilizando primers rep-pcr, começando pelo ADN genómico extraído a partir de isolados microbianos. Introdução As embalagens de fingerprinting DiversiLab utilizam a tecnologia rep-pcr, que tira partido das sequências repetitivas não codificantes espalhadas ao longo dos genomas de todas as bactérias estudadas até à data. 1,2,3 A característica principal da embalagem DiversiLab consiste nos conjuntos de primers que complementam estas sequências repetitivas. Quando a PCR tem lugar utilizando estes conjuntos de primers, as sequências de ADN entre os elementos repetitivos são amplificadas. Assim, verifica-se simultaneamente a amplificação de múltiplos fragmentos em todo o genoma microbiano. Princípio do Sistema DiversiLab As principais etapas envolvidas na criação de fingerprintings de ADN por rep-pcr são descritas em seguida: Extrair o ADN de culturas puras microbianas. Registar as informações das amostras no software DiversiLab (situado na Internet). Realizar uma amplificação por rep-pcr. * AVISO: Esta embalagem só deve ser utilizada com AmpliTaq DNA polymerase, uma Taq ADN polimerase que pode estar coberta por uma ou mais patentes e que tenha sido obtida junto de uma fonte autorizada e licenciada. Nem a oferta de venda, nem a venda desta embalagem nem estas instruções constituem uma licença expressa ou implícita de utilização de AmpliTaq ou outras Taq ADN polimerases. Além disso, a utilização de um termociclador poderá necessitar de uma licença ao abrigo de uma ou mais patentes detidas por terceiros. Esta embalagem só deve ser utilizada com um termociclador autorizado e licenciado. É da exclusiva responsabilidade do utilizador desta embalagem garantir que a utilização da mesma não transgride os direitos das patentes pertencentes a terceiros. Assim, o utilizador desta embalagem é responsável por obter qualquer licença necessária de outras entidades além da do fabricante e vendedor desta embalagem. Para obter informações relativamente à aquisição de licenças de utilização do AmpliTaq deve-se contactar o Director de Licenciamento da Applied Biosystems, Inc. (www.appliedbiosystems.com) Página 1 de 3

18 Separar os fragmentos de ADN utilizando o Agilent 2100 Bioanalyzer. Comparar os fingerprintings utilizando a funcionalidade de análise estatística do software DiversiLab. Este documento fornece o procedimento específico associado à amplificação por rep-pcr. Consultar também o Guia do Utilizador do Software DiversiLab e as Instruções DiversiLab para Utilização dos dispositivos LabChip. Instruções de utilização Esta embalagem contém reagentes suficientes para o número de testes indicado. Recomendamos que seja executado um controlo negativo e um positivo para cada experiência de rep-pcr realizada. Não utilizar os componentes desta embalagem após a data de validade impressa na caixa. Utilizar as medidas de prevenção disponíveis por forma a evitar a contaminação e contaminação cruzada dos tubos de PCR e reagentes, incluindo mas sem se limitar ao seguinte: Separar o espaço de trabalho para PCR de outras áreas do laboratório, especialmente nos casos que envolvem amostras microbianas ou produtos de pós-amplificação. Limpar o espaço de trabalho com lixívia a 10%, seguida de etanol a 70%. Trocar de luvas com frequência e utilizar batas de laboratório e equipamento dedicados para as áreas de pré e pós-pcr. Separar as áreas de pré-pcr e pós-pcr o máximo possível. Utilizar tubos descartáveis sem nuclease e pontas de pipetas com filtro. Limitações do teste Esta embalagem poderá não produzir fingerprintings úteis com algumas amostras microbianas. Embora tenham sido observadas sequências repetitivas em todas as bactérias estudadas até à data, é possível que os primers fornecidos nesta embalagem não criem fingerprintings únicos ou discriminatórios com determinadas estirpes microbianas. Os resultados obtidos a partir da utilização da embalagem DiversiLab poderão não ser úteis ou fiáveis, caso o protocolo fornecido não seja seguido de forma exacta ou se os resultados forem utilizados numa aplicação para a qual não eram destinados. Este produto não se destina a ser utilizado em diagnóstico e os resultados deste teste não devem ser utilizados no diagnóstico de doenças ou para curar, mitigar, tratar ou prevenir a ocorrência de uma doença num doente. Colheita e preparação das amostras Uma purificação adequada do ADN genómico é essencial para se obter uma técnica de rep-pcr bem sucedida. A optimização dos resultados obtidos com esta embalagem foi realizada com UltraClean Microbial DNA Isolation Kit. A embalagem UltraClean está disponível junto da biomérieux (embalagem de 50 testes Mo Bio 50 Test Kit, ref. de catálogo nº , ou embalagem de 250 testes Mo Bio 250 Test Kit, ref. de catálogo nº ). Recomendamos a verificação da consistência de extracção e da integridade do ADN através de electroforese em gel de agarose. Caso esteja disponível um espectrofotómetro, são obtidos melhores resultados a partir de ADN genómico purificado com A 260 /A 280 = 1,7 1,9. Utilizar 2 µl de ADN genómico com uma concentração de ng/µl no protocolo rep-pcr. Procedimento para a utilização da embalagem de fingerprinting de ADN DiversiLab Etapa 1: Preparar a técnica rep-pcr Preparar a mistura principal 1. Aguardar até que o conteúdo da caixa de reagentes de rep-pcr e o tampão 10X PCR descongelem completamente. 2. Colocar no vórtex por breves momentos e centrifugar cada tubo de reagente a x g durante 3 segundos. 3. Num tubo de microcentrifugação de 1,5 ml sem nuclease, adicionar as seguintes quantidades de reagentes para cada procedimento de amplificação a realizar: A preparação tem de ser realizada sobre gelo ou num suporte de refrigeração PCR. Recomendamos a adição de reagentes por forma a equivaler a uma reacção extra para cada 8 a 12 testes a serem executados (para compensar a perda de volume durante a pipetagem). Os volumes de reagentes fornecidos são suficientes desde que sejam realizados, no mínimo, 8 amostras por preparação. Reagente Volume/Reacção (µl) Número de Reacções Volume Total para a Mistura Principal (µl) Rep-PCR MM1 18,0 N 18,0 x (N + extra) GeneAmp 10X PCR Buffer 2,5 N 2,5 x (N + extra) Mistura de Primers LL 2,0 N 2,0 x (N + extra) AmpliTaq DNA Polymerase* 0,5 N 0,5 x (N + extra) Volume Total 23,0 N 23,0 x (N + extra) *Taq deverá ser o último reagente adicionado à mistura principal e deve ser mantido sempre frio Página 2 de 3

19 Obter alíquotas da mistura principal 1. Preparar um tubo PCR sem nucleases para cada amostra e controlo num bloco frio ou em gelo. Rotular os tubos de acordo com a folha de trabalho. 2. Homogeneizar completamente o conteúdo do tubo da mistura principal. Centrifugar a x g durante 5 segundos. 3. Transferir uma alíquota de 23 µl da mistura principal para o fundo de cada tubo PCR. Adicionar ADN aos tubos PCR 1. Adicionar 2 µl de ADN extraído (concentração de ng/µl), de Controlo Positivo ou de Controlo Negativo no fundo do tubo PCR. Pipetar para cima e para baixo várias vezes para misturar. 2. Tapar os tubos PCR de forma segura. Bater ligeiramente com os tubos na bancada para que os reagentes assentem no fundo. Voltar a colocar os tubos no bloco frio ou em gelo. Etapa 2: Realizar a amplificação por rep-pcr 1. Programar o termociclador conforme apresentado em baixo. Protocolo Rep-PCR - reppcr45 Desnaturação inicial: 94 C 2 min Ciclo de repetição: 35 ciclos Desnaturação: 94 C 30 seg Hibridização: 45 C 30 seg Extensão: 70 C 90 seg Extensão final: 70 C 3 min Paragem: 4 C 2. De modo a obter-se uma amplificação óptima, colocar o programa em pausa depois de deixar que o termociclador aqueça até aos 94 C, durante a desnaturação inicial. 3. Inserir os tubos de PCR no termociclador pré-aquecido. Nota: A temperatura do bloco vai descer. 4. Retomar o programa depois da temperatura do termociclador regressar aos 94 C. 5. Prosseguir directamente para a separação de ADN com o dispositivo Caliper LabChip ou armazenar o produto rep-pcr a 4 C ou -20 C. Consultar as Instruções de Utilização dos Dispositivos LabChip, fornecidas com os chips de ADN e Acessórios e Reagentes de Chips de ADN. Possíveis origens de erro Têm de ser utilizadas culturas puras microbianas. A utilização de culturas mistas ou contaminadas poderá resultar em fingerprintings inconsistentes. A contaminação de culturas microbianas, a lise incompleta das células, a contaminação dos reagentes utilizados durante a extracção de ADN e flutuações durante a amplificação por rep-pcr poderão provocar fingerprintings fracos ou ausentes. Referências 1. Versalovic J, Schneider M, de Bruijn F, Lupski J Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell Bio. 5: Versalovic J, Koeuth T, Lupski J Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc. Acids Res. 19(24): Versalovic J, de Bruijn F, Lupski J Repetitive sequence-based PCR (rep-pcr) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In: Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. Chapman & Hall: New York. Informações de contacto 425 River Road Athens, GA USA Para obter assistência técnica nos EUA, contactar o Serviço de Atendimento ao Cliente da biomérieux, através do telefone Fora dos EUA, contactar o representante local da biomérieux. Este produto e a sua utilização estão cobertos por uma ou mais das seguintes patentes nos EUA: e Agilent é uma marca comercial registada da Agilent Technologies, Inc. AmpliTaq e GeneAmp são marcas comerciais registadas da Applied Biosystems Corporation nos Estados Unidos e/ou noutros países. Caliper e LabChip são marcas comerciais registadas da Caliper Life Sciences nos Estados Unidos e/ou noutros países. DiversiLab é uma marca comercial da biomérieux, Inc. UltraClean é uma marca comercial da Mo Bio Laboratories, Inc. Novembro de Página 3 de 3

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