Instruções de Uso Inmunofluor anti-dna

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1 Instruções de Uso Inmunofluor anti-dna Kit de imunofluorescência indireta para a determinação de anticorpos contra o DNA nativo de Crithidia lucillae em soro humano e líquidos biológicos determinações USO DIAGNÓSTICO IN VITRO Fundamentos do método A técnica de anticorpos fluorescentes fundamenta-se na capacidade dos anticorpos de unir-se a determinados corantes fluorescentes sem alterar suas propriedades imunológicas. Isto permitiu desenvolver métodos de testes com grande aplicação no diagnóstico sorológico de diversas doenças. O teste de anticorpos fluorescentes Inmunofluor anti-dna utiliza o método indireto, descrito por Weller e Coons em O procedimento é formado por duas reações. Na primeira etapa, o soro do paciente é colocado em contato com o substrato antigênico. Se os anticorpos estiverem presentes no soro, estes se ligam ao antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo. Se o soro testado não contiver anticorpos dirigidos contra este antígeno em particular, não se formará o complexo antígeno-anticorpo e todos os componentes do soro serão eliminados na etapa de lavagem. Na segunda etapa adiciona-se uma anti-gamaglobulina humana marcada com isotiocianato de fluoresceína. Na segunda etapa, se o complexo antígeno-anticorpo formou-se na primeira etapa, a anti-gamaglobulina marcada fluoresceína adere-se ao mesmo. Poderá ser observada uma reação positiva, com fluorescência verde maçã brilhante, através de um microscópio de fluorescência. Resumo e explicação do teste Os anticorpos contra DNA foram detectados em soros de pacientes portadores de lupus eritematoso sistêmico (LES) e sua relação com esta doença atualmente, são amplamente reconhecidas. A molécula de DNA apresenta múltiplos epítopos e os anticorpos dirigidos contra esta, representam um grupo heterogêneo de imunoglobulinas com várias especificidades. Provavelmente, as maiorias dos anticorpos que reagem com DNA estão dirigidos contra determinantes antigênicos encontrados sobre o DNA de cadeia simples. A detecção de tais anticorpos apresenta uma pequena especificidade diagnóstica: podem estar presentes em várias doenças autoimunes e do tecido conectivo. Em troca, os anticorpos que reagem primariamente ou exclusivamente com epítopos do DNA nativo, cadeia dupla (aqui citados como anti-dsdna), apresentam uma notável associação com o lupus eritematoso sistêmico (LES). Estes anticorpos, provavelmente, são dirigidos contra determinante fosfato-desoxirribose. A utilidade prática do doseamento do anti-dna levou ao desenvolvimento de inúmeras técnicas de doseamento quantitativo. As mais difundidas são os radioimunoensaios em fase líquida, enzimaimunoensaio em fase sólida (ELISA) e a imunofluorescência indireta. As duas primeiras técnicas fornecem resultados reproduzíveis e quantitativos. No entanto, a necessidade de uma preparação definida de uma fonte de DNA de cadeia dupla (radioimunoensaio) e a detecção de anticorpos de baixa avidez com reações cruzadas (ELISA) são desvantagens relativas.

2 A técnica de imunofluorescência indireta, embora os resultados sejam semi-quantitativos, é tecnicamente simples e permite a rápida determinação de uma quantidade boa de amostras. O kit Inmunofluor anti-dna, utiliza o hemoflagelado Crithidia luciliae como fonte do DNA nativo. Este organismo possui uma mitocôndria gigante modificada, o cinetoplasto, o qual contém uma rede concentrada de DNA de cadeia dupla, bem caracterizada, em uma configuração estável (Figura 1). O DNA do cinetoplasto de organismos maduros não está associado com o RNA ou proteínas nucleares. A Crithidia luciliae não é patogênica para os seres humanos e pode ser facilmente mantida em culturas contínuas. Este organismo provêm um substrato simples e conveniente para a detecção de anti-dna por imunofluorescência indireta, evitando a necessidade da purificação química do DNA. Muitos laboratórios confirmaram um alto grau de especificidade clínica e imunológica de anti-dna detectada através deste método. Existem duas indicações principais para o teste anti-dna: 1. Vários estudos clínicos confirmaram um alto grau de especificidade diagnóstica (>95%) destes anticorpos para o LES. A detecção de níveis elevados de anticorpos para DNA nativo é um dos critérios de revisão da Associação Americana de Reumatismo para a classificação de LES. Este teste é também útil em pacientes assintomáticos com teste ANA positivo, já que um anti-dna positivo sugere um LES sub-clínico mesmo na ausência de sintomas clínicos. Um anti-dna positivo através desta técnica foi encontrado em 2% de pacientes com outras desordens e o teste é quase sem exceção negativo em LES induzido por drogas. 2. O doseamento de anti-dna é muito útil no estudo clínico de pacientes com LES, já que permite o monitoramento da resposta dos pacientes à terapia. Existe uma correlação dos níveis estes anticorpos com a atividade clínica da enfermidade e a nefrite ativa. Existem estudos que indicam que títulos elevados de anti-dna através desta técnica estão presentes em cerca de 60% dos pacientes portadores de lupus clinicamente ativo, em 80% os pacientes com nefrite lúpica e em menos que 25% de pacientes com doença inativa. Um pequeno número de pacientes, portanto, podem apresentar títulos elevados de anti-dna durante períodos prolongados de tempo, na ausência de atividade clínica. FIGURA 1 NUCLEO FLAGELO Procedimento KINETOPLASTO 1. Reconstituir o tampão salina fosfato (PBS) e elevar a volume com 1 litro de água destilada. Conservar o tampão reconstituído entre 2-8 C. 2. Preparar uma diluição 1:10 em PBS das amostras desconhecidas. Por exemplo, 10 µl de soro + 0,09 ml de PBS.

3 3. Separar as lâminas necessárias para trabalhar e deixar em temperatura ambiente durante 15 minutos. 4. Cobrir generosamente as áreas reagentes com as amostras diluídas e os controles. 5. Incubar em câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente. 6. Lavar com PBS, em duas etapas de lavagem de cinco minutos cada uma. Colocar as lâminas na jarra de Coplin contendo PBS e agitando suavemente durante as etapas de lavagem. 7. Diluir a anti-gamaglobulina humana marcada com isotiocianato de fluoresceína em PBS, de acordo com o título indicado em o frasco (Por exemplo - Título: 1/100 - Adicionar 0,01 ml de anti-gamaglobulina em 1 ml de PBS). Título: 8. Secar cuidadosamente as bordas laterais externas das lâminas com papel absorvente, mantendo as áreas reagentes úmidas. 9. Cobrir cada área reagente com a diluição de anti-gamaglobulina e incubar em câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente. 10. Repetir as etapas 6 e Cobrir as áreas reagentes com Azul de Evans (optativo). Alguns autores preferem não utilizar o Azul de Evans como contra-corante. Sugere-se testar as duas alternativas. 12. Lavar o excesso de corante com PBS, adicionar o meio de montagem sobre as lâminas e cobrir cuidadosamente a área reagente sem exercer uma pressão excessiva. NOTA: Para obter bons resultados, recomenda-se ler imediatamente no microscópio de fluorescência. Se as lâminas forem conservadas, selar seus bordos para prevenir a secagem do meio de montagem e estocar entre 2-8º C ao abrigo da luz. Instruções de armazenagem Os kits reagentes são estáveis até data de validade marcada na embalagem, não podendo ser utilizados após a mesma. Uma vez aberto, conservar as lâminas a 20 C até o momento de seu uso (evitar congelamentos e descongelamentos excessivos). Conservar o restante do kit reagente entre 2-8ºC. Componentes do kit reagente 1. Lâminas com 5 áreas reagentes cada uma. Cada área reagente contém uma suspensão de Crithidia lucillae. 12 lâminas - Para 60 determinações 6 lâminas - Para 30 determinações

4 2. Anti-gamaglobulina total humana marcada com isotiocianato de fluoresceína. Diluir de acordo com o título. 1 frasco x 0,20 ml - Para 60 determinações 1 frasco x 0,10 ml - Para 30 determinações 3. Tampão salina fosfato (PBS), ph 7,2 ± 0,2. Frasco para reconstituir com 1 litro de água destilada. 4 frascos para 60 determinações 2 frascos para 30 determinações 4. Soro humano controle positivo - 1 frasco x 1 ml. Pronto para uso. 5. Soro humano controle negativo - 1 frasco x 1 ml. Pronto para uso. 6. Meio de montagem (glicerina tamponada com tampão fosfato ph 7,2) - 1 frasco x 5 ml. Pronto para uso. 7. Azul de Evans - 1 frasco x 5 ml. Pronto para uso. 8. Lamínulas 12 - Para 60 determinações 6 - Para 30 determinações Estabilidade dos reagentes reconstituídos O tampão fosfato salino reconstituído é estável até 15 dias, se conservado entre 2-8 C. Para períodos mais prolongados de armazenamento, adicionar 0,1% de azida sódica, para evitar contaminações. Material necessário, mas não fornecido. 1. Água destilada ou deionizada para preparo do PBS 2. Tubos para hemólise (ou semelhantes) e estantes para tubos 3. Pipetas para preparar as diluições 4. Câmara úmida 5. Proveta de 1 litro 6. Jarras de Coplin ou semelhantes 7. Timer de 0 a 60 minutos 8. Microscópio de Fluorescência equipado adequadamente

5 9. Esmalte para unhas para selar as lâminas Coleta das amostras 1. O desempenho ótimo do teste IFI do kit reagente Inmunofluor DNA depende do uso de amostras de soro e de controles frescas. Deve ser evitado o uso de soros hemolisados, lipêmicos ou contaminados. 2. Se o soro for testado em até 3 dias após a coleta, estocar entre 2-8º C. 3.Para períodos de armazenamento mais prolongados, congelar a -20 C. Evitar ciclos de congelamento-descongelamento repetidos das amostras, considerando que isto pode induzir a uma deterioração dos anticorpos. Interpretação dos resultados Critérios de leitura e recomendações 1. É importante distinguir o cinetoplasto, o qual se encontra mais próximo ao flagelo e é menor em dimensão que o núcleo, e também realizar a leitura sobre parasitas que apresentem uma estrutura conservada característica. 2. Uma amostra é considerada como positiva quando a diluição 1/10 apresenta uma fluorescência típica verde maçã brilhante no cinetoplasto, com ou sem coloração do núcleo. 3. Examinar os controles positivo e negativo antes de informar, pois se estes não apresentarem resultados corretos, o teste torna-se inválido e deverá ser repetido. 4. Uma amostra positiva deve ser titulada. Títulos maiores ou iguais a 1:160 são fortemente sugestivos de LES ativo e freqüentemente estão presentes em pacientes com nefrite lúpica ativa. 5. Uma amostra é considerada negativa quando a diluição 1/10 não apresenta coloração específica no cinetoplasto. 6. Uma reação de coloração fluorescente exclusiva sobre o núcleo, não deve considerada positiva. FIGURA 2 IMAGENS POSITIVAS IMAGENS NEGATIVAS ndna (+) ndna ( - ) 7. A coloração fluorescente no extremo de inserção do flagelo cujo significado clínico não esteja elucidado, não deve considerado como positivo.

6 8. Em alguns casos observa-se uma intensa positividade em todo o parasita, o qual não deve considerada como positivo. Gradientes de intensidade de fluorescência A intensidade de fluorescência pode ser semiquantificada de acordo a seguinte norma, estabelecida pelo CDC - "Centro de Controle de Doenças de Atlanta, Georgia. 4 (+) Fluorescência máxima: verde maçã brilhante. 3 (+) Fluorescência verde maçã brilhante luminosa. 2 (+) Fluorescência verde maçã definida clara. 1 (+) Fluorescência verde maçã opaca porém diferenciável. 0 Não fluorescente ou sem fluorescência visível. Titulação Se for realizado um teste semiquantitativo, o resultado informado deverá ser o da última diluição na qual se detecta uma fluorescência verde maçã com uma intensidade 1 (+). Controle de qualidade Devem ser incluídos controles positivos e negativo em cada teste.para que o teste seja validado, deve comprovar-se que os resultados para os controles estão corretos. Origem dos padrões utilizados Fluorescein lsothiocyanate (FITC) Labelled Sheep anti-human lgg (Anti-gamma Chain) for the Demonstration of Specific lgg Antibodies in Human Serum/CLB Amsterdam WHO INTERNATIONAL STANDARD. First International Standard for Anti Double-strained DNA (anti-dsdna)/clb/ Amsterdam WHO. Características do sistema Sensibilidade e especificidade A metodologia usada em este kit (IFI) depende de uma grande variedade de fatores externos que incluem: o tipo de microscópio usado, a intensidade da lâmpada e seu tempo de uso, o sistema de filtros e a aptidão do observador. A sensibilidade diagnóstica dos anticorpos anti-dna é maior que 95% para LES. A detecção de níveis elevados de anticorpos contra DNA nativo é um dos critérios de revisão da Associação Americana de Reumatismo para a classificação de LES. Este teste é também útil, em pacientes assintomáticos com teste ANA positivo, já que um anti-dna positivo sugere LES sub-clínico mesmo na ausência de sintomas clínicos. Um resultado anti-dna positivo através desta técnica foi encontrado em 2% de pacientes portadores de outras desordens e o teste é quase sem exceção negativo em LES induzido por drogas.

7 Foi realizado um estudo comparativo entre o padrão internacional para Anti-dsDNA e o substrato local que compõe o kit Inmunofluor anti-dna. O título para a preparação internacional apresentou resultados dentro da média obtida para diferentes laboratórios informada pelo Central Laboratory of The Netherlands Red Cross Blood-Transfusion. Potência A potência das preparações locais de antigamaglobulina marcada com isotiocianato de fluoresceína foi medida frente ao International Standard Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Labelled Sheep Anti-Human IgG (Anti-Gama Chain) for the Demonstration of Specific IgG Antibodies in Human Serum/CLB, Amsterdam WHO INTERNATIONAL STANDARD. Atividade das antigamaglobulinas lgg FITC local, em comparação com o padrão internacional: 100 IU/ml. Mediante a padronização com o padrão internacional, assegura-se a uniformidade no teste estabelecendo padrões de trabalho internos positivos e negativos, úteis no controle de qualidade da metodologia. Estabilidade Se a temperatura de estocagem for constante, os reagentes contidos no kit reagente são estáveis até a data de validade impressa nos rótulos internos e externos, não podendo ser utilizados após esta data. Precauções 1. Os componentes de soro humano utilizados na preparação dos controles deste kit reagente apresentaram resultados não reagentes para a presença de antígeno de superfície de Hepatite B (HBsAg), anticorpos anti-vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e Hepatite C. Considerando-se que nenhum teste diagnóstico pode oferecer uma segurança absoluta a respeito da ausência dos vírus HIV e Hepatite B ou outros agentes infecciosos, as amostras e os reagentes fabricados com materiais de origem humana devem ser tratados como potencialmente infectantes. 2. Não usar os reagentes contidos no kit reagente após a data de validade impressa na embalagem. 3. Todas as incubações devem ser realizadas em câmara úmida. 4. Devem ser mantidas úmidas as áreas reagentes durante toda a técnica (evitar qualquer técnica de secagem artificial como: secagem ao ar com estufa e/ou secadores). Após as etapas de lavagem, recomenda-se remover o excesso de umidade com papel absorvente; secar apenas nos bordos laterais externos das lâminas, sem secar entre áreas. Cobrir imediatamente, generosamente com a diluição conveniente de antigamaglobulina e/ou com o meio de montagem, de acordo com a etapa correspondente 5. Alguns dos componentes deste kit reagente contém azida sódica como conservante. Há relatos que a azida sódica pode reagir com o chumbo o cobre das tubulações de água formando compostos explosivos. Ao se descartar os reagentes, deixar fluir água em abundância para evitar a formação destas azidas metálicas explosivas.

8 6. Nunca pipetar com a boca ou permitir que amostras de pacientes entrem em contacto com a pele. 7. Todos os materiais usados neste teste, incluindo-se os reagentes, amostras e materiais para limpeza devem ser descartados de maneira que se inativos agentes infecciosos. Recomenda-se utilizar na descontaminação, hipoclorito de sódio a 1%, durante um período de tempo igual ou acima de 30 minutos. 8. Somente para uso diagnóstico in vitro. Limitações do procedimento 1. O usuário do kit reagente deve realizar uma cuidadosa leitura e compreensão destas instruções de uso. O cumprimento exato do protocolo é indispensável para se obter resultados confiáveis. 2. Os valores obtidos com este teste devem ser avaliados pelo médico, considerando o histórico clínico do paciente, os sintomas físicos e clínicos e outros procedimentos diagnósticos. 3. O excesso de lipídeos em soro a testar produz uma reação "filming" (película que recobre a reação específica). Um técnico experiente e treinado tem a capacidade de diferenciar uma reação "filming"" de uma reação específica. 4. A intensidade e reatividade do ponto final de uma reação em técnica de IFI podem ser afetadas pelo microscópio por fluorescência utilizado. Referências Bibliográficas 1) Aarden, L. A., De Groot E.R., and Feltkamp T.E.W. Ann. New York Acad. Sci 254: , lmmunology of DNA. III. Crithidia lucillae, a simple substrate for the determination of anti-dsdna with the immunofluorescence technique. 2) Deegan M. J. Walker S.E. Lovell S.E. Amer. J. Clin Path 69: , ) Perwin H et al. Acta Med. Scand. 203:61-65, ) Pincus T; Schur P.H., Rose J.A. e col. N.Eng.J.Med. 281: , ) Ballou,S.P Clinical aspects of antibodies to DNA. In vivo 1: ) Ballou,S.P., and I. Kushner Anti-native DNA detection be the Crithidia lucillae method. An improved guide to the diagnosis and clinical management of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 22: ) Ballou,S.P., and I. Kushner lmmunochemical characteristics of antibodies to DNA in patients with active systemic lupus erythematosus. Clin. Exp. Immunol. 37: ) Chubick, A.l, R. D. Sontheimer, and J.N. Gilliam An appraisal of tests for native DNA antibodies in conective tissue diseases. Clinical usefulness of Crithidia lucillae assay. Ann. lntern. Med. 89:

9 Fabricado por: Biocientifica S.A. Iturri 232/4 Caixa Postal C1427ADD Buenos Aires - ARGENTINA Distribuído por: Interlab Distribuidora de Produtos Científicos S/A CNPJ: / Fone: (11) "SOMENTE PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO" POTENCIALMENTE INFECTANTE Conservar entre +2 e +8ºC. Para maiores informações, vide Instruções de Uso. Atendimento ao consumidor: Reg. ANVISA N : Revisão Setembro/2004