INSTRUÇÕES DE USO. Inmunofluor CHAGAS

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1 INSTRUÇÕES DE USO Inmunofluor CHAGAS Kit reagente de imunofluorescência indireta para a determinação de anticorpos anti- Trypanosoma cruzi em soro humano e líquidos biológicos determinações USO DIAGNÓSTICO IN VITRO Fundamentos do método A técnica de anticorpos fluorescentes fundamenta-se na capacidade dos anticorpos de unir-se a determinados corantes fluorescentes sem alterar suas propriedades imunológicas. Isto permitiu desenvolver métodos de testes com grande aplicação no diagnóstico sorológico de diversas doenças. O teste de anticorpos fluorescentes Inmunofluor CHAGAS utiliza o método indireto, descrito por Weller e Coons em O procedimento é formado por duas reações. Na primeira etapa, o soro do paciente é colocado em contato com o substrato antigênico. Se os anticorpos estiverem presentes no soro, estes se ligam ao antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo. Se o soro testado não contém anticorpos dirigidos contra este antígeno em particular, não se formará o complexo antígeno-anticorpo e todos os componentes do soro serão eliminados na etapa de lavagem. Na segunda etapa adiciona-se uma anti-gamaglobulina humana marcada com isotiocianato de fluoresceína. Na segunda etapa, se o complexo antígeno-anticorpo formou-se na primeira etapa, a anti-gamaglobulina marcada fluoresceína adere-se ao mesmo. Poderá ser observada uma reação positiva, com fluorescência verde maçã brilhante, através de um microscópio de fluorescência. Resumo e explicação do teste As infecções com Trypanosoma cruzi são comuns no Hemisfério Ocidental, com ampla distribuição geográfica nas zonas rurais do México e das Américas Central e do Sul: em algumas zonas apresenta uma endemicidade elevada. Podem ser diferenciadas três formas da doença de Chagas: doenças agudas, crônicas e doença de Chagas congênita. A doença aguda ocorre em porcentagem mínima de infectados, cerca de 5%, considerando que 95% não apresentam manifestações clínicas ao infectar-se. O quadro agudo aparente caracteriza-se por febre variável, mal-estar geral, linfadenopatia e hepatoesplenomegalia. Pode ocorrer uma reação inflamatória no local da infecção (chagoma), e a mesma persistir por até 8 semanas. O edema unilateral das pálpebras (sinal de Romã) ocorre em uma porcentagem significativa de casos agudos. As manifestações que podem ser uma ameaça à vida do indivíduo podendo causar sua morte, são a miocardite aguda e a meningoencefalite. Dez a vinte anos após a infecção, cerca de 30% dos infectados, tenham ou não tido um quadro agudo, apresentam sequelas crônicas da doença, sendo as mais frequentes as lesões do miocárdio com dilatação cardíaca e arritmia, e alterações digestivas com megaesôfago e megacólon. A infecção congênita pode ser a causa de abortos, de natimortos, de prematuros polisintomáticos com hepatoesplenomegalia, manifestações neurológicas etc, com alta mortalidade ou recém-nascidos normais apresentando alguns sintomas.

2 O diagnóstico na fase aguda é estabelecido pela presença parasitas no sangue por exame direto, por cultivo, por inoculação intracerebral de camundongos lactantes ou através de xenodiagnóstico. A parasitemia é mais intensa durante os episódios febris no princípio da infecção. Em geral, na fase crônica, não se observa a presença de parasitas na circulação sanguínea e o imunodiagnóstico pode ser uma ferramenta muito importante para a confirmação da doença. O imunodiagnóstico fundamenta-se no mínimo em resultados de reações in vitro, como mínimo, realizadas simultaneamente. Recomenda-se que uma de destas reações seja por imunofluorescência indireta (IFI). A prova por imunofluorescência indireta para o diagnóstico da doença de Chagas é extremamente sensível e específica. A sensibilidade do teste na fase aguda é de aproximadamente 70-90% (72% na primeira semana, 90% após um mês) e 100% na fase crônica, tanto na doença sintomática como na assintomática. Foram observadas algumas reações cruzadas com Leishmaniose e malária. O kit reagente Inmunofluor CHAGAS contém todos os reagentes necessários para a detecção precoce da infecção por Trypanosoma cruzi, pela técnica de imunofluorescência indireta. Procedimento 1. Reconstituir o tampão salino fosfato (PBS) por diluição em 1 litro de água destilada. Conservar o tampão reconstituído entre 2-8 C. 2. Preparar as diluições dos soros no PBS - diluição de screening: 1/30; diluições seriadas à metade para uma determinação semi-quantitativa. 3. Retirar o material necessário para trabalhar e deixar 15 minutos à temperatura ambiente. 4. Cobrir generosamente as áreas reagentes com as amostras e os controles diluídos. 5. Incubar na câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente. 6. Lavar com PBS, em duas etapas de lavagem com duração de cinco minutos cada uma. Colocar as lâminas na jarra de Coplin contendo PBS, agitando suavemente durante as etapas de lavagem. 7. Diluir a anti-gamaglobulina total humana marcada com isotiocianato de fluoresceína no PBS, de acordo o título indicado no frasco (Por exemplo, Título: 1/100 - Colocar 0,01 ml de anti-gamaglobulina em 1 ml de PBS). Título: 8. Secar cuidadosamente as bordas laterais externas da lâmina com papel absorvente, mantendo úmidas as áreas reagentes. 9. Cobrir cada área reagente com a diluição de anti-gamaglobulina e incubar no câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente.

3 10. Repetir os passos 6 e Cobrir as áreas reagentes com Azul de Evans durante quatro minutos. 12. Lavar o excesso de corante com PBS, adicionar o meio de montagem sobre as lâminas e cobrir cuidadosamente com a lamínula a área reagente sem exercer uma pressão excessiva. NOTA: Para obter bons resultados, recomenda-se ler imediatamente no microscópio de fluorescência. Se as lâminas forem conservadas, selar suas bordas para prevenir a secagem do meio de montagem e estocar entre 2-8º C ao abrigo da luz. Instruções de armazenagem Os kits reagentes são estáveis até data de validade marcada na embalagem, não podendo ser utilizados após a mesma. Conservar o kit reagente entre 2-8ºC. Componentes do kit reagente 1. Lâminas com 6 áreas reagentes cada uma, sendo 2 áreas para controles e 4 áreas para amostras. Cada área reagente contém suspensão do antígeno Trypanosoma cruzi. 15 lâminas - Para 90 determinações 10 lâminas - Para 60 determinações 05 lâminas - Para 30 determinações 2.Anti-gamaglobulina total humana marcada com isotiocianato de fluoresceína. Diluir de acordo com o título. 1 frasco x 0,20 ml - Para 90 determinações 1 frasco x 0,15 ml - Para 60 determinações 1 frasco x 0,10 ml - Para 30 determinações 3. Tampão salina fosfato(pbs), ph 7,2 ± 0,2. Frasco para reconstituir com 1 litro de água destilada. 4 frascos para 90 determinações 3 frascos para 60 determinações 2 frascos para 30 determinações 4. Soro humano controle positivo - 1 frasco x 1 ml. Pronto para uso. 5. Soro humano controle negativo - 1 frasco x 1 ml. Pronto para uso. 6. Meio de montagem (glicerina tamponada com tampão fosfato ph 7.2) - 1 frasco x 5 ml. Pronto para uso.

4 7. Azul de Evans - 1 frasco x 5 ml. Pronto para uso. 8. Lamínulas 15 - Para 90 determinações 10 - Para 60 determinações 05 - Para 30 determinações Estabilidade dos reagentes reconstituídos O tampão fosfato salino reconstituído é estável até 15 dias, se conservado entre 2-8 C. Para períodos mais prolongados de armazenamento, adicionar 0,1% de azida sódica, para evitar contaminações. Material necessário, mas não fornecido 1. Água destilada ou deionizada para preparo do PBS. 2. Tubos para hemólise (ou semelhantes) e estantes para tubos. 3. Pipetas para preparar as diluições. 4. Câmara úmida. 5. Proveta de 1 litro. 6. Jarras de Coplin ou semelhantes. 7. Timer de 0 a 60 minutos. 8. Microscópio de Fluorescência equipado adequadamente. 9. Esmalte para unhas para selar as lâminas. Coleta das amostras 1. O desempenho ótimo do teste IFI do kit reagente Inmunofluor CHAGAS depende do uso de amostras de soro frescas. Deve ser evitado o uso de soros hemolisados, lipêmicos ou contaminados. 2. Se o soro for testado em até 3 dias após a coleta, estocar entre 2-8º C. 3. Para períodos de armazenamento mais prolongados, congelar a -20 C. Evitar ciclos de congelamento-descongelamento repetidos das amostras, considerando que isto pode induzir a uma deterioração dos anticorpos.

5 4. Ocasionalmente, as amostras podem conter enzimas proteolíticas, as quais digerem o substrato. Em geral, isto ocorre com amostras contaminadas com microrganismos. A inativação por calor a 56 C durante 30 minutos, reduz a atividade enzimática. Interpretação dos resultados Critérios de leitura Critério de positividade: No caso de soros positivos, os Trypanosomas cruzi são observados com uma coloração típica fluorescente verde maçã. A fluorescência é particularmente intensa na membrana e no flagelo do parasita. Critério de negatividade: a) Ausência total de fluorescência. b) Parasitas corados difusamente sem fluorescência de membrana. c) Parasitas apresentando fluorescência no citoplasma e nas estruturas intracitoplasmáticas em forma não homogênea. d) Predomínio da coloração (fundo e antígeno róseos). Gradientes de intensidade de fluorescência A intensidade de fluorescência pode ser semi-quantificada de acordo a seguinte norma, estabelecida pelo CDC - "Centro de Controle de Doenças de Atlanta, Georgia. 4 (+) Fluorescência máxima: verde maçã brilhante. 3 (+) Fluorescência verde maçã brilhante luminosa. 2 (+) Fluorescência verde maçã definida clara. 1 (+) Fluorescência verde maçã opaca porém diferenciável. 0 Não fluorescente ou sem fluorescência visível. Titulação Se for realizada um teste semi-quantitativa, o resultado informado deverá ser o da última diluição na qual se detecta uma fluorescência verde maçã com uma intensidade 1 (+). Controle de qualidade Devem ser incluídos controles positivos e negativo em cada teste. Para que o teste seja validado, deve comprovar-se que os resultados para os controles estão corretos. Características do sistema Sensibilidade e Especificidade A imunofluorescência indireta é o método que permite o diagnóstico imunológico precoce da doença de Chagas, com uma positividade inicial de 72%, que aumenta

6 progressivamente até 100% no quarto mês. A sensibilidade desta técnica na etapa crônica da doença (sintomática ou assintomática) é de 100%. Foi observada uma reatividade cruzada, em uma freqüência muito baixa com a leishmaniose. Potência A potência das preparações locais de anti-gamaglobulina total marcada com isotiocianato de fluoresceína foi medida em relação ao Padrão Internacional "Fluorescein lsothiocyanate (FITC) Labelled Sheep Anti-Human Immunoglobulin for the Demonstration of Antibodies in Human Serum /CLB, Amsterdam /WHO INTERNATIONAL STANDARD. Atividade das anti-gamaglobulinas totais FITC locais, em comparação com o padrão internacional: IU/ml. Através da padronização com o padrão internacional, assegura-se a uniformidade do teste, estabelecendo padrões de trabalho internos positivos e negativos, úteis em controle de qualidade da metodologia. Estabilidade Se a temperatura de estocagem for constante, os reagentes contidos no kit reagente são estáveis até a data de validade impressa nos rótulos internos e externos, não podendo ser utilizados após esta data. Precauções 1. Os componentes de soro humano utilizados na preparação dos controles deste kit reagente apresentaram resultados não reagentes para a presença de antígeno de superfície de Hepatite B (HBsAg), anticorpos anti-vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e Hepatite C. Considerando-se que nenhum teste diagnóstico pode oferecer uma segurança absoluta a respeito da ausência dos vírus HIV e Hepatite B ou outros agentes infecciosos, as amostras e os reagentes fabricados com materiais de origem humana devem ser tratados como potencialmente infectantes. 2. Não usar os reagentes contidos no kit reagente após a data de validade impressa na embalagem. 3. Todas as incubações devem ser realizadas em câmara úmida. 4. Devem ser mantidas úmidas as áreas reagentes durante toda a técnica (evitar qualquer técnica de secagem artificial como: secagem ao ar com estufa e/ou secadores). Após as etapas de lavagem, recomenda-se remover o excesso de umidade com papel absorvente; secar apenas nas bordas laterais externas das lâminas, sem secar entre áreas. Cobrir imediatamente, generosamente com a diluição conveniente de anti-gamaglobulina e/ou com o meio de montagem, de acordo com a etapa correspondente 5. Alguns dos componentes deste kit reagente contém azida sódica como conservante. Há relatos que a azida sódica pode reagir com o chumbo o cobre das tubulações de

7 água formando compostos explosivos. Ao se descartar os reagentes, deixar fluir água em abundância para evitar a formação destas azidas metálicas explosivas. 6. Nunca pipetar com a boca ou permitir que amostras de pacientes entrem em contacto com a pele. 7. Todos os materiais usados neste teste, incluindo-se os reagentes, amostras e materiais para limpeza devem ser descartados de maneira que se inativem os agentes infecciosos. Recomenda-se utilizar na descontaminação, hipoclorito de sódio a 1%, durante um período de tempo igual ou acima de 30 minutos. 8. Somente para uso diagnóstico in vitro. Limitações do procedimento 1. O usuário do kit reagente deve realizar uma cuidadosa leitura e compreensão destas instruções de uso. O cumprimento exato do protocolo é indispensável para se obter resultados confiáveis. 2. Os valores obtidos com este teste devem ser avaliados pelo médico, considerando o histórico clínico do paciente, os sintomas físicos e clínicos e outros procedimentos diagnósticos. 3. O excesso de lipídeos em soro a testar produz uma reação "filming" (película que recobre a reação específica). Um técnico experiente e treinado tem a capacidade de diferenciar uma reação "filming"" de uma reação específica. 4. A intensidade e reatividade do ponto final de uma reação em técnica de IFI podem ser afetadas pelo microscópio por fluorescência utilizado. Referências Bibliográficas 1) American Trypanosomiasis Research (Sc. Pub. Nº 318 Pan-American Health Organization PAHO ,1975). 2) Diagnóstico de laboratorio da enfermedad de Chagas/Anales F.L.I.P. 14: ) Coons A.H. Creech H.J. Jones R.N. et al: The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody (Journal lmmunology 45: , 1942). 4) Carvalho MR, Krieger MA, Almeida E, et al. Chagas' disease diagnosis: evaluation of several tests in blood bank screening. Transfusion 1993; 33: ) Pan AA, Rosenberg GB, Hurley MK, Schock GJH, Chu VP, Aiyappa A. Clinical evaluation of an EIA for the sensitive and specific detection of serum antibody to Trypanosoma cruzi. (Chagas' disease). J. lnfect Dis 1992; 165: ) Schattschneider W, Lopes ER, De Alencar JE, Bienzle U, Feldmeier H. A comparative study of four serological methods for diagnosis of acute and chronic Chagas'disease in Brazilian patients. Trop Geogr Med 1992; 44: ) Ross A, Novoa, Montero D. Comparability and reliability of ELISA, Immunofluorescence, and indirect hemagglutination assays for Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. J lnfect Dis 1993; 168: ) Wison Marianna and Schantz Peter. "Manual of Clinical Microbiology Chapter 67: Nonmorphologic Diagnosis of Parasitic lnfections; pag. 719; 1991.

8 Fabricado por: Biocientifica S.A. Iturri 232/4 Caixa Postal C1427ADD Buenos Aires - ARGENTINA "SOMENTE PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO" POTENCIALMENTE INFECTANTE Conservar entre +2 e +8ºC. Para maiores informações, vide Instruções de Uso. Reg. ANVISA N : Revisão Setembro/2004